譚景銘，周胤樸綜述，張璟琳，汪 虹審校

0 引 言

瘢痕狹義上是指病理性瘢痕，是組織損傷非再生愈合的結果，是組織損傷修復的一種重要并發(fā)癥[1]。病理性瘢痕表現(xiàn)為感覺異常、瘤樣增生或伴有不同程度功能障礙，會影響患者身心健康[2]。一直是醫(yī)學亟待解決的難題。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)脂肪干細胞外泌體(exosomes derived from adipose-derived stem cell，ADSC-exos)通過在創(chuàng)面愈合的炎癥、細胞組織增殖和重塑中發(fā)揮作用，從而影響瘢痕的形成，且ADSC-exos在所有間充質干細胞外泌體中擁有可穩(wěn)定分泌[3]、安全性更高、易獲得和保存[3]、副作用少、擁有較少倫理關系等優(yōu)點[5]。本文總結國內外關于ADSC-exos治療瘢痕的研究成果，闡述ADSC-exos應用于瘢痕治療的潛在機制，為治療創(chuàng)面瘢痕形成提供新的思路。

1 調控炎癥

在生物學功能方面，ADSC-exos中的蛋白能使白細胞活化。炎性反應一方面作為抗感染的免疫屏障，另一方面刺激纖維組織形成以閉合創(chuàng)面。因此，適度的炎性反應有利于創(chuàng)面愈合。但是，當大量炎性細胞及其產生的促炎因子增加時，不僅加重炎性反應，延長炎癥持續(xù)時間，還可導致細胞外基質過度沉積及組織纖維化[6]，進而形成病理性瘢痕。ADSC-exos從以下方面干預傷口的炎性反應。

1.1促進巨噬細胞(m?)極化為M2型m?參與機體的固有免疫，并調控炎癥[7]。m?有兩種表型M1和M2，M1在傷口中主要發(fā)揮促炎效果，M2在傷口中有抑制炎癥并幫助修復傷口組織的功能，且在一定條件下可互相轉化[8]。因此，m?從M1向M2的轉化，有助于中斷傷口修復過程中異常的炎癥持續(xù)以及加速延遲的異常組織修復。

現(xiàn)有研究已表明，ADSC-exos能顯著性下調m?中M1表面標志TNF-α 和IL-6的表達[9]，同時上調M2表面標志Arg-1和IL-10的表達[10]。證實脂肪干細胞(ADSC)主要是通過其外泌體發(fā)揮旁分泌功能調控M1向M2轉化，但是具體的調控方式仍有待于進一步研究[11]。

趙匯等[12]認為經ADMSC-Exo刺激的m?是通過p-Stat3的表達上調，Stat3通路活化的方式使M2增加。不僅如此，還發(fā)現(xiàn)了ADSC-exos甚至可抵抗炎性因子(LPS、IFN-γ)對于m?極化為M1的作用，并使m?極化為M2。Hao等[13]認為ADSC-exos通過抑制M1極化的轉錄因子C/EBP-δ來抑制M1并刺激M2形成。有研究表明炎性因子對于ADSC-exos的控制其實非常精細，且恰恰正是炎癥因子激活了ADSC-exos對于M1向M2的極化作用。研究使用炎性因子(IFNγ/TNFα)刺激過的ADSC-exos，使得已分化為M1的m?上調M2的標記CD163、CD206表達(即M1向M2極化)[14-16]。值得注意的是，被炎癥細胞因子刺激過的ADSC分泌的外泌體包含與M2極化有關的miRNA(miRNA-34和miRNA-146)，而這些miRNA于未經炎性因子刺激的ADSC-exos中低水平表達。有趣的是，在最高濃度的炎性因子下，外泌體內與M1極化有關的miRNA(miR-127和miR-155)也在增加，但是相比于M2極化有關的miRNA數(shù)量上少得多。同時在最終驗證蛋白功能中分析了 M2極化有關的miRNA(miR-34a，miR-146和miR-21 )靶向蛋白 (Notch1，IRAK1和Sirp-β1)的表達[17]。證明了ADSC-exos從miRNA產生到最后效應細胞的蛋白表達這個完整過程中的免疫抑制和抗炎潛能。表明ADSC-exos免疫調節(jié)特性可能不是本身ADSC-exos所固有，而是由傷口的炎癥環(huán)境誘導并產生的[18]。

1.2降低炎性因子生成在關于小鼠特異性皮炎的研究中，用LPS刺激鼠巨噬細胞24h，引起了炎性因子一氧化氮(NO)的產生。但是，ADSC-exos以劑量依賴的方式顯著降低了NO的產生。檢查ADSC-exos對血清IgE水平的影響。結果表明，靜脈內或皮下注射ADSC-exos，血清IgE水平以劑量依賴性方式顯著降低[19]。降低了血清IgE水平ADSC-exos減少了嗜酸性粒細胞數(shù)量，但對嗜中性粒細胞的數(shù)量幾乎沒有影響。而后通過定量實時PCR(qRT-PCR)分析炎性細胞因子的 mRNA 水平。靜脈注射給予ADSC-exos，劑量依賴性地降低了皮膚病變中IL-4，IL-31，IL-23和TNF-α的mRNA 水平。實際上，所有這些促炎細胞因子都是目前正在開發(fā)或最近被批準抑制炎癥的生物制劑的靶標[20]?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)表明，ADSC-exos可抑制炎癥反應和炎癥細胞因子的表達[21]。同樣，在特異性皮炎的研究中，還報道了ADSC-exos可顯著降低炎性因子如IL-5、IL-13、IFN-γ、IL-17[22]。其他的研究表明在ADSC-exos的作用下傷口中IL-6、CD14、CD19、CD68等細胞因子和趨化因子下調減輕了由多種刺激引起的炎癥反應[23]。在裸鼠背部創(chuàng)面愈合的研究中，應用了ADSC-exos的創(chuàng)面組織中TNF-α和IL-6表達量在5周內逐漸降低，炎癥反應程度減弱，在2至3周時顯著增加抗炎因子IL-10的產生，在2周后顯著增加抗炎因子IL-13的產生[24]。

1.3減少肥大細胞浸潤肥大細胞會在傷口處脫顆粒[25]，在創(chuàng)傷修復過程中增加，并且肥大細胞在傷口修復過程的每個階段都起作用，包括炎癥、增殖和肉芽組織形成以及重塑階段。在近來的很多研究中觀察到病理性瘢痕相較于正常傷口處肥大細胞數(shù)量更多、活化更充分、脫顆粒作用也更強[26]。而關于特異性皮炎的研究中都證明了ADSC-exos可顯著降低IgE介導的肥大細胞增加，有助于消減炎癥作用[21-22]。

2 調整傷口的細胞外基質

傷口愈合的增生和重塑階段與細胞外基質(extracellular matrix,ECM )的產生和重組密切相關，所以ECM的正常與否決定了瘢痕的存在以及瘢痕的嚴重程度。 膠原纖維在病理性瘢痕和正常傷口修復的比較中，組織和結構都出現(xiàn)了異常。疤痕組織的特征是ECM成分過度沉積，皮膚附件(如毛囊、汗腺)的缺失。在人體皮膚中，ECM含有纖維蛋白和基質。纖維蛋白包括膠原蛋白，彈性蛋白和纖連蛋白，并提供三維支架，在其上支撐或錨定單個細胞和血管網絡[27]。其中，膠原蛋白是ECM最豐富的成分。所以ECM中膠原蛋白的情況也決定了瘢痕的情況[28]。人體皮膚中最豐富的纖維蛋白是膠原蛋白Ⅰ，膠原蛋白Ⅲ和膠原蛋白Ⅴ僅占總膠原蛋白的較小比例[29]。在無疤痕愈合的胎兒傷口與成人病理性瘢痕的比較分析則發(fā)現(xiàn)，無疤痕的胎兒傷口聚集了更多的Ⅲ型膠原蛋白[30-32]。而且傷口中的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)比組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)也高很多。

近來的研究表明ADSC-exos可增加傷口內Ⅲ型膠原與Ⅰ型膠原的比例。經過進一步分析，可能的機制是通過上調創(chuàng)傷皮膚組織中的Colla1的表達，下調Co13a1的表達。據(jù)報道，肌成纖維細胞嵌入其分泌的ECM中，并且還分泌MMP和TIMP以重塑該ECM。MMPs，特別是MMP1和MMP3在傷口愈合、瘢痕化過程中的重要作用已得到肯定。引起瘢痕形成的原因可能是TIMP-1增多而對MMP的抑制作用有關[33]。進一步研究表明了ADSC-exos在體外激活了皮膚真皮中成纖維細胞的ERK / MAPK途徑，并通過激活ERK途徑提高了MMP3的水平，從而增加了MMP3與TIMP1的比例并調節(jié)ECM的重塑以減少瘢痕[30]。應用ADSC-exos的創(chuàng)面中HE染色結果顯示，第5周時傷口膠原排列相對整齊。在Masson染色結果中，膠原排列規(guī)整，膠原纖維含量相對稀疏。創(chuàng)面組織勻漿中的Ⅰ型膠原mRNA的表達量在4至5周增加，Ⅲ型膠原mRNA的表達量在3到5周增加，而更重要的是傷口逐漸趨于正常皮膚組織膠原的比率[24]。在Zhou等[23]的研究中采用了脂肪干細胞外泌體局部涂抹的方式治療小鼠瘢痕，3次/d局部涂ADSC-exos治療傷口時觀察到了更窄的疤痕，且研究結果表明，ADSC-exos在晚期增加了膠原蛋白Ⅲ與膠原蛋白Ⅰ的比例，以抑制疤痕組織形成。最后在研究 ADSC-exos對皮膚創(chuàng)面屏障功能恢復的影響過程中，發(fā)現(xiàn)了ADSC-exos增加了一些皮膚屏障蛋白(如聚絲蛋白、Loricrin和AQP3)的表達水平，表明ADSC-exos有利于促進皮膚彈性和屏障完整性。有小鼠體內研究表明，在傷口愈合的早期階段，ADSC-exos促進了膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的生成。最終結果顯示，ADSC-exos在早期通過縮短愈合時間來促進傷口愈合，而在晚期，可能會抑制膠原蛋白的合成以減少疤痕的形成。這種趨勢遵循組織傷口自然愈合期間觀察到的組織學變化[34]。也就是說，在愈合的早期階段膠原蛋白沉積更為重要，而在愈合的后期基質重建更為關鍵。

3 抑制成纖維細胞

成纖維細胞作為一種被炎癥因子刺激，修復組織的細胞，在正常的傷口中可見到聚集，但成纖維細胞異常增生和過度活化會導致病理性瘢痕的形成[35-37]。在傷口正常愈合時，增殖階段常表現(xiàn)為成纖維細胞被激活，并伴隨一定數(shù)量的肌成纖維細胞形成[38]。但病理性瘢痕中肌成纖維細胞的數(shù)量往往較多[23]。α-SMA是肌成纖維細胞的已知標志物，賦予其高收縮力，進而形成疤痕。許多研究也報道了，TGF-β1和TGF-β3是參與ECM沉積和瘢痕形成的重要因素。TGF-β3曾被用作預防和減少疤痕的治療藥，并且是肌成纖維細胞的抑制劑，而TGF-β1則促進了肌成纖維細胞的分化和肉芽組織的形成。

近來關于張力性創(chuàng)面的研究中，由于受到張力的作用，可誘導成纖維細胞α-SMA的表達，然而 ADSC-exos能以劑量依賴的方式降低α-SMA的表達。在創(chuàng)面愈合不同時期，施加ADSC-exos的創(chuàng)面由于創(chuàng)周向創(chuàng)面中央的遷移增快，每個成纖維細胞所受到的表面張力隨之相應的減小。ADSC-exos可能能夠抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞細胞的轉化，從而抑制瘢痕的過度形成[39]。其他的研究已表明ADSC-exos可抑制成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，并抑制肉芽組織的形成。ADSC-exos的處理使得α-SMA的表達顯著降低，同時也降低了TGF-β1與TGF-β3的比率。且ADSC-exos抑制了成纖維細胞的分化并減少了傷口床中肌成纖維細胞的數(shù)量?？傮w而言，這些結果表明，ADSC-exos阻止了成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，并抑制了肉芽組織的形成[28]。近來有研究結果顯示,ADSC-exos還能抑制人增生性瘢痕成纖維細胞(hypertrophic scar fibroblast,HSF)的增殖，促進細胞凋亡。miR-34a過表達的ADSC-exos能有效抑制HSF的增殖，促進細胞凋亡，并且通過下調 TGF-β /Smad、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達抑制 HSF的纖維化和膠原合成來減少瘢痕的生成[40]。這些結果啟示我們ADSC-exos在促進創(chuàng)面愈合和減少疤痕中具有積極作用。同時，若在傷口的早期愈合過程中采取干預措施，加速創(chuàng)面的愈合，并防止肌成纖維細胞過度增殖積聚，而不是在疤痕形成后采取補救措施，可能是治療瘢痕的方法之一。

4 結語與展望

ADSC-exos作為一種易獲得，排異反應低的物質，已在創(chuàng)面修復的研究中取得了大量成果，雖然已有大量研究表明ADSC-exos有助于瘢痕的治療，但是大部分處于動物實驗和基礎實驗的研究階段，臨床治療還缺乏相應的依據(jù)。而且國內大多數(shù)文獻僅報道了ADSC-exos修復傷口的前期作用，如能使細胞大量增殖和遷移，但卻忽略了ADSC-exos后期對于傷口的影響，因為其實很多關于傷口修復的細胞和因子其實是把雙刃劍，例如早期內皮細胞和成纖維細胞的增殖、遷移和炎性因子釋放有助于傷口的快速修復，但是在傷口修復的后期過度的血管、細胞外基質生成和持續(xù)的異常炎癥卻導致了病理性瘢痕的形成?？傊?，ADSC-exos的研究為治療病理性瘢痕提供了一個新的視角和思路。