鄭玉玲 ，李納納 ，馮京 ，張浩 ，丁輝 ，宋新波

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.天津紅日藥業(yè)股份有限公司，天津 301617）

骨質疏松癥（OP）是一種以骨密度降低、骨強度下降、骨組織損傷、骨量和骨中礦物質流失進而骨脆性增高及易發(fā)生骨折為病理特點的全身性骨代謝疾病[1]，多見于老年人，已成為全世界面臨的健康問題，引起世界人民的廣泛關注[2]。臨床上主要使用具有促進骨的形成，抑制骨的吸收以及兼具雙重作用的藥物來防治骨質疏松癥。西醫(yī)上主要通過降鈣素類[3]、雙磷酸鹽類[4]、雌激素替代治療[5]、選擇性雌激素受體調節(jié)劑[6]、狄諾塞麥[7]、雷奈酸鍶[8]等來治療骨質疏松癥，這些藥物存在安全性問題，長期使用這些藥物會引起不同程度的心腦血管疾病、靜脈血栓栓塞、乳腺癌等不良反應[9]。

肉蓯蓉（Cistanche deserticola Y.C.Ma）是中國傳統(tǒng)補益類中藥材之一，又稱大蕓、蓯蓉，為列當科植物肉蓯蓉或管花肉蓯蓉Cistanche tubulosa（Schenk）Wight的干燥帶鱗葉的肉質莖[10]，始載于《神農(nóng)百草經(jīng)》，列為上品[11]，性甘、咸、溫，歸腎經(jīng)、大腸經(jīng)，素有“沙漠人參”的美譽。肉蓯蓉是多年生寄生性草本植物，其主要寄生在梭梭屬、怪柳屬等沙漠、荒漠固沙植物的根部。目前，全世界約有22個品種，主要分布在歐亞的溫暖干燥地區(qū)，中國有5種肉蓯蓉且主要分布在內蒙古、新疆、青海、寧夏等西北荒漠、沙漠地區(qū)[12]。自古肉蓯蓉便是藥食兩用的植物，大量文獻資料表明，肉蓯蓉具有抗衰老[13]、抗炎[14]、抗氧化[15]、抗骨質疏松[16]、抗抑郁[17]、潤腸通便[18]等生物學效應，因而具有極高的經(jīng)濟價值[19]。中醫(yī)理論認為，發(fā)生骨質疏松癥的主要原因是肝、脾、腎三臟虛損[20]。肉蓯蓉具有補腎陽、益精血之功效，現(xiàn)代研究證明肉蓯蓉具有抗骨質疏松作用[16，21-22]，可用于骨質疏松癥的治療，苯乙醇苷類成分是肉蓯蓉的主要活性成分之一，《中華人民共和國藥典》明確規(guī)定苯乙醇苷類代表性成分松果菊苷和毛蕊花糖苷為肉蓯蓉的質量控制成分[10]。松果菊苷的絕對生物利用度（F，%）為0.83%[23]，毛蕊花糖苷的口服生物利用度（F，%）為0.12%[24]，這與肉蓯蓉苯乙醇苷類成分的藥物活性相矛盾。天然藥物通常具有系統(tǒng)前廣泛代謝的特點，發(fā)揮整體藥效作用的可能是其活性代謝產(chǎn)物[25]，因而本文對其體內外代謝轉化過程及代謝產(chǎn)物進行分析，進而確定其治療骨質疏松癥的活性成分、藥效學及作用機制。

1 肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分體內外代謝研究

1.1 肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分體內代謝研究 Li等[26]利用UHPLC-Q-TOF-MS對口服肉蓯蓉水提物的大鼠的尿液、糞便和血清進行研究，初步鑒定了肉蓯蓉71個代謝物，其中原型組分25個，代謝物46個，研究表明苯乙醇苷類主要在大鼠的胃腸道中代謝。Cui等[27]給大鼠口服200 mg/kg的松果菊苷和毛蕊花糖苷，收集其血漿、膽汁、糞便和尿液，采用UHPLC-ESI-Q-TOF-MS對收集到的樣品進行處理，發(fā)現(xiàn)松果菊苷和毛蕊花糖苷具有明顯的肝首過效應，在血漿、糞便和尿液中的代謝情況相似，主要通過重排、水解、還原、脫羥基、甲基化、硫酸化和葡萄糖醛酸化等代謝途徑，生成咖啡酸、羥基酪醇等18種代謝產(chǎn)物，且發(fā)現(xiàn)咖啡酸、羥基酪醇均與松果菊苷、毛蕊花糖苷具有相似的生物活性。雷厲等[28]收集灌胃苯乙醇總苷的狗的糞便，并利用HPLC對其進行分離，得到松果菊苷、毛蕊花糖苷、異類葉升麻苷和2’-乙?；惾~升麻苷，結果表明松果菊苷在大腸中經(jīng)過脫糖反應轉化為毛蕊花糖苷。

1.2 肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分體外代謝研究 錢浩等[29]將松果菊苷與人腸道菌群一起在體外厭氧條件下孵育不同時間，采用HPLC-ESI-MS對松果菊苷及其代謝物進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)松果菊苷在離體條件下被人腸道菌群代謝為毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷和chamaedroside。王昕蕾等[30]研究肉蓯蓉總苷在人工胃液及腸液中的代謝途徑，采用UHPLCESI-Q-TOF-MS對其成分進行分析鑒定。結果發(fā)現(xiàn)人工胃液中有14個原型成分、55個代謝成分，人工腸液中有4個原型成分、86個代謝成分，肉蓯蓉總苷主要是通過去甲基化、甲基化、去羥基化、羥基化、乙?；?、硫酸化、葡萄糖醛酸化等途徑在人工胃液和腸液中發(fā)生代謝。李瑒等[31]通過對肉蓯蓉水煎液在大鼠體內代謝研究和人源體外胃腸道代謝研究，發(fā)現(xiàn)苯乙醇苷類成分主要代謝為羥基酪醇、咖啡酸且咖啡酸在腸道菌群中被繼續(xù)代謝為3-羥基苯丙酸，環(huán)烯醚萜類代謝為其苷元。

通過對肉蓯蓉苯乙醇苷類成分體內外代謝的研究，發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉苯乙醇苷類成分主要通過重排、水解、還原、甲基化、去甲基化、羥基化、去羥基化、乙?；?、硫酸化和葡萄糖醛酸化等途徑代謝成羥基酪醇、咖啡酸、異毛蕊花糖苷、2′-乙?；惾~升麻苷和chamaedroside等主要產(chǎn)物，見圖1，其中松果菊苷[32]、毛蕊花糖苷[33]、咖啡酸[34]及羥基酪醇[35]等具有較好的治療骨質疏松癥的作用。

2 肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分抗骨質疏松藥效學研究

徐珊珊[32]通過研究松果菊苷調節(jié)T淋巴細胞對成骨細胞的影響，發(fā)現(xiàn)松果菊苷干預的T淋巴細胞培養(yǎng)上清（10%）干預處理成骨細胞72 h，對成骨細胞的增殖以及骨保護蛋白（OPG）mRNA的表達具有顯著促進作用，同時能夠顯著抑制受體活化因子配體（RANKL）mRNA的表達，起到治療骨質疏松癥的作用。陳微娜[33]等研究毛蕊花糖苷對新生大鼠體外培養(yǎng)成骨細胞的增殖與分化作用，發(fā)現(xiàn)1×10-7～1×10-9mol/L的毛蕊花糖苷能夠顯著促進新生大鼠顱骨成骨細胞的增殖，且終濃度為1×10-7mol/L的毛蕊花糖苷在作用新生大鼠顱骨成骨細胞72 h后能夠顯著提高其堿性磷酸酶的活性（P＜0.05），對治療骨質疏松癥有一定的作用。石其福[34]研究咖啡酸對破骨細胞形成與分化的影響，發(fā)現(xiàn)咖啡酸可直接作用于破骨前驅細胞和破骨細胞，并對其形成與分化呈濃度依賴性抑制。研究發(fā)現(xiàn)羥基酪醇可增強成骨細胞的增殖及分化，還可減少破骨細胞樣細胞的形成，對治療骨質疏松癥有一定的療效[35]。

3 肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分抗骨質疏松作用機制研究

網(wǎng)絡藥理學分析發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉中有多種成分具有較好的抗骨質疏松作用，如松果菊苷、益母草堿、京尼平酸、毛蕊花糖苷、去咖啡?；惾~升麻苷等，主要作用于成骨細胞特異性轉錄因子Runt相關轉錄因子 2（RUNX2）、白細胞介素 6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、骨生長蛋白因子（BGP）、成骨細胞骨橋蛋白（OPN）、活性氧簇（ROS）、絲裂源活化蛋白激酶（MAPK）、FMS 樣酪氨酸激酶 3（FLT3）、泛素特異性肽酶10（USP10）等靶標，發(fā)揮抗骨質疏松的作用[36]。松果菊苷和毛蕊花糖苷是肉蓯蓉中的代表性成分，含量較高、作用較強，主要通過以下幾個作用機制抗骨質疏松。

3.1 雌激素作用 雌激素水平下降，會導致骨密度降低、骨量減少，造成骨質疏松[37]。補腎陽中藥通過作用于下丘腦—垂體—性腺調節(jié)激素水平或直接發(fā)揮激素樣作用調節(jié)卵巢功能來治療雌激素缺乏造成的骨質疏松癥[38]。王琳琳等[39]采用熒光素酶報告質粒法研究肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的植物雌激素作用，結果發(fā)現(xiàn)松果菊苷、毛蕊花糖苷可以與雌激素共同拮抗雌激素對雌激素應答元件（ERE）的上調作用，從而表現(xiàn)出植物雌激素活性。

3.2 調節(jié)Ca、P代謝平衡 鈣、磷是機體必須微量元素，是骨組織的重要組成部分，參與并維持機體正常生理功能[40]。骨是調控鈣磷代謝的主要靶器官之一，與降鈣素[41]、甲狀旁腺素[42]等共同維持機體內鈣磷代謝平衡，鈣磷代謝紊亂是骨質疏松癥的病理機制之一。任何甲狀腺功能障礙均可能中斷骨組織的生長，研究證明羥基酪醇可以改善甲狀腺細胞功能，在骨形成與吸收過程中使鈣維持在穩(wěn)態(tài)水平，從而改善骨組織的結構與微結構，起到抗骨質疏松的作用[43]。李彩虹等[44]通過研究發(fā)現(xiàn)松果菊苷可顯著促進成骨細胞OPN基因的表達，同時對OPN蛋白的分泌有促進的趨勢。骨橋蛋白（OPN）作為成骨細胞的表型之一，在骨基質的礦化和吸收過程中起重要作用并能調節(jié)成骨細胞和破骨細胞的功能，達到治療骨質疏松癥的效果[45]。羥基酪醇以劑量依賴的方式刺激鈣的沉積，隨著鈣沉積的增加來抑制破骨細胞的形成，對骨質疏松癥有一定的治療作用[46]。

3.3 抗氧化應激 超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）及羥自由基（·OH）等構成機體95%的活性氧簇（ROS）[47]，ROS 通過誘導骨細胞凋亡、抑制骨質礦化和骨形成、增強骨吸收等破壞骨重建過程，導致骨質疏松癥[48]。松果菊苷與毛蕊花糖苷中的苯乙醇基和苯丙烯基上均帶有鄰位酚羥基[49]，這種結構易與氧自由基結合，降低氧化應激對機體的損傷[50]?？Х人岵粌H能夠清除體內超氧陰離子（O2-），還能夠抑制氧自由基的形成，在機體內具有一定的抗氧化作用[51]。羥基酪醇可降低成骨細胞MC3T3-E1細胞中H2O2的水平[45]。

3.4 RANK-RANKL-OPG信號通路

核因子-κB受體活化因子（RANK）-核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）-骨保護蛋白（OPG）信號轉錄系統(tǒng)[52]是調控骨形成與骨吸收的關鍵耦聯(lián)系統(tǒng)，是骨質疏松癥的病理機制之一[53]。RANKL是RANK的配體，兩者特異性結合，可以促進破骨細胞的分化，增加骨吸收[54]。OPG是一種分泌型糖蛋白，可競爭性與RANKL結合，有效阻斷RANK與RANKL的結合，抑制骨吸收[55]。松果菊苷可以通過提高OPG/RANKL的比值來安全有效的預防絕經(jīng)后骨質疏松癥的骨丟失，對治療骨質疏松癥有一定的療效[56]。毛蕊花糖苷通過下調RANK和RANKL的表達水平，抑制骨吸收，起到預防骨質疏松癥的效果[57]。咖啡酸[58]能夠上調OPG/RANKL系統(tǒng)改善骨重建，提高成骨細胞分化成熟的能力，對骨質疏松癥有一定的治療作用。Zhang等[16]研究肉蓯蓉RANKL/RANK/TRAF6介導的信號通路對去卵巢大鼠骨代謝的抗骨質疏松活性，結果發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉提取物可以使 IKK β、NF-κ β、NFAT2 的表達下調及 c-Fos的表達上調，表明肉蓯蓉提取物通過阻止RANKL/RANK/TRAF誘導的NF-κβ活化和PI3K/AKT失活，以及c-Fos刺激和NFAT2抑制，達到抑制破骨細胞分化和骨吸收的目的，對去卵巢骨質疏松大鼠有一定的治療效果。

3.5 BMP2-Smad-Runx2信號通路 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）屬于轉化生長因子 β（TGF-β）超家族，可促進骨骼生長發(fā)育[59]。BMP2是BMPs的一種亞型，參與調節(jié)成骨細胞的分化[60]。Smads蛋白家族是TGF-β細胞內具有信號傳導作用的唯一轉導分子，能夠與其他轉錄分子結合后將應答信號由細胞膜轉移至細胞核進行調控[61]。Runx 2（又稱核心結合因子a1，Cbfa1），研究證明該因子能夠通過直接或者間接調節(jié)成骨細胞相關基因來調節(jié)成骨細胞的分化[62]。BMP2-Smad-Runx2通路[63]的調控機制是BMP2與其受體結合后激活Smads復合物，Smads復合物上調成骨細胞和軟骨細胞分化的Runx2，從而促進成骨細胞增殖或成骨分化，能夠治療骨質疏松癥[64]。松果菊苷通過上調BMP2與Smad4的表達水平而激活BMP/Smad信號通路，從而促進大鼠成骨細胞的增殖[65]。田原[66]研究發(fā)現(xiàn)松果菊苷含藥血清能夠顯著上調骨髓間充質干細胞中BMP2、Smad1/5/8、ZHX3、Runx2和 OSXmRNA 和蛋白表達水平，提示骨髓間充質干細胞通過BMP2-Smad-Runx2通路誘導為成骨細胞。

3.6 MAPK-ERK信號通路 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路[67]，包括 ERK、p38、JNK 和ERK5等四個亞族，能夠介導細胞外信號向細胞內靶點的傳遞，從而調節(jié)細胞生長、發(fā)育、分化及凋亡等過程[68]。研究發(fā)現(xiàn)松果菊苷能夠上調ERK、p38和JUNK的磷酸化水平[69]從而激活MAPK/ERK信號通路，進而促進大鼠成骨細胞的分化，對治療骨質疏松癥有一定作用[65]。

3.7 FLT3-USP10信號通路 FMS樣酪氨酸激酶3（FLT3）是一種跨膜酪氨酸酶受體，其被激活后能夠刺激細胞的增殖[70]。研究證實FLT3能夠與巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）結合，聯(lián)合RANKL誘導破骨細胞的分化，對骨質疏松癥有一定的治療作用[71]。泛素特異性肽酶（USP）10屬于泛素特異性蛋白酶（USP）家族，研究證明USP10不僅是FLT3維持穩(wěn)定所需的關鍵去泛素化酶，而且通過抑制USP10的活性能夠誘導FLT3蛋白的降解[72]。毛蕊花糖苷能夠抑制糖皮質激素誘導的骨質疏松大鼠USP10/FLT3通路的活性，下調USP10/FLT3蛋白表達水平來改善大鼠骨質疏松[73]。

4 總結與展望

肉蓯蓉作為中國傳統(tǒng)補益類中藥之一，其生物活性廣泛，具有極高的藥用及食用價值。上述對肉蓯蓉苯乙醇苷類成分體內外代謝研究及抗骨質疏松的藥效學與作用機制等進行了總結，闡明了肉蓯蓉苯乙醇苷類成分防治骨質疏松癥的有效成分及作用機制，為女性絕經(jīng)后雌激素分泌減少及各種身體機能下降等導致的骨質疏松癥的防治奠定了理論基礎。隨著科學技術的不斷發(fā)展及人們對肉蓯蓉認識的不斷加深，發(fā)現(xiàn)不論是基于中醫(yī)的“腎主骨”理論，還是現(xiàn)代的科學研究證明，都能說明肉蓯蓉具有較好的抗骨質疏松作用，但肉蓯蓉其他成分的體內外代謝轉化研究及抗骨質疏松作用機制研究尚不完善，今后可對其進行進一步研究。以期有更多肉蓯蓉抗骨質疏松作用的藥物及保健食品問世，從而使肉蓯蓉這一寶貴資源得到充分利用和有效發(fā)展。