李婉瑩 單探幽 閆錦陽(yáng) 高社干

食管癌是侵襲性較強(qiáng)的惡性腫瘤之一[1]。流行病學(xué)研究[2-3]結(jié)果表明，食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)約占食管癌的90%，食管腺癌(esophageal adeno carcinoma，EAC)僅占10%，盡管兩者具有地域分布和人種差異，但5年生存率均低于20%，且都與早期診斷困難、頻繁的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和治療敏感性降低有關(guān)。因此，亟待開(kāi)發(fā)用于食管癌治療的新標(biāo)靶和新方法。

自噬是介導(dǎo)細(xì)胞降解和再循環(huán)的分解代謝過(guò)程，對(duì)于維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要。自噬可分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy, CMA)3種，目前得到最廣泛研究的是巨自噬。巨自噬利用自噬泡將細(xì)胞質(zhì)中多余和受損的細(xì)胞器，以及入侵的微生物包裹起來(lái)形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，水解囊泡中的內(nèi)容物以重新合成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量[4]。目前對(duì)于自噬泡脂質(zhì)的來(lái)源仍存爭(zhēng)議，其可能來(lái)自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基體或質(zhì)膜。本文將對(duì)巨自噬(以下稱為自噬)在食管癌中的作用進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞自噬在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的雙重作用

正常情況下，大多數(shù)細(xì)胞的自噬水平較低，用于清除受損和多余的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和入侵的病原體。自噬過(guò)程被認(rèn)為是一種內(nèi)源性防御機(jī)制，細(xì)胞在惡劣條件下(如缺氧、高溫、饑餓和氧化應(yīng)激)可通過(guò)提高自噬水平獲取能量，維持生存[5-6]。此外，自噬還可參與細(xì)胞Ⅱ型程序性死亡，調(diào)節(jié)與腫瘤相關(guān)的炎癥和免疫反應(yīng)[7-8]，維持機(jī)體的正常代謝和基因組的完整性，從而抑制腫瘤的發(fā)生。在腫瘤進(jìn)展階段，自噬水平的提高可為腫瘤細(xì)胞提供能量，抑制其凋亡、促進(jìn)侵襲，清理被化學(xué)治療(簡(jiǎn)稱化療)與電離輻射損傷的大分子或細(xì)胞器，保護(hù)被攻擊的腫瘤細(xì)胞，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療(簡(jiǎn)稱放療)和化療(簡(jiǎn)稱放化療)的耐受性[9]。

1.1 自噬對(duì)食管癌的抑制作用 自噬對(duì)于維持正常機(jī)體基因組穩(wěn)定、維持體內(nèi)代謝平衡至關(guān)重要。Beclin-1是酵母自噬相關(guān)基因ATG6在哺乳動(dòng)物中的同源基因，可被自噬相關(guān)激酶ULK1磷酸化，并作為磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)復(fù)合物的整體支架促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白定位到自噬泡[10]。臨床研究[11]顯示，33%的ESCC患者中Beclin-1蛋白表達(dá)缺失，且Beclin-1陽(yáng)性組的生存率高于Beclin-1陰性組。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Beclin-1-/-突變型小鼠在胚胎早期死亡，而B(niǎo)eclin-1+/-突變小鼠腫瘤發(fā)生率增高，這與Beclin-1基因的表達(dá)量減少、自噬受損有關(guān)，表明Beclin-1是劑量依賴性的抑癌基因[12]。

為了證明自噬在Barrett食管(Barrett esophagus，BE)向EAC轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用，有研究[13]檢測(cè)了正常鱗狀上皮細(xì)胞、非發(fā)育異常BE細(xì)胞、發(fā)育異常BE細(xì)胞和EAC細(xì)胞中的自噬水平，發(fā)現(xiàn)非發(fā)育異常BE細(xì)胞自噬小泡數(shù)量最多，而EAC細(xì)胞中幾乎沒(méi)有自噬小泡；將4種細(xì)胞暴露于以脈沖形式釋放的酸性環(huán)境(pH值3.5)中孵育，非發(fā)育異常BE細(xì)胞和正常鱗狀上皮細(xì)胞在與自噬抑制劑氯喹聯(lián)合孵育時(shí)的氧化應(yīng)激水平較單獨(dú)暴露于酸性環(huán)境孵育時(shí)顯著升高，并且4種細(xì)胞的死亡率顯著增高；表明自噬可以減輕酸暴露造成的細(xì)胞損傷，促進(jìn)細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下存活，在BE進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。有學(xué)者用重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染Beclin-1基因構(gòu)建了Beclin-1過(guò)表達(dá)的食管癌Eca109細(xì)胞系，結(jié)果顯示Beclin-1過(guò)表達(dá)Eca109細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平較空載體組明顯升高，而細(xì)胞增殖能力及侵襲性下降；進(jìn)一步構(gòu)建裸鼠皮下移植腫瘤模型，結(jié)果顯示Beclin-1過(guò)表達(dá)組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯低于空載體組[14]。上述結(jié)果提示，高水平自噬可抑制食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

1.2 自噬促進(jìn)食管癌的進(jìn)展 微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)是自噬相關(guān)基因ATG8在哺乳動(dòng)物中的同源物，可被自噬相關(guān)半胱氨酸肽酶ATG4B水解，形成細(xì)胞質(zhì)定位的LC3-Ⅰ，在自噬過(guò)程中LC3-Ⅰ在ATG7、ATG3蛋白作用下與磷脂酰乙醇胺共價(jià)結(jié)合形成LC3-Ⅱ并轉(zhuǎn)至自噬體膜。通常 LC3和LC3-Ⅱ都可作為細(xì)胞自噬的分子標(biāo)志物，其表達(dá)水平與自噬的程度成正比[15]。

在食管癌進(jìn)展階段，自噬可清除受損細(xì)胞器為癌細(xì)胞提供能量，抑制癌細(xì)胞凋亡，降低治療敏感性，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。利用 Eca9706 和 KYSE150食管癌細(xì)胞系進(jìn)行的體外研究[16]結(jié)果顯示，腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated in colon cancer-1，MACC1)以自噬依賴性方式促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Chen等[17]的前瞻性研究納入了43例ESCC患者，結(jié)果顯示，caspase-3表達(dá)水平較低與LC3B水平較高、惡性轉(zhuǎn)化程度較高的免疫組織化學(xué)結(jié)果和預(yù)后較差有關(guān)，且caspase-3與LC3B的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，表明自噬可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)促進(jìn)ESCC的進(jìn)展。一項(xiàng)納入了253例ESCC患者的研究[18]也顯示，LC3呈低表達(dá)的患者較高表達(dá)者治療后的生存時(shí)間更長(zhǎng)(71.1個(gè)月比55.5個(gè)月，P=0.022)，且較高的LC3表達(dá)水平是ESCC發(fā)生的危險(xiǎn)因素(RR=1.407)。一項(xiàng)納入了104例術(shù)前未接受放化療和48例術(shù)前接受了放化療的EAC患者的研究[19]結(jié)果顯示，LC3B陽(yáng)性與預(yù)后較差有關(guān)，但亞組分析則顯示LC3B陽(yáng)性與術(shù)前未接受放化療的患者預(yù)后較好有關(guān)，但亦與術(shù)前接受了放化療的EAC患者預(yù)后較差相關(guān)，一定程度上解釋了放化療對(duì)腫瘤基礎(chǔ)自噬的影響[19]。一項(xiàng)meta分析納入78篇文獻(xiàn)共12 876例患者，其中有1 822例(14.2%)接受過(guò)放化療，結(jié)果顯示LC3B陽(yáng)性與患者預(yù)后較差有關(guān)(HR=1.56)[20]。上述研究結(jié)果表明，食管癌在腫瘤進(jìn)展階段的自噬水平較高，且較高的自噬水平與患者預(yù)后不良有關(guān)。

總之，自噬在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中具有雙重作用。在正常生理狀態(tài)下，自噬可以維持正常細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，抑制食管癌發(fā)生；一旦正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，由于自噬與細(xì)胞壓力的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系被打破，需要自噬為細(xì)胞提供ATP并維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，自噬就能促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。

2 細(xì)胞自噬與微生態(tài)

自噬作為先天免疫的重要組成部分，是抵御病原菌入侵的重要屏障[21]，與此同時(shí)許多微生物已經(jīng)進(jìn)化出逃避或破壞宿主自噬得以生存并建立持續(xù)感染的策略[22]。Yang等[23]研究發(fā)現(xiàn)并定義了存在于食管中的兩類微生物群，分別稱為Ⅰ型和Ⅱ型微生物群：Ⅰ型微生物群主要由革蘭陽(yáng)性菌和鏈球菌屬組成，與組織學(xué)正常的食管相關(guān)；Ⅱ型微生物群則主要由革蘭陰性菌組成，與食管炎和BE的組織學(xué)證據(jù)存在相關(guān)性。一項(xiàng)針對(duì)ESCC患者的研究[24]發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀上皮異型增生(ESCC的癌前病變)和ESCC患者較健康人群食管及口腔微生物多樣性低，且ESCC組織與非腫瘤組織梭狀芽孢桿菌(Fusobacterium)豐度較高、鏈球菌(Streptococcus)豐度較低，表明ESCC患者存在食管和口腔微生態(tài)的異常。

有研究[25]在61%的ESCC患者組織中檢測(cè)出牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)，但在健康對(duì)照組中未檢出。P.gingivalis隸屬擬桿菌門，研究[26]發(fā)現(xiàn)其能增加ESCC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，并且血清中抗P.gingivalis的IgG和IgA可作為生物標(biāo)志物用于ESCC的早期篩查[27]。Guo等[28]研究結(jié)果表明， ESCC細(xì)胞中Beclin-1的表達(dá)水平隨著P.gingivalis感染時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，而P.gingivalis感染或Beclin-1下調(diào)可增強(qiáng)ESCC細(xì)胞的增殖能力和遷移能力，降低ESCC細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。上述結(jié)果表明，P.gingivalis感染可能通過(guò)影響細(xì)胞自噬，促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖和遷移。

3 細(xì)胞自噬與食管癌的治療

食管癌常見(jiàn)的治療方案是進(jìn)行手術(shù)切除后配合化療和放療，但患者較易出現(xiàn)抗性，影響了治療效果。自噬促進(jìn)了癌細(xì)胞耐藥性的建立[9]。目前，臨床上常用的自噬抑制劑為氯喹及其衍生物羥氯喹，為抗瘧疾藥物，可防止溶酶體酸化，阻止自噬泡被清除[29]。臨床研究[30-32]已證實(shí)，氯喹及其衍生物羥氯喹能單獨(dú)或與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用，通過(guò)抑制自噬提高黑素瘤、大腸癌、骨髓瘤和腎細(xì)胞癌患者的放化療療效，具有治療潛力。但目前尚無(wú)利用上述自噬抑制劑在ESCC患者中進(jìn)行試驗(yàn)的研究。

常用的化療藥物順鉑和5-氟尿嘧啶(5-fluouracil，5-FU)可調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬。ESCC細(xì)胞系OE21和EAC細(xì)胞系OE33對(duì)5-FU和順鉑均表現(xiàn)出敏感性，這與促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制自噬相關(guān)[33]。與之相反，ESCC細(xì)胞系KYSE450和EAC細(xì)胞系OE19中則顯示出對(duì)5-FU和順鉑的抗性，KYSE450細(xì)胞系中Beclin-1蛋白和ATG7蛋白的表達(dá)上調(diào)，降低了5-FU對(duì)自噬泡合成的抑制作用，表明自噬增強(qiáng)了癌細(xì)胞對(duì)化療的抗性；常用的自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、氯喹和巴佛洛霉素A1(bafilomycin A1，Baf-A1)均不影響KYSE450細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性，表明靶向干預(yù)自噬的途徑不是由遺傳損傷介導(dǎo)的[34]。在ESCC細(xì)胞系Ec109中，利用順鉑進(jìn)行干預(yù)后，細(xì)胞自噬水平上調(diào)，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)激活水平降低；在異種移植腫瘤動(dòng)物模型中，順鉑與氯喹聯(lián)用時(shí)癌細(xì)胞的增殖受到抑制，而兩種藥物單獨(dú)使用時(shí)均未對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生明顯的抑制作用，表明自噬降低了順鉑療效的發(fā)揮[35]。

細(xì)胞自噬也與癌癥靶向藥物的治療效果有關(guān)。人工合成的靶向bcl2蛋白質(zhì)家族成員(細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑)對(duì)自噬有明顯的調(diào)節(jié)作用。 GX15-070是一種化學(xué)合成的bcl2同源物3模擬藥物，作用于ESCC細(xì)胞系EC9706后可誘導(dǎo)自噬，GX15-070單獨(dú)或與5FU/卡鉑聯(lián)合使用可促進(jìn)EC9706細(xì)胞死亡，聯(lián)用自噬抑制劑3-MA可增強(qiáng)GX15-70誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用[36]。人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，Her2)抑制劑與自噬抑制劑聯(lián)合使用可增強(qiáng)對(duì)EAC細(xì)胞活性的抑制作用，可能有助于EAC的治療[37]。甲磺酸酯(Obatoclax)是bcl2家族成員的泛抑制劑，介導(dǎo)bcl2家族成員的下調(diào)，在順鉑敏感和耐藥ESCC細(xì)胞系中均表現(xiàn)出自噬抑制活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；在這一過(guò)程中，甲磺酸酯可通過(guò)下調(diào)溶酶體蛋白酶的水平抑制癌細(xì)胞自噬，考慮到自噬和蛋白酶是蛋白質(zhì)降解的主要細(xì)胞途徑，因此推測(cè)甲磺酸酯與蛋白酶體抑制劑MG132結(jié)合可引起聚泛素化蛋白積聚，引起癌細(xì)胞死亡[38]。

目前已有多種天然化合物被用于食管癌的治療。白藜蘆醇是在紅酒和食品中發(fā)現(xiàn)的一種植物抗毒素，具有抗腫瘤作用。在ESCC細(xì)胞系EC109、EC9706和K562中，白藜蘆醇誘導(dǎo)了細(xì)胞G1期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，聯(lián)用自噬抑制劑可增強(qiáng)白藜蘆醇介導(dǎo)的細(xì)胞死亡作用[39]。體外研究[40]顯示，人參皂苷Rk3可限制ESCC細(xì)胞系Eca109和KYSE150的增殖和侵襲能力，與引起細(xì)胞周期G1期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)，降低PI3K/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路激活的水平；有趣的是，聯(lián)用自噬抑制劑3-MA卻抑制了Rk3的抗癌作用，表明自噬在這種情況下會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。

4 前景展望

自噬在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要且復(fù)雜的調(diào)控作用，并且能夠影響其治療效果。盡管已有研究證明自噬在BE向EAC轉(zhuǎn)化的過(guò)程中起保護(hù)作用，但仍需要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)體內(nèi)研究模型探究自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制。在考慮如何利用自噬抑制劑治療食管癌時(shí)，關(guān)鍵在于了解細(xì)胞主體及基礎(chǔ)自噬水平是否被打破。要準(zhǔn)確判斷患者的自噬是處于激活還是停滯狀態(tài)，并結(jié)合是否接受放化療等因素綜合判斷。此外，由于自噬調(diào)節(jié)腫瘤的復(fù)雜性，如何判斷基礎(chǔ)自噬水平，評(píng)估自噬發(fā)揮的作用，仍需要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)特異性的調(diào)節(jié)自噬水平，更好地指導(dǎo)臨床治療。