廖晏藺，劉正蕓綜述，王 歡審校

0 引 言

我國肝細(xì)胞癌的發(fā)病率位居世界前列[1]，其預(yù)后差，致死率高[2-3]，治療上以包括手術(shù)切除、化療在內(nèi)的綜合治療為主[4]。大多數(shù)肝癌患者對(duì)藥物治療并不敏感[5]，對(duì)肝癌新藥的研發(fā)迫在眉睫。肝癌研究模型可分為體內(nèi)模型和體外模型兩種。雖然體內(nèi)模型是最大限度吻合機(jī)體組織結(jié)構(gòu)相互作用的模型，但其存在一定的缺陷限制了它的應(yīng)用；肝癌研究的體外模型主要是二維培養(yǎng)細(xì)胞系模型，但2D結(jié)構(gòu)在許多方面都與原始腫瘤有很大的差異。因此，研究出能夠穩(wěn)定增殖且與機(jī)體微環(huán)境更加接近的原代肝癌細(xì)胞體外繁殖的創(chuàng)新方法是我們孜孜以求的目標(biāo)[6]，類器官的出現(xiàn)給這一設(shè)想帶來了新希望。

3D培養(yǎng)最早于1968年提出，類器官是3D細(xì)胞培養(yǎng)的一種產(chǎn)物，指的是由干細(xì)胞發(fā)育而來類似器官的一種三維培養(yǎng)物[7]。類器官培養(yǎng)基需要添加很多的生長(zhǎng)因子，作用是維持干細(xì)胞的功能，驅(qū)動(dòng)其擴(kuò)增和分化[8]。類器官可來源于多能干細(xì)胞(human pluripotent stem cells, hPSCs)和成體干細(xì)胞(somatic stem cells)。其中多能干細(xì)胞可來源于胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs) 和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (induced pluripotentstem cells，iPSCs)，成體干細(xì)胞則一般從臨床患者的組織樣本中分離得到[9]。近年來，胰腺腫瘤[10]，乳腺癌[11]，胃癌[12]等腫瘤類器官的成功構(gòu)建，無疑給腫瘤研究帶來了無限的可能，肝癌類器官在2017年首次被報(bào)道[13]，本文主要就肝癌類器官的培養(yǎng)方式及其相關(guān)應(yīng)用研究作一綜述，以期為肝癌研究提供更好的體外模型。

1 肝癌類器官的培養(yǎng)

1.1 組織來源的類器官組織來源的肝癌類器官的培養(yǎng)是指將臨床肝癌病人術(shù)中取得的腫瘤組織運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行體外3D培養(yǎng)，是肝癌類器官培養(yǎng)最常用的方法。其基本步驟是先將組織機(jī)械分離成小塊，然后在37 ℃條件下用膠原酶或中性蛋白酶將其消化成單個(gè)或少許聚集細(xì)胞，消化時(shí)間和外源細(xì)胞污染會(huì)直接影響腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)率，消化的時(shí)間與酶的種類、濃度、消化方式和作用時(shí)間等相關(guān)。有報(bào)道稱用分散酶和0.1% DNase I 37 ℃ 搖床消化0.5 h～2 h即可[14]，而也有文獻(xiàn)用Collagenase D(2.5 mg/mL)消化時(shí)間長(zhǎng)達(dá)120 min-整夜[15]，消化完成后用基底膜提取物(BME)或Matrigel包裹分離得到的細(xì)胞，并按需接種于孔板內(nèi)，加入含有特定眾多生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基便可誘導(dǎo)其分化為多種細(xì)胞類型組成的肝癌類器官，一般2～3 d換1次液。與傳統(tǒng)二維培養(yǎng)的細(xì)胞相似，其也可進(jìn)行傳代，凍存，復(fù)蘇等操作[8]。2017年Broutier等[13]在培養(yǎng)肝癌類器官的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)正常肝臟組織衍生的類器官很快就超過了肝癌組織衍生的類器官，他們?cè)诮?jīng)典的肝臟類器官培養(yǎng)方案的基礎(chǔ)上，去除Noggin和Wnt3a、Respondin-1，添加地塞米松和Rho激酶抑制劑，同時(shí)增加了組織樣本的消化時(shí)間，首次成功培養(yǎng)出肝細(xì)胞癌類器官、膽管細(xì)胞癌類器官和混合細(xì)胞癌類器官。培養(yǎng)出來的類器官重現(xiàn)了起源腫瘤的組織學(xué)特征，且在長(zhǎng)期擴(kuò)增過程中都如此。這無疑是肝癌體外模型的一個(gè)重大突破。2018年Nuciforo等[16]采用在超聲引導(dǎo)下所獲得的針刺活檢組織成功培養(yǎng)出了肝細(xì)胞癌類器官，且將類器官注射入免疫缺陷小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)小鼠肝癌，2019年Cao等[17]成功地從129個(gè)肝組織/腫瘤中培養(yǎng)出91個(gè)細(xì)胞系，這些類器官可以在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)，移植入4～6周齡雌性NOG/JicTa小鼠體內(nèi)的類器官約20%形成了肝腫瘤，雖然類器官的來源相同，但在體內(nèi)的增殖能力卻有明顯差異，值得一提的是，在長(zhǎng)達(dá)32周的長(zhǎng)期培養(yǎng)中肝癌類器官都保持了其原始腫瘤的基因組特征和遺傳異質(zhì)性[16]，證實(shí)了類器官模型的穩(wěn)定性和吻合度。Liu等[18]成功地從小鼠原發(fā)性肝腫瘤中建立了能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)的類器官，可見組織來源的類器官并不只限于人體組織，這使得其構(gòu)建更方便快捷，更具可行性。2020年Driehuis等[15]詳述了如何從各類上皮組織培養(yǎng)得到腫瘤類器官的步驟，并指出其建立的成功與否很大程度取決于所取到的組織標(biāo)本的新鮮度和上皮組織的量。組織來源的肝癌類器官相比于2D培養(yǎng)模型在其應(yīng)用和前景上都顯示出高度的優(yōu)越性。而在培養(yǎng)肝癌類器官時(shí)有一個(gè)特別的現(xiàn)象，低分化肝癌來源的類器官有著近乎100%的成功率，但高分化肝癌則無一例培養(yǎng)成功[9]。Nuciforo等[16]表明患者的臨床相關(guān)特征與其肝細(xì)胞癌類器官成功與否之間無相關(guān)性，但類器官構(gòu)建的成敗與肝細(xì)胞癌的組織病理學(xué)分級(jí)有很強(qiáng)的相關(guān)性：所有的肝細(xì)胞癌類器官都來自低分化腫瘤。提示原發(fā)組織的干性與培養(yǎng)的成功率密不可分，因?yàn)槟[瘤具有高度異質(zhì)性，即使同一種惡性腫瘤也是由不同類型的腫瘤細(xì)胞組成，同一腫瘤組織的不同部位細(xì)胞分化能力也是不同的。故研究者們?cè)谂囵B(yǎng)肝癌類器官時(shí)，會(huì)從同一個(gè)組織不同位置取樣培養(yǎng)。

1.2細(xì)胞來源的類器官通過重編程技術(shù)將細(xì)胞誘導(dǎo)至多能干細(xì)胞狀態(tài)后進(jìn)而分化為各種細(xì)胞類型是肝癌類器官培養(yǎng)的另一方式。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞分化能力與胚胎干細(xì)胞相似，可從皮膚成纖維細(xì)胞,單核白細(xì)胞、尿液中得到[19]，Sun等[20]將SV40LT轉(zhuǎn)染進(jìn)成纖維細(xì)胞后再使得P53，Rb失活，在細(xì)胞增殖能力變強(qiáng)的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染三因子：FOXA3,HNF1A,HNF4A后成功培養(yǎng)出3D肝類器官。然后將c-myc轉(zhuǎn)染進(jìn)肝類器官后誘導(dǎo)60d便培養(yǎng)出了肝癌類器官，其培養(yǎng)出的細(xì)胞表現(xiàn)出明顯緊湊性，顯示高有絲分裂活性，核質(zhì)比明顯增加，與腫瘤表現(xiàn)出高度相似性。目前，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞起源的肝癌類器官還有待進(jìn)一步探索，但其確可代表一個(gè)可通過基因水平的調(diào)控來模擬肝癌發(fā)生和發(fā)展的三維模型[21]。

肝癌細(xì)胞系是建立類器官的另一途徑，但其目前相關(guān)研究較少，有研究表明將肝癌細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞這三種細(xì)胞按照一定比例混合后，可在體外培養(yǎng)出可擴(kuò)增的3D肝癌類器官模型。該模型構(gòu)建方便快捷，可穩(wěn)定增殖，或可成為應(yīng)用最廣的研究肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的模型[22]。

2 肝癌類器官的應(yīng)用

2.1 疾病模型肝癌類器官是一種新型的3D體外研究模型，可在體外模擬重現(xiàn)肝癌疾病，有研究指出患者源性類器官對(duì)化療和放療的體外反應(yīng)以及胰腺癌患者的實(shí)際臨床反應(yīng)具有強(qiáng)相關(guān)性，雖然肝癌類器官尚未有類似的報(bào)道，但其或可成為一種聯(lián)系體內(nèi)和體外的良好疾病模型[23]。利用患者源性肝癌類器官建立足夠大的生物庫，將患者的腫瘤特征與生物庫的類器官匹配，從而讓患者接受不同的治療，也是一個(gè)非常有前景的應(yīng)用方法[23]。還有研究將細(xì)胞來源的肝臟類器官用來研究宿主與肝炎病毒的相互作用[24]，這為攻破病毒性肝病打下了良好的基礎(chǔ)。此外，肝癌類器官模型還可用于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究，并且具有和多種技術(shù)相結(jié)合的應(yīng)用前景[9]。肝癌類器官模型有望成為以后長(zhǎng)期研究肝癌發(fā)生發(fā)展，治療的穩(wěn)定模型。

2.2藥物篩選臨床用藥的篩選模型現(xiàn)應(yīng)用較廣的有2D培養(yǎng)和人源組織異種移植物。但兩者皆有不足，2D培養(yǎng)無法在體外長(zhǎng)期維持肝細(xì)胞的細(xì)胞極性，傳代后容易失去腫瘤的遺傳異質(zhì)性從而偏離原發(fā)腫瘤的特性。無疑增加了藥物真正應(yīng)用于人體上的失敗率。而人源組織異種移植物模型周期長(zhǎng)，成功率低，成本高。腫瘤異質(zhì)性也是現(xiàn)今開發(fā)腫瘤藥物的難點(diǎn)之一，腫瘤異質(zhì)性不僅存在于不同個(gè)體之間，也同樣存在于單個(gè)腫瘤內(nèi)[25]。大規(guī)模測(cè)序研究指示肝癌基因組的異質(zhì)性出乎意料[26]。從不同肝癌患者組織樣本培養(yǎng)得到類器官后，用于一系列藥物的測(cè)試篩選，或許是未來個(gè)體化治療新方向[15]。

新興模型類器官的出現(xiàn)為臨床藥物篩選提供了新設(shè)想，類器官模型展現(xiàn)出培養(yǎng)周期短，有著用于藥物的高通量篩選和基因修飾[27]等優(yōu)勢(shì)。2019年Li等[28]利用人源肝癌類器官建立了27個(gè)肝癌株，篩查了129種抗腫瘤藥物，發(fā)現(xiàn)臨床一線膽管癌治療藥物如索拉菲尼，吉西他濱等在患者間表現(xiàn)出療效異質(zhì)性，并指出未用于肝癌治療的藥物如普卡霉素，伊達(dá)比星等可能有利于治療，這無疑為臨床治療提供了新的選擇。索拉菲尼和瑞戈非尼是臨床治療肝癌常用的靶向藥物，2019年Cao等[17]利用類器官模型來測(cè)試兩者的藥物療效，發(fā)現(xiàn)異體移植腫瘤和原發(fā)腫瘤類器官之間的反應(yīng)性存在明顯差異。次年Wang等[14]利用肝癌組織建立的類器官模型揭示了索拉菲尼可能的耐藥機(jī)制，揭示了利用類器官模型進(jìn)行未來耐藥研究的可能性。

2.3個(gè)性化醫(yī)療個(gè)性化醫(yī)療又稱精準(zhǔn)醫(yī)療，是指針對(duì)不同患者量身定做最佳治療方法。由于腫瘤的異質(zhì)性，個(gè)體差異一直都是臨床藥物治療十分棘手的問題之一，即使在具有相同基因型的患者中，藥物反應(yīng)也是不同的[29]。相比于傳統(tǒng)體外二維培養(yǎng)模型，肝癌類器官在長(zhǎng)達(dá)32周的傳代培養(yǎng)中都保持了其原始腫瘤的基因組特征和遺傳異質(zhì)性[16]?，F(xiàn)建立肝癌類器官的主要方式是取臨床患者的腫瘤樣本進(jìn)行分離，誘導(dǎo)，擴(kuò)增，可將體外培養(yǎng)的類器官進(jìn)行基因型分析，制定適合該模型的治療手段。建立患者衍生的類器官生物數(shù)據(jù)庫用于個(gè)體化篩藥治療也是非常有前景的未來臨床治療方法，數(shù)據(jù)庫可基于篩選結(jié)果在治療上做到針對(duì)性和特異性。

3 難點(diǎn)和不足

肝癌類器官是一種具有廣泛前景的體外研究模型，但其培養(yǎng)的成功率與原始腫瘤的分化程度和腫瘤細(xì)胞的增殖率密不可分[16]，肝細(xì)胞肝癌增值率較低，類器官成功率也較低[30]。這增大了其培養(yǎng)的難度。據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，來源于分化程度高的患者的肝癌類器官的培養(yǎng)暫無成功的例子。其次，十余種昂貴的生長(zhǎng)因子的添加使得研究人員在配制新鮮的培養(yǎng)基時(shí)要注意將其調(diào)整至合適的濃度，生長(zhǎng)因子的具體作用機(jī)制及其相關(guān)聯(lián)系也尚未完全闡明。肝癌類器官缺乏血管、免疫細(xì)胞等多種細(xì)胞類型，并不能完全重現(xiàn)復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境[31]，當(dāng)在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)，類器官中心的細(xì)胞由于缺乏氧供和營養(yǎng)會(huì)出現(xiàn)大量凋亡的現(xiàn)象，研究者應(yīng)密切關(guān)注類器官狀態(tài)和培養(yǎng)時(shí)間及時(shí)進(jìn)行傳代。

4 結(jié)語與展望

腫瘤類器官主要是利用患者的腫瘤組織進(jìn)行體外3D培養(yǎng)用來模擬體內(nèi)腫瘤組織的生物學(xué)特征。相比于常用的2D培養(yǎng)模型，肝癌類器官模型可最大限度地模擬親代腫瘤的基因組及組織學(xué)結(jié)構(gòu)和腫瘤發(fā)生機(jī)制。肝癌類器官模型之所以能在短時(shí)間內(nèi)成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，與其針對(duì)患者個(gè)體化藥物治療的新希望密切相關(guān)，其有望打破異質(zhì)性這一難題，走向肝癌發(fā)生發(fā)展研究的新進(jìn)程。然而，肝癌類器官模型仍存在很大挑戰(zhàn)，基質(zhì)膠支撐的時(shí)間有限，長(zhǎng)期培養(yǎng)需不斷傳代，培養(yǎng)價(jià)格昂貴，構(gòu)建成功率較低，無確定的權(quán)威培養(yǎng)方法等。但相信未來隨著肝癌類器官培養(yǎng)模型的不斷完善，將成為最普及，高效的研究肝癌發(fā)生發(fā)展的體外模型。