孟祥文，賈曉益，陸志遠(yuǎn)，程芷洛，譚亞楠，張敏

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院，安徽 合肥 230001

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種免疫系統(tǒng)攻擊全身健康細(xì)胞和組織的疾病，免疫系統(tǒng)激活的特點(diǎn)是B細(xì)胞和T細(xì)胞反應(yīng)過度，對自身抗原的免疫耐受性喪失?？贵w產(chǎn)生和缺陷清除、免疫復(fù)合物循環(huán)和組織沉積、補(bǔ)體和細(xì)胞因子激活，都會(huì)導(dǎo)致從輕度疲勞和關(guān)節(jié)疼痛到危及腎臟、中樞神經(jīng)、血液、心臟、角膜等多個(gè)器官組織的多種臨床表現(xiàn)[1-2]，診斷難度較大[3]。目前西醫(yī)治療主要采用非甾體抗炎藥、抗瘧藥、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，往往帶來較嚴(yán)重的不良反應(yīng)[4-5]。

根據(jù)臨床表現(xiàn)，SLE可歸屬中醫(yī)學(xué)“陰陽毒”“紅蝴蝶斑”“溫毒發(fā)斑”等范疇，五臟六腑均可發(fā)生病變，終末期肝腎損害尤為明顯。近年來，中醫(yī)藥在SLE治療中發(fā)揮著重要作用。目前大多認(rèn)為其發(fā)病基礎(chǔ)是先天稟賦不足，故治療以補(bǔ)其不足為主。六味地黃丸由熟地黃、山藥、山萸肉、牡丹皮、茯苓、澤瀉組成，臨床用于治療多種疾病，研究表明其在抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫、降血壓、降血脂、降血糖等方面療效顯著[6-7]。六味地黃丸臨床用于輔助治療SLE可提高療效，降低毒性反應(yīng)[8-11]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探究六味地黃丸治療SLE的作用機(jī)制，并對其核心靶點(diǎn)進(jìn)行深入分析，為相關(guān)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 六味地黃丸活性成分及靶點(diǎn)篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/index.php），分別以熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓為檢索詞，獲取六味地黃丸組方藥物活性成分，以口服利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18為條件進(jìn)行篩選。通過SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）、 本 草 組 鑒（HERB，http://herb.ac.cn/）數(shù)據(jù)庫預(yù)測活性成分靶點(diǎn)，SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫選擇分?jǐn)?shù)>0.1者，結(jié)果取并集，作為六味地黃丸作用靶點(diǎn)。

1.2 基因芯片及其差異分析

從GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲得基因芯片GSE49454，利用R軟件limma包進(jìn)行差異分析，以校正后P<0.05且|logFC|≥0.4為條件篩選差異表達(dá)基因，利用R軟件VennDiagram包繪制六味地黃丸靶點(diǎn)基因與SLE差異表達(dá)基因的韋恩圖。

1.3 GO和KEGG通路富集分析

1.4 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將藥物活性成分、交集靶點(diǎn)及相關(guān)通路導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路可視化網(wǎng)絡(luò)。圖中節(jié)點(diǎn)（node）分別為成分、靶點(diǎn)、通路，邊（edge）表示各節(jié)點(diǎn)間的相互關(guān)系。利用插件CytoNCA分析該網(wǎng)絡(luò)，以獲取六味地黃丸治療SLE的核心成分。

1.5 靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/），物種限定為“Homo sapiens”，設(shè)置置信度>0.4，同時(shí)隱藏離散靶點(diǎn)，得到蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape3.8.2軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，并用插件cytoHubba篩選核心靶點(diǎn)基因。

1.6 核心靶點(diǎn)基因表達(dá)量分析

利用R軟件提取數(shù)據(jù)集中SLE疾病活動(dòng)度（DAI）評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)，參考SLE診療指南[12]，按照SLEDAI評(píng)分將SLE分為輕度活動(dòng)（SLEDAI≤6，Light active）和中重度活動(dòng)（SLEDAI>6，Moderate to severe activity），提取出核心靶點(diǎn)基因在正常和SLE不同分期中的表達(dá)數(shù)據(jù)，并繪制小提琴圖。

1.7 分子對接驗(yàn)證

將藥物活性成分與核心靶點(diǎn)基因進(jìn)行分子對接。利用ChemBio3D Ultra 14.0將所得活性成分的mol2格式文件轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)。利用PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）獲取核心靶點(diǎn)基因的PDB格式文件，利用PyMOL2.4.1軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行去水、加氫操作，再通過AutoDock Vina 1.1.2軟件對藥物活性成分與核心靶點(diǎn)基因進(jìn)行分子對接。

1.8 轉(zhuǎn)錄因子分析

利用TRRUST（https://www.grnpedia.org/trrust/）數(shù)據(jù)庫分析核心靶點(diǎn)基因調(diào)控的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，通過Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建基因-轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)。

1.9 免疫浸潤分析

利用R軟件提取數(shù)據(jù)集中免疫細(xì)胞相關(guān)數(shù)據(jù)，進(jìn)行核心基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 六味地黃丸活性成分及靶點(diǎn)

通過TCMSP共篩選得到六味地黃丸活性成分69個(gè)，其中熟地黃2個(gè)、山茱萸20個(gè)、山藥16個(gè)、澤瀉10個(gè)、牡丹皮11個(gè)、茯苓15個(gè)，其中谷甾醇和豆甾醇為重復(fù)成分。利用SwissTargetPrediction和HERB數(shù)據(jù)庫得到活性成分作用靶點(diǎn)813個(gè)。

2.2 差異基因與交集基因

利用R軟件的limma包進(jìn)行數(shù)據(jù)集GSE49454的差異分析，共得到703個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因442個(gè)、下調(diào)基因261個(gè)（見圖1A）。藥物靶點(diǎn)與差異基因的共同靶點(diǎn)基因共41個(gè)，作為六味地黃丸治療SLE的潛在作用靶點(diǎn)（見圖1B）。41個(gè)靶點(diǎn)基因中，上調(diào)靶點(diǎn)基因31個(gè)、下調(diào)靶點(diǎn)基因10個(gè)（見圖1C）。靶點(diǎn)基因在各樣本中的表達(dá)情況見圖1D。

其中，ΔN(k,h)為與4個(gè)空氣彈簧狀態(tài)有關(guān)的偏差載荷，可通過調(diào)節(jié)空氣彈簧高度調(diào)整閥進(jìn)行調(diào)節(jié)，當(dāng)調(diào)整至零時(shí)即為載荷最平均分配狀態(tài)。

圖1 六味地黃丸治療SLE靶點(diǎn)基因分析

2.3 GO功能和KEGG通路

41個(gè)交集靶點(diǎn)基因GO和KEGG通路富集分析，以P<0.05為條件得到BP條目955個(gè)、CC條目30個(gè)和MF條目106個(gè)，各取前10個(gè)條目，見圖2A。BP主要富集在脂多糖反應(yīng)、細(xì)菌來源分子反應(yīng)、活性氧代謝過程、細(xì)胞因子產(chǎn)生正調(diào)控、活性氧代謝過程正調(diào)控等；CC主要富集在分泌顆粒腔、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、囊泡腔、質(zhì)膜外側(cè)、特定顆粒管腔；MF主要富集在細(xì)胞因子受體結(jié)合、肝素結(jié)合、腫瘤壞死因子受體結(jié)合、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性、糖胺聚糖結(jié)合。根據(jù)P<0.05篩選出53條KEGG通路，前10條通路見圖2B。KEGG通路主要富集在甲型流感、弓形體病、乙型肝炎、卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、NOD樣受體信號(hào)通路、中性粒細(xì)胞胞外陷阱形成等。

圖2 六味地黃丸治療SLE靶點(diǎn)基因GO和KEGG通路富集分析

2.4 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape3.8.2軟件對六味地黃丸治療SLE的活性成分、交集靶點(diǎn)及相關(guān)通路構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)，活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)見圖3（圖中編號(hào)對應(yīng)的活性成分見本文OSID碼）。利用CytoNCA插件對該網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行度值分析，結(jié)果度值>9的活性成分分別為槲皮素、山柰酚、海風(fēng)藤酮、玉蘭脂素B和羥基芫花素，其度值分別為18、12、10、10、10。這些成分可能在六味地黃丸治療SLE中發(fā)揮重要作用，故作為核心成分。

圖3 六味地黃丸治療SLE活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

2.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

將41個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖4。網(wǎng)絡(luò)中包含38個(gè)節(jié)點(diǎn)、116條邊。利用cytoHubba插件進(jìn)行分析，按度值降序排列，將前5位靶點(diǎn)基因作為核心靶點(diǎn)基因，分別為TLR4、CCL2、PTPRC、CXCL10、MPO。

圖4 六味地黃丸治療SLE靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)基因

2.6 核心靶點(diǎn)基因表達(dá)量

提取數(shù)據(jù)集中的SLEDAI評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)，按SLEDAI評(píng)分對SLE樣本進(jìn)行劃分，核心靶點(diǎn)基因在正常、非活動(dòng)期、活動(dòng)期的表達(dá)情況見圖5。正常與SLE患者比較，TLR4、CCL2、PTPRC、CXCL10和MPO表達(dá)均有顯著差異；非活動(dòng)期與活動(dòng)期比較，PTPRC表達(dá)存在顯著差異。

圖5 六味地黃丸治療SLE核心靶點(diǎn)基因在不同時(shí)期表達(dá)的小提琴圖

2.7 分子對接結(jié)果

通過分子對接分析核心靶點(diǎn)與核心成分的對接能力，結(jié)合能<-1.2 kcal/mol認(rèn)為具有對接能力。5個(gè)核心成分（槲皮素、山柰酚、海風(fēng)藤酮、玉蘭脂素B、羥基芫花素）與5個(gè)核心靶點(diǎn)（TLR4、CCL2、PTPRC、CXCL10、MPO）分子對接結(jié)果見表1，各成分與靶點(diǎn)均有較好的親和力。槲皮素與靶點(diǎn)對接模式見圖6。

圖6 六味地黃丸治療SLE主要核心成分與核心靶點(diǎn)分子對接模式

表1 六味地黃丸核心成分與核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)合能（kcal/mol）

2.8 轉(zhuǎn)錄因子分析

為探究核心靶點(diǎn)基因的下游調(diào)節(jié)機(jī)制，對靶點(diǎn)基因的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分析，結(jié)果有4個(gè)核心靶點(diǎn)基因與6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子有相關(guān)作用（見圖7A），其中轉(zhuǎn)錄因子SPI1、STAT1和NFKB1表達(dá)量有顯著差異（見圖7B）。

圖7 六味地黃丸治療SLE核心靶點(diǎn)基因-轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)

2.9 免疫浸潤分析

提取SLE患者免疫細(xì)胞相關(guān)數(shù)據(jù)，將SLE患者按核心基因分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析不同組間的免疫細(xì)胞數(shù)量差異。結(jié)果顯示，TLR4表達(dá)與CD4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和B細(xì)胞數(shù)量變化相關(guān)，CCL2表達(dá)與中性粒細(xì)胞數(shù)量變化相關(guān)，CXCL10表達(dá)與中性粒細(xì)胞、血小板和NK細(xì)胞數(shù)量變化相關(guān)，MPO表達(dá)與中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)量變化相關(guān)，見圖8。

圖8 六味地黃丸治療SLE核心靶點(diǎn)基因免疫浸潤分析

3 討論

本研究采用生物信息學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討具有作用多靶點(diǎn)、多通路的復(fù)雜中藥復(fù)方六味地黃丸與SLE之間的關(guān)系?；诔煞?靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)六味地黃丸抗SLE的主要活性成分為槲皮素和山柰酚。槲皮素是有效的抗氧化劑和抗炎分子[13]，可有效保護(hù)SLE小鼠腎臟功能，改善其免疫功能，其可能機(jī)制是下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β1、單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)[14]。Li等[15]研究表明，槲皮素可以防止SLE模型小鼠狼瘡腎炎的發(fā)生，并降低免疫細(xì)胞活化。山柰酚對炎性疾病如SLE和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎均有明確的治療效果[16]。這表明六味地黃丸治療SLE的過程中發(fā)揮重要作用的可能是其中的黃酮類化合物。

KEGG通路富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NOD樣受體信號(hào)通路與核心靶點(diǎn)密切相關(guān)。NOD樣受體即NLRs家族，有研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者PBMC中NLRP3/NLRP1炎性小體的表達(dá)顯著下調(diào)[17]。油橄欖苦苷及其?；苌锟赏ㄟ^NLRP3途徑改善SLE小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[18]。褪黑激素通過抑制NLRP3炎癥信號(hào)通路的激活，可恢復(fù)氧化應(yīng)激和炎癥的形態(tài)學(xué)和衰減，從而減弱由前列腺素誘導(dǎo)的狼瘡腎炎[19]。Yu等[20]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌暴露增加了單核細(xì)胞中NOD2表達(dá)，從而導(dǎo)致外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，加重SLE病情。

通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用cytoHubba插件篩選出六味地黃丸治療SLE的核心靶點(diǎn)基因TLR4、CCL2、CXCL10、MPO和PTPRC，這些靶點(diǎn)基因與SLE關(guān)系密切。MicroRNA16可與DEC2直接結(jié)合，抑制TLR4信號(hào)通路，抑制狼瘡性腎炎腎組織增生和系膜細(xì)胞增殖。CCL2是治療SLE的重要靶點(diǎn)[21]。維生素D可通過降低CXCL10在SLE中的表達(dá)，改善內(nèi)皮功能障礙，恢復(fù)髓系血管生成細(xì)胞功能[22]。泛素化MPO對SLE患者CD4+T淋巴細(xì)胞再激活有不同程度的誘導(dǎo)作用[23]。有研究表明，SLE患者中PTPRC含量明顯低于健康對照[24]。本研究通過對核心靶點(diǎn)基因的免疫分析發(fā)現(xiàn)，這些基因與諸多免疫細(xì)胞相關(guān)聯(lián)。TLR4在先天免疫中起著基本作用并介導(dǎo)產(chǎn)生有效免疫所必需的細(xì)胞因子。CCL2和CCL7的抗體中和可顯著降低脂多糖誘導(dǎo)的總白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞積累[25]。EZH2通過抑制CXCL10表達(dá)抑制NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫[26]。MPO與中性粒細(xì)胞關(guān)系密切。PTPRC編碼的PTP蛋白是T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)因子。提示上述核心靶點(diǎn)基因與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)。核心靶點(diǎn)基因和轉(zhuǎn)錄因子關(guān)聯(lián)分析中SPI1、STAT1和NFKB1表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明六味地黃丸可能通過作用于核心靶點(diǎn)引起下游轉(zhuǎn)錄因子的變化，進(jìn)而調(diào)控免疫細(xì)胞的功能，發(fā)揮治療SLE的作用。

綜上，本研究表明六味地黃丸通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療SLE，可為相關(guān)研究提供思路與理論基礎(chǔ)，后續(xù)仍需進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。