史艷偉 米彩鋒 牛麗林 李晶晶

1.平頂山市第一人民院消化內(nèi)科 (河南 平頂山， 467000) 2.鄭州大學

肝纖維化是肝臟對多種因素所致肝損傷的傷口愈合反應，肝臟中活化的成纖維細胞通過分泌細胞外基質(zhì)蛋白，產(chǎn)生纖維性瘢痕，可發(fā)展為肝硬化，是肝硬化早期的可逆階段，如果不及時預防和治療，可能發(fā)展為肝癌和肝衰竭[1,2]。肝纖維化損傷是慢性肝病患者發(fā)病和死亡的主要原因，約占肝癌患者死亡率的50%[3,4]。因此，有效抑制肝纖維化發(fā)生、發(fā)展對肝病患者的臨床治療具有重要意義。青蒿素是從青蒿中分離的一種天然倍半萜烯內(nèi)酯，具有抗瘧、抗血管生成、抗癌和化療增敏等藥理作用[5]。雙氫青蒿素(DHA)是青蒿素的主要活性代謝產(chǎn)物，在抗組織纖維化和抗神經(jīng)元細胞死亡中發(fā)揮作用[6]。目前，DHA應用于肝纖維化的治療研究較少，本研究擬通過建立肝纖維化大鼠模型，探討DHA對大鼠肝纖維化損傷的緩解作用及對Nrf2/HO-1通路的影響，為DHA相關(guān)藥物的研發(fā)和肝纖維化的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠55只，雌鼠27只，雄鼠28只，8周齡，體質(zhì)量240～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25℃，相對濕度55%～65%，亮暗循環(huán)時間比1∶1，自由飲食、飲水，適應性飼養(yǎng)1周。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 藥品、主要試劑和儀器 DHA(HPLC≥98%)購自北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒均購自南京建成科技有限公司；兔抗大鼠核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)抗體、血紅素加氧酶-1(HO-1)抗體、β-actin抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG均購自英國Abcam公司；全自動生化分析儀及配套試劑購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；多功能酶標儀購自美國Molecular Device公司。

1.3 建立大鼠肝纖維化模型[7]45只大鼠實驗前禁食0.5 d，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，消毒后行上腹正中切口，抬高肝臟邊緣，撥開十二指腸，分離膽總管約3 cm，穿刺可抽出膽汁證實，于近肝門和十二指腸處使用2號絲線各結(jié)扎2次，從中間剪斷膽總管。術(shù)后正常飲水、進食，肌肉注射青霉素，1次/d，共3 d預防感染、鼠毛無光澤、皮膚黃染、體質(zhì)量減輕等情況發(fā)生，當肝臟病理觀察顯示存在纖維化表現(xiàn)，提示造模成功。另外10只大鼠僅分離總膽管不進行結(jié)扎作為假手術(shù)組。

1.4 分組及藥物干預 將造模成功的41只大鼠(有4只大鼠在造模過程中死亡)按隨機數(shù)字表法分為模型組(11只)、DHA低劑量組(10只)、DHA中劑量組(10只)、DHA高劑量組(10只)。造模成功24 h后，DHA低、中、高劑量組大鼠分別給予5 mg/kg、15 mg/kg和25 mg/kg DHA(無菌生理鹽水配制)灌胃，1次/d，連續(xù)14 d。假手術(shù)組、模型組大鼠灌胃等量無菌生理鹽水。

1.5 大鼠肝功能檢測 末次給藥后24 h，取各組大鼠腹主動脈血，室溫靜置1 h，3 000 rpm(離心半徑10 cm)離心10 min，取上清液采用全自動生化分析儀及配套試劑檢測樣品中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBil)水平。

1.6 大鼠肝組織生化指標檢測 采血完畢，頸椎脫臼法處死大鼠，無菌解剖取出肝臟，于4℃預冷的生理鹽水中清洗后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?00 mg肝臟組織加900 μl預冷的生理鹽水，使用勻漿器在冰上制作肝組織勻漿，4 000 rpm(離心半徑10 cm)離心10 min，取上清液檢測肝組織勻漿中SOD、GSH-Px和MDA水平。

1.7 HE染色觀察大鼠肝組織病理學變化 取部分肝臟組織，4%多聚甲醛4℃固定24 h，PBS清洗3次，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，組織切片(厚度約5 μm)，二甲苯脫蠟，蘇木素、伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織病理學變化。

1.8 Masson染色觀察大鼠肝纖維化 石蠟切片用二甲苯脫蠟，Bouin液在37℃溫箱中媒染2 h，蒸餾水沖洗至切片上黃色消失，天青石藍染色液、Mayer染色液依次滴染，酸性乙醇分化，麗春紅品紅染色液滴染，蒸餾水漂洗后磷鉬酸溶液處理10 min，苯胺藍染色液染色5 min，弱酸溶液處理，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察拍照。

1.9 Western Blot檢測肝組織Nrf2/HO-1通路蛋白表達水平 取100 mg冷凍肝臟組織，研磨后加RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度，蛋白變性，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，目的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入Nrf-2(1∶500)、HO-1(1∶1 000)，β-actin(1∶1 000)抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次，再加入HRP標記二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，加入ECL化學發(fā)光液發(fā)光，暗室中曝光顯影，實驗重復3次，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量，目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝功能指標檢測結(jié)果 見表1。

表1 各組大鼠肝功能結(jié)果比較

2.2 各組大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性和MDA水平 見表2。

表2 各組大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性和MDA水平比較

2.3 各組大鼠肝臟HE染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞排列有序，形態(tài)規(guī)則；模型組大鼠肝細胞壞死，發(fā)生脂肪變性，排列紊亂，肝細胞間隙有炎性浸潤；DHA低、中、高劑量組大鼠較模型組肝組織損傷明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)均有不同程度恢復，較少肝細胞脂肪變性，炎性浸潤不同程度減輕。見圖1。

圖1 肝臟組織HE染色圖 (HE，×200)A：假手術(shù)組；B：模型組；C：DHA低劑量組；D：DHA中劑量組；E：DHA高劑量組

2.4 各組大鼠肝組織Nrf2/HO-1通路相關(guān)蛋白表達水平 見表3。

表3 各組大鼠肝組織Nrf2、HO-1蛋白表達水平比較

2.5 Masson染色觀察結(jié)果 假手術(shù)組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞索排列整齊，肝竇及匯管區(qū)可見膠原纖維，幾乎無彌漫增生的膠原纖維；模型組大鼠匯管區(qū)周圍膠原纖維明顯增生并向四周延伸，延伸至鄰近肝小葉形成纖維間隔，多數(shù)纖維間隔完全包裹肝細胞團形成假小葉結(jié)構(gòu)；DHA低、中、高劑量組大鼠較模型組大鼠匯管區(qū)周圍膠原纖維增生明顯減輕，纖維間隔變小，假小葉結(jié)構(gòu)不明顯，其中DHA高劑量組大鼠肝臟幾乎未見膠原纖維組織增生及假小葉結(jié)構(gòu)。見圖2。

圖2 各組大鼠肝臟組織Masson染色圖 (HE,×400)A：假手術(shù)組；B：模型組；C：DHA低劑量組；D：DHA中劑量組；E：DHA高劑量組

2.6 各組大鼠肝組織Nrf2/HO-1通路蛋白表達情況 見圖3。

圖3 各組大鼠肝組織Nrf2/HO-1通路相關(guān)蛋白表達圖 A：假手術(shù)組；B：模型組；C：DHA低劑量組；D：DHA中劑量組；E：DHA高劑量組

3 討論

慢性肝損傷的過度修復導致肝纖維化，其特征在于細胞外基質(zhì)蛋白的過度積累，纖維化是一個動態(tài)過程，涉及實質(zhì)細胞(肝細胞)、肝星狀細胞、竇狀內(nèi)皮細胞和浸潤免疫細胞等之間的相互串擾，晚期肝纖維化會導致肝硬化、門靜脈高壓和肝功能衰竭，是肝癌的主要危險因素[8]。抗肝纖維化的機制包括減輕肝臟炎癥反應，抗脂質(zhì)過氧化損傷，抑制肝星狀細胞的激活和增殖，調(diào)節(jié)纖維化因子的合成和分泌以及調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的合成和降解[9]?？垢卫w維化治療首先在于抑制肝纖維化發(fā)展，進而逆轉(zhuǎn)肝纖維化，改善患者肝臟結(jié)構(gòu)和功能，延緩肝硬化失代償期發(fā)生，延長患者生存期等。目前，肝纖維化的臨床治療方法包括病因治療(抗乙型肝炎病毒等)、抗炎治療、免疫調(diào)節(jié)治療、靶向治療、干細胞移植及中藥治療等[10,11]。其中，中草藥可有效抑制肝臟的病理性血管生成和肝纖維化發(fā)生，改善肝臟微循環(huán)，并降低肝硬化患者胃腸道出血等[12]。

青蒿素及其衍生物(如DHA)是我國傳統(tǒng)的抗瘧疾治療劑，藥理學研究表明，其具有抗寄生蟲，抗菌，抗癌和抗纖維化的作用[13]。Huang等[14]研究顯示，DHA通過抑制Nrf2介導的巨噬細胞核因子-κB活化，對脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷發(fā)揮治療作用。Zhang等[15]研究表明，DHA可誘導大鼠纖維化肝中活化的肝星狀細胞發(fā)生衰老、自噬。Zhang B等[16]研究發(fā)現(xiàn)，DHA可以通過抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路調(diào)節(jié)成纖維細胞的增殖與分化從而緩解小鼠腎纖維化。本研究建立大鼠肝纖維化模型，經(jīng)DHA干預后檢測肝纖維化損傷相關(guān)指標顯示，低、中、高劑量DHA治療后大鼠血清ALT、AST、TBil水平降低，肝組織SOD、GSH-Px活性升高，MDA水平降低，肝纖維化損傷程度明顯減輕，提示DHA可減輕肝組織氧化應激損傷，改善肝纖維化大鼠肝功能，對大鼠肝纖維化損傷具有緩解作用。

Nrf2是一種廣泛存在且進化上保守的細胞內(nèi)氧化應激防御分子,正常狀態(tài)下，Nrf2被細胞質(zhì)的Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)隔離并在堿性條件下靶向蛋白酶體降解，在氧化應激的狀態(tài)下，Nrf2從Keap1上解離并轉(zhuǎn)移至細胞核，與Maf蛋白形成異源二聚體，識別抗氧化反應元件(Nrf2靶基因調(diào)節(jié)區(qū)域的增強子序列)，調(diào)控抗氧化相關(guān)基因的表達，提高SOD、GSH-Px的活性，發(fā)揮抗氧化應激作用[17,18]。Li等[19]研究顯示，miR155抑制劑可通過增強Nrf2/HO1信號通路預防線粒體損傷和心肌細胞凋亡，從而改善糖尿病性心肌纖維化。Huai等[20]研究表明，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ通過激活Nrf2/NQO1/HO-1途徑減輕博萊霉素誘導的大鼠實驗性肺纖維化并其降低氧化應激水平。Khadrawy SM等[21]研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞可通過激活Nrf2/HO-1信號通路改善大鼠肝纖維化、炎癥并降低氧化應激水平。本研究結(jié)果顯示，肝纖維化大鼠經(jīng)低、中、高劑量DHA干預后，肝組織Nrf2、HO-1蛋白表達水平升高，提示DHA可以激活Nrf2/HO-1信號通路。

綜上所述，DHA對大鼠肝纖維化損傷具有明顯緩解作用，可激活Nrf2/HO-1信號通路。為DHA相關(guān)藥物的研發(fā)及應用于肝纖維化的臨床治療提供理論支持。