龔汶，趙寧寧，祁月英

(河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061000)

審因論治是中醫(yī)治療策略的重要組成部分，幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)是臨床胃炎、消化性潰瘍、胃癌等疾病的重要病因。經(jīng)過30余年的努力，中醫(yī)在治療Hp方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，也開展了很多基礎(chǔ)及臨床方面的研究。左金丸出自《丹溪心法》，由黃連、吳茱萸按照6∶1的比例組成，辛開苦降、寒熱并用，可清熱瀉火，降逆止嘔，是臨床常用方劑，也是臨床治Hp感染使用頻率較高的方劑；體外、體內(nèi)研究均提示左金丸有很強(qiáng)的抑殺Hp的作用。本文綜述左金丸治療Hp的基礎(chǔ)、臨床及機(jī)制研究，為其在治療Hp的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 Hp感染與脾胃濕熱證

中醫(yī)無Hp的概念，臨床研究發(fā)現(xiàn)Hp感染者中濕熱體質(zhì)占比最多[1]。辛辣飲食及肥甘厚味是脾胃濕熱證的原因，Hp可通過飲食傳染，與生冷飲食相關(guān)性大；從臨床表現(xiàn)看，Hp感染者存在口臭、腹脹、腹痛等癥狀，癥狀多反復(fù)發(fā)作，而中醫(yī)脾胃濕熱證患者亦可見上述癥狀，舌紅苔黃膩，病程長(zhǎng)，纏綿難愈，二者極其相似。Hp感染患者脾胃濕熱證居多[2]，約90%的脾胃濕熱證患者存在Hp感染[3]，清熱利濕、清熱解毒是Hp治療中使用頻率較高的治法，黃連等清熱解毒藥物使用頻率也很高[4]，脾胃濕熱證Hp感染者13碳呼氣試驗(yàn)DOB值多大于35[5]，因而Hp與中醫(yī)脾胃濕熱相關(guān)性非常大。濕熱是中醫(yī)胃腸疾病的重要病因，已經(jīng)有研究提示腸道濕熱與腸道微生態(tài)密切相關(guān)[6]；脾胃濕熱是胃病的重要病因及證型，某種程度上反映胃部微生態(tài)變化；Hp感染引起慢性胃炎患者口腔牙菌斑、舌苔中存在Hp，是胃部感染的重要來源[7]，Hp感染引起慢性胃炎患者多表現(xiàn)為黃苔，口腔Hp可能與梭菌共聚存在[8]；Hp在胃部定植是否也與梭菌共聚存在目前無相關(guān)研究。有研究提示芽孢桿菌僅存在于慢性胃炎患者的黃色舌苔中，慢性胃炎患者舌苔與胃液中存在大量簡(jiǎn)明彎曲桿菌與胃癌前病變相關(guān)[9]。所以，脾胃濕熱證能更多反映胃部微生態(tài)狀態(tài)，包括Hp感染，但不僅限于Hp。我們對(duì)胃部微生態(tài)的認(rèn)識(shí)仍然有限，Hp只是目前研究明確的致病菌，Hp在人體胃部定植后通過不同機(jī)制引起胃部一系列炎癥變化，可導(dǎo)致非萎縮性胃炎、萎縮性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等不同的臨床疾病，患者也多因胃脘脹痛等消化不良癥狀就診。而大多數(shù)Hp感染者可無癥狀，只能依靠呼氣試驗(yàn)等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)。臨床中可借鑒仝小林院士[10]的“靶態(tài)因果”診療模式，將呼氣試驗(yàn)檢測(cè)值視為脾胃濕熱證的微生態(tài)標(biāo)靶，其結(jié)果高低可反映脾胃濕熱程度，這樣便將70%無癥狀Hp感染者也納入中醫(yī)治療體系，這種認(rèn)識(shí)既有利于我們?cè)谇鍩崂麧耦愃幬镏泻Y選Hp敏感藥物，也可以借鑒實(shí)驗(yàn)研究及藥理實(shí)驗(yàn)成果尋找靶藥回歸臨床。

2 左金丸抑制Hp研究

2.1 左金丸及黃連、吳茱萸抑制Hp的體外研究

多篇文章[11-22]報(bào)道了Hp敏感中藥的篩選，主要是體外抑菌實(shí)驗(yàn)，多采用(K-B紙片或海綿或打孔瓊脂)擴(kuò)散法和稀釋法分別研究中藥對(duì)Hp的抑菌圈及最低抑菌濃度(MIC)，其中黃連(生藥濃度1 g/mL)抑菌圈直徑在25～50 mm范圍，MIC在0.015 62～25 mg/mL范圍，歸屬于高敏感藥物，抑菌圈及MIC不同可能與黃連有效成分提取方式(水煎、乙醇提取、水煎后乙醇提取等)不同有關(guān)，也與Hp菌株不同有關(guān)[22]。有研究[11]比較了黃連與相同含量的小檗堿針對(duì)Hp的抑菌圈及MIC，黃連抑制Hp作用強(qiáng)于小檗堿，所以小檗堿是黃連抑制Hp的主要成分，巴馬汀等生物堿也有協(xié)同作用。體外研究吳茱萸水煎劑抑菌圈大小，將其歸屬于中度敏感藥物[23]，但張?jiān)屏醄24]研究吳茱萸乙醇提取物發(fā)現(xiàn)相同濃度下吳茱萸抑菌圈(55.24 mm)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于黃連(35.23 mm)，該研究進(jìn)一步揭示了吳茱萸抗Hp有效成份是吳茱萸次堿、檸檬苦素及4種喹諾酮類生物堿。吳玉梅等[25]采用紙片擴(kuò)散法研究黃連、吳茱萸及其不同配比的乙醇提取物對(duì)Hp的抑菌圈大小，黃連和吳茱萸6∶1(左金丸)抑菌圈最大。周紅祖等[26]采用瓊脂稀釋法研究黃連、吳茱萸及其不同配比的配方顆粒及水煎液對(duì)Hp的MIC的影響，其中左金丸抑制Hp作用最強(qiáng)，其效果共煎液明顯優(yōu)于配方顆粒，左金丸MIC范圍為0.2～3.125 mg/mL[27]。這些研究為左金丸治療Hp感染提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2.2 左金丸治療Hp的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

余惠旻等[27]將Hp感染小鼠分為左金丸高劑量組5.794 88 g/(kg·d)、中劑量組2.897 44 g/(kg·d)、低劑量組1.448 72 g/(kg·d)，連續(xù)8周灌胃給藥，結(jié)果3組Hp清除率分別為80%、30%、50%，與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，高劑量組小鼠胃小凹見少量Hp。左金丸對(duì)小鼠體內(nèi)Hp抑制作用呈劑量相關(guān)性，為左金丸治療Hp臨床研究提供基礎(chǔ)，更為左金丸臨床選量提供了依據(jù)，但此實(shí)驗(yàn)中劑量組清除率反而低于低劑量組，應(yīng)增加樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。按照動(dòng)物與人體每公斤體重劑量折算，一個(gè)60 kg成人左金丸高劑量相當(dāng)于左金丸生藥38.5 g(黃連33 g,吳茱萸5.5 g)，中劑量相當(dāng)于生藥19.12 g(黃連18 g,吳茱萸3 g)，低劑量相當(dāng)于生藥9.56 g(黃連9 g,吳茱萸1.5 g)，按照ITT分析根除率小于80%為不可接受，所以臨床研究應(yīng)優(yōu)先選擇高劑量左金丸[28]。小鼠實(shí)驗(yàn)還可進(jìn)一步研究左金丸治療Hp的劑量閾和治療窗，準(zhǔn)確的量效劑量范圍、中位劑量、閾劑量等參數(shù)及繪制療效曲線將極大的促進(jìn)左金丸治療Hp的臨床研究及臨床應(yīng)用[29]。

2.3 左金丸治療Hp臨床研究

以“左金”為關(guān)鍵詞可檢索出很多文獻(xiàn)，但多為左金加味方或聯(lián)合三聯(lián)、四聯(lián)藥物使用，很少單獨(dú)使用左金丸治療Hp感染。左金加味方或合方中，中藥9～13味，治療總劑量在90～117 g，但黃連、吳茱萸用量均很小[30-32]。陸永才給予Hp感染者左金丸6 g口服,2次/日，相當(dāng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的低劑量，療程14日，停藥4周后復(fù)查胃鏡活檢染色評(píng)估療效，根除率64.7%[33]。《傷寒論》《金匱要略》中黃連日用量范圍為13.8～55.2 g[34]，近現(xiàn)代醫(yī)家黃連日用量在1～120 g不等[35]，仝小林院士[36]認(rèn)為黃連可清熱燥濕調(diào)菌群，用量多為15～30 g，因而高劑量左金丸中黃連用量符合中醫(yī)臨床實(shí)踐，左金丸中配伍辛溫的吳茱萸，既能佐制黃連苦寒傷胃，又能提高臨床療效，可以開展高劑量左金丸治療Hp的臨床研究；減少藥味、增加用量的精方策略也有利于左金丸治療Hp機(jī)制的探索[37]。

3 左金丸有效成分及體內(nèi)代謝研究

錢平等[38]分析左金丸的乙醇提取物，新發(fā)現(xiàn)6種生物堿、4種檸檬苦素類化合物，分別來源于黃連、吳茱萸，說明左金丸助溶或轉(zhuǎn)化促進(jìn)了這些物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，這也就是左金丸抑制Hp強(qiáng)于黃連、吳茱萸單藥的原因。多項(xiàng)研究[39-40]提示黃連經(jīng)吳茱萸炮制或黃連吳茱萸配伍后，黃連代表成份小檗堿含量下降了，這也部分解釋了王怡薇等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，吳茱萸抑制黃連抗Hp代表成份巴馬汀、小檗堿的吸收，該實(shí)驗(yàn)還證實(shí)黃連吳茱萸能夠相互促進(jìn)各自有效成份的肝臟攝取，這與黃雪君等的研究結(jié)果基本一致，不同配比的黃連吳茱萸，以左金丸中黃連吳茱萸有效成份吸收效果最好，藥物吸收部位可能在小腸[41]。涂瑤生等[42]研究提示左金丸在各個(gè)腸段均能吸收，空回腸更易吸收。王怡薇等[43]研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸能夠抑制黃連抗Hp代表成份巴馬汀、小檗堿的膽汁排泄，黃連能夠抑制吳茱萸中具有抑制Hp作用的代表成份吳茱萸次堿的膽汁排泄。高崇佳[44]研究了不同配伍黃連、吳茱萸灌胃后有效成份在小鼠全身組織均有分布，但胃腸組織分布量多，其中左金丸有效成分胃中分布濃度高。這些基礎(chǔ)研究使我們對(duì)左金丸的藥物代謝有了更多認(rèn)識(shí)，也為我們理解、探索左金丸治療Hp機(jī)制提供了幫助。

4 左金丸治療Hp的機(jī)制研究

文獻(xiàn)報(bào)道黃連具有抑制細(xì)菌DNA與蛋白合成、破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)、干擾細(xì)菌代謝等機(jī)制抑制Hp；吳茱萸可通過抑制Hp呼吸作用發(fā)揮抗Hp作用[45]。左金丸及黃連、吳茱萸還可通過多種途徑抑殺Hp。

4.1 抑制尿素酶活性

Hp能產(chǎn)生活性很強(qiáng)的尿素酶，尿素酶水解尿素可產(chǎn)生氨和碳酸，氨可以中和胃酸，這為Hp提供接近中性的環(huán)境，有利于Hp在胃部的定植與生存；碳酸可清除Hp的殺菌效應(yīng)物，有利于Hp的生存。而氨與水平衡后產(chǎn)生氫氧化氨，可直接損害組織，尿素酶也是Hp的重要抗原，可通過激活細(xì)胞免疫、趨化作用、中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)作用等多種機(jī)制導(dǎo)致胃黏膜炎癥損傷。Hp感染引起的病理變化及胃十二指腸疾病與尿素酶密切相關(guān)[46]。談麗華研究發(fā)現(xiàn)黃連的主要成分小檗堿、藥根堿、巴馬汀、表小檗堿、黃連堿均有抑制Hp及Hp尿素酶的作用，其中表小檗堿作用于巰基活性基團(tuán)，抑制尿素酶活性最強(qiáng)，黃連堿還可以作用于鎳離子從而抑制尿素酶，不同生物堿可抑制尿素酶的不同活性位點(diǎn)，其作用機(jī)制可互補(bǔ)增效，抑制尿素酶活性是黃連抑制Hp的重要機(jī)制，但黃連堿、小檗堿抑制Hp作用最強(qiáng)，這也提示黃連抑制Hp存在其它機(jī)制[47]。吳茱萸、左金丸對(duì)Hp尿素酶的影響目前尚無研究，但左金丸以黃連為主藥，可以推測(cè)抑制尿素酶活性是左金丸抑制殺滅Hp的重要機(jī)制之一。

4.2 抑制生物膜合成

在機(jī)體內(nèi)外，Hp均能形成生物膜，Hp以生物膜狀態(tài)與浮游狀態(tài)存在，生物膜狀態(tài)存在的Hp對(duì)抗生素的耐受性是浮游狀態(tài)的1 000倍[48-50]。Hp生物膜是由Hp分泌的胞外多糖基質(zhì)(EPS)黏附形成排列緊密的細(xì)菌體，由蛋白質(zhì)、糖類成分及胞外DNA組成。生物膜是由基因與環(huán)境共同決定的，具有特定結(jié)構(gòu)與功能協(xié)調(diào)性的動(dòng)態(tài)生態(tài)系統(tǒng)，可以通過密度感應(yīng)系統(tǒng)傳遞信號(hào)以適應(yīng)環(huán)境、提高生存能力。Hp生物膜周圍可形成抗原抗體復(fù)合物，造成機(jī)體持續(xù)慢性炎癥。生物膜是形成Hp慢性感染的重要原因，也是產(chǎn)生耐藥的重要原因，其具體機(jī)制有：①EPS的物理屏障作用使人體吞噬細(xì)胞無法殺滅生物膜內(nèi)Hp；②EPS可吸附部分抗菌藥物，也可水解滅活抗菌藥物；③因?yàn)槿狈I(yíng)養(yǎng)與氧氣，Hp生物膜深層菌常處于休眠狀態(tài)，對(duì)抗生素不敏感，停藥以后深層Hp繁殖可形成新的生物膜產(chǎn)生抗生素耐藥；④Hp生物膜常包涵多個(gè)菌株，不同菌株之間可進(jìn)行基因傳遞，使下一代Hp有更強(qiáng)的毒性及生存能力；⑤Hp生物膜內(nèi)外排泵表達(dá)升高也是Hp耐藥的重要機(jī)制[51]。黃衍強(qiáng)體外研究發(fā)現(xiàn)黃連的主要成分小檗堿對(duì)耐藥Hp有抑制作用，在小于50% MIC時(shí)仍能明顯抑制生物膜的形成，可能與小檗堿引起Hp多糖分泌減少有關(guān)[52]。我們推測(cè)以黃連為主藥的左金丸也可抑制Hp生物膜，但目前尚無相關(guān)研究報(bào)告。

4.3 調(diào)節(jié)胃部菌群

普通人胃部存在眾多細(xì)菌，并形成了胃部微生態(tài)，其優(yōu)勢(shì)菌門為放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門，優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈球菌屬[53]，魏舒純等[54]復(fù)習(xí)了國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)指出，作為胃部微生態(tài)的一部分，Hp感染會(huì)影響胃部微生態(tài)，胃部微生態(tài)也會(huì)影響Hp；輕型鏈球菌可誘導(dǎo)Hp球變，抑制其生長(zhǎng)，乳酸桿菌也能抑制Hp。崔祥等研究提示黃連水煎提取物可在體外抑制腸桿菌、腸球菌生長(zhǎng)，而對(duì)乳酸菌、雙歧桿菌有促進(jìn)作用，該效應(yīng)與藥物濃度正相關(guān)[55]；顧寧寧等[56]的小鼠實(shí)驗(yàn)也證實(shí)黃連水煎提取物可多維度調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，抑制有害菌，同時(shí)促進(jìn)有益菌。蔡銳等研究Hp感染小鼠胃內(nèi)菌群，發(fā)現(xiàn)經(jīng)戊己丸(黃連、吳茱萸、芍藥)治療，小鼠胃內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌菌群數(shù)量顯著增加[57]，左金丸不但可以直接抑殺Hp，還可通過調(diào)節(jié)胃內(nèi)微生態(tài)間接抑殺Hp，其機(jī)制是益生菌代謝產(chǎn)生的抗細(xì)菌物質(zhì)如過氧化氫、有機(jī)酸、細(xì)菌素等可抑制Hp的代謝生長(zhǎng)或毒素產(chǎn)生，抑制Hp黏附；益生菌的生物屏障作用可抑制Hp的定植[47]。王圓圓等[58]總結(jié)乳酸桿菌抑制Hp的可能機(jī)制如下：①乳酸桿菌的代謝產(chǎn)物干擾Hp能量代謝，抑制其生長(zhǎng)；②乳酸桿菌通過競(jìng)爭(zhēng)胃上皮細(xì)胞，抑制Hp黏附；③乳酸桿菌可抑制Hp尿素酶活性，減少了氨等致病因子的產(chǎn)生。

4.4 左金丸miRNA研究的新方向

近年來miRNA與Hp感染及相關(guān)疾病的研究逐漸增多。付偉等使用GEO數(shù)據(jù)集對(duì)比Hp陰性及陽(yáng)性患者資料，得到42個(gè)Hp感染相關(guān)miRNA，這些miRNA與調(diào)控的靶基因并非一一對(duì)應(yīng)，miR-153-5p、miR-95-5p、miR-577、miR-548-5p、miR-519e-5p等均調(diào)控多個(gè)靶基因，這些靶基因可能參與Hp的定植和持續(xù)感染[59]。Matsushima等[60]對(duì)比Hp非感染者，發(fā)現(xiàn)Hp感染者胃黏膜有50多個(gè)miRNA不同，其中多個(gè)miRNA與胃黏膜炎癥顯著相關(guān)，miRNA-223可高敏感、高特異性診斷Hp感染。Hp定植于胃黏膜上皮會(huì)引起免疫反應(yīng)，這有助于機(jī)體清除Hp，但幾乎所有Hp感染者都存在慢性活動(dòng)性胃炎，Hp感染可引起miRNA-155、miRNA-146等表達(dá)上調(diào)，通過不同通路抑制了炎癥因子的釋放，使Hp逃避機(jī)體免疫應(yīng)答，從而造成胃黏膜慢性活動(dòng)性炎癥[61]。尹作靜等[62]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿和吳茱萸堿按比例使用可產(chǎn)生協(xié)同抑制肝癌細(xì)胞BEL-7402增殖的作用，闡明了藥物組合是以miRNA為核心的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制起效，說明黃連、吳茱萸組合有效成分可能通過影響miRNA表達(dá)達(dá)到治療目的，我們推測(cè)左金丸根除Hp可能存在其有效成分干擾miRNA表達(dá)的類似機(jī)制。植物中藥中miRNA主要通過胃吸收進(jìn)入機(jī)體發(fā)揮作用，這也拓展了我們對(duì)中藥的認(rèn)識(shí)，除了化學(xué)成份，miRNA等小分子可能也是中藥的有效成分[63]，左金丸中存在哪些miRNA需要進(jìn)一步檢測(cè)？某些miRNA可能影響人體免疫反應(yīng)促進(jìn)Hp的根除。

4.5 左金丸治療Hp分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制

陳新怡通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)分析左金丸抑制殺滅Hp的PPI網(wǎng)絡(luò)得到IL2、IL4、IL10、VEGFA、TP53、MMP9等多個(gè)關(guān)鍵基因靶點(diǎn)，并通過干預(yù)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥反應(yīng)等多條通路起作用。該研究還篩選出左金丸中吳茱萸堿、小檗堿、巴馬汀、吳茱萸次堿等30多個(gè)活性成分，其中槲皮素是黃連和吳茱萸共有成分，能作用于143個(gè)靶點(diǎn)[64]。文獻(xiàn)提示槲皮素存在多種中草藥中，具有抗氧化、抗腫瘤、抑制炎癥反應(yīng)及抗菌作用，可以抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸球菌、沙門菌等多種細(xì)菌，但槲皮素抑制殺滅Hp無相關(guān)報(bào)道，有待深入研究[65]。左金丸中多種成分通過多個(gè)靶點(diǎn)、多條通路協(xié)同作用，最終起到抑制殺滅Hp的作用。以活性成分—基因靶點(diǎn)—信號(hào)通路為核心的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究有助于明確左金丸治療Hp的機(jī)制。

Hp位于胃黏液層下面，并且在胃黏膜上皮細(xì)胞表面定植，目前所使用的四聯(lián)藥物中鉍劑可以穿越胃黏液層直接作用于Hp，而抗生素及PPI均是有效成分吸收入血后起效[28]。左金丸口服可調(diào)節(jié)胃內(nèi)菌群，屬于局部作用，分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制提示左金丸治療Hp效應(yīng)靶點(diǎn)及信號(hào)通路與左金丸入血的有效成分高度相關(guān)，可以肯定左金丸有效成分腸道吸收入血后起到抑殺Hp的作用。左金丸有效成分能否穿透胃黏液層直接作用于Hp目前無相關(guān)研究。

5 總結(jié)

目前四聯(lián)方案療效確定，是Hp治療首選，但臨床仍有許多反復(fù)西藥根除失敗者、抗生素過敏者、藥物不能耐受者、基礎(chǔ)病較多的高齡患者均需要治療，并且中國(guó)Hp感染人口龐大，中醫(yī)藥是Hp治療的有益補(bǔ)充[66]。左金丸是臨床使用較廣泛的方劑，也是Hp治療潛在的靶方，我們需要整合目前基礎(chǔ)研究的知識(shí)，梳理臨床研究的不足，改進(jìn)臨床研究，檢驗(yàn)基礎(chǔ)研究的成果，從而使左金丸基礎(chǔ)研究與臨床研究相互促進(jìn)。這樣有利于中醫(yī)臨床療效的提高，有利于左金丸抑殺Hp的推廣使用，更有利于左金丸抑殺Hp機(jī)制研究。