趙瑩科 方源 錢麗玲 王偉 吳繼紅

(1.復(fù)旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031； 2.上海市視覺損傷與重建重點實驗室 上海 200031；3.國家衛(wèi)生健康委員會近視眼重點實驗室 上海 200031； 4.中國科學院腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心 上海 200031)

結(jié)晶樣視網(wǎng)膜變性(Bietti crystalline corneoretinal dystrophy，BCD)是一類常染色體隱性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良癥，臨床表現(xiàn)為視網(wǎng)膜上黃白色脂質(zhì)結(jié)晶沉積[1]，伴有視網(wǎng)膜色素上皮萎縮、脈絡(luò)膜硬化，進而出現(xiàn)視力下降、夜盲、視野喪失和色覺受損，甚至發(fā)展為失明。盡管在歐美人群中也有對于BCD的報道，但是BCD在亞洲人群中的發(fā)病率更高[2]。Li等[3]通過對25例患者進行基因關(guān)聯(lián)分析，首次確定染色體4q35是BCD患者遺傳缺陷的高發(fā)區(qū)域，并在23例患者中發(fā)現(xiàn)了CYP4V2基因的突變。

CYP4V2基因共包含11個外顯子，編碼的蛋白屬于細胞色素P450家族的成員。屬于P450家族4的一員，表明CYP4V2是脂肪酸ω-羥化酶。CYP4V2被認為能夠催化中等鏈長的脂肪酸，肉豆蔻酸、月桂酸、棕櫚酸和多不飽和脂肪酸(PUFAs)，后者包括花生四烯酸(A.A.)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)等[4]。目前主要認為CYP4V2可以影響脂肪酸代謝，但是CYP4V2的特異性底物尚不清楚，突變?nèi)绾胃蓴_脂肪酸代謝從而引起視網(wǎng)膜變性的具體作用機制也未明確。

基因修飾動物模型是在活體動物上開展基因功能研究、尋找合適藥物作用靶點的重要工具[5]。盡管既往已經(jīng)有許多學者[6]報道了CYP4V3基因敲除鼠的相應(yīng)表型及可能存在的機制，但是仍無法完全反映人類BCD的病變特征。因此，基于人的突變位點構(gòu)建人源化動物模型，對于BCD的發(fā)病機制以及基因治療藥物的開發(fā)，意義重大[7]。

表 1 用于構(gòu)建供體質(zhì)粒的PCR引物序列

1 材料與方法

1.1 人CYP4V2致病位點的篩查 首先利用gnomAD在線數(shù)據(jù)庫檢索CYP4V2功能失活突變；同時利用ClinVar數(shù)據(jù)庫檢索CYP4V2致病突變情況。綜合分析，確定人CYP4V2明確的高頻強致病變異位點。

1.2 線性供體的構(gòu)建與鑒定 確定突變位點后，從人的胚胎干細胞基因組上選取突變區(qū)域共408 bp的序列(含1091-2 A＞G)，以及該突變前910 bp，還有供體左右同源臂(HAL：801 bp； HAR：820bp)，應(yīng)用Tild-Crispr方法構(gòu)建供體質(zhì)粒(圖1)，具體構(gòu)建方法和同源臂設(shè)計見文獻[8]。供體質(zhì)粒的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物序列如表1所示。

圖 1 CYP4V3人源化小鼠供體質(zhì)粒圖譜

1.3 Cas9 mRNA與sgRNA的構(gòu)建 將T7啟動子以及Cas9的編碼區(qū)通過在px260載體進行連接，PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化，使用mMESSAGE mMACHINE T7(Life Technologies)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄，得到Cas9 mRNA。此外，依據(jù)tild-CRISPR已發(fā)表的方法構(gòu)建sgRNA模板，通過與Cas9 mRNA類似的體外轉(zhuǎn)錄方法，得到sgRNA。Cas9 mRNA和sgRNA產(chǎn)物均使用MEGA clear (Life Technologies)試劑盒進行純化。

1.4 小鼠受精卵顯微注射 超排雌性C57BL/6小鼠(7～8周齡)通過先注射5 IU孕馬血清促性腺激素(PMSG)、48 h后注射5 IU人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，hCG)與雄性小鼠交配，并在注射hCG后20 h從輸卵管收集受精胚胎。使用具有恒定流量設(shè)置的FemtoJet顯微注射器將Cas9 mRNA、sgRNA和線性供體質(zhì)粒在含有5 μg/mL松弛劑的液滴中混合并注射到小鼠受精卵中。

1.5 小鼠基因型鑒定 小鼠出生1周后，使用TIANamp Genomic DNA Kit (TIANGEN,DP304-03)從腳趾或尾巴樣本中提取小鼠基因組DNA。使用設(shè)計用于擴增正確靶向連接的引物進行PCR擴增(表2、3)。ExTaq在95 °C下激活3 min，然后在 95 °C 30 s、60 °C 30 s和 72 °C 1 min進行 38 個循環(huán)，最后在 72 °C下延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化和測序。

表 2 用于鑒定疾病模型小鼠是否攜帶供體片段的PCR引物序列

表 3 用于鑒定攜帶1091-2 A＞G突變的CYP4V3人源化小鼠CYP4V3 mRNA splice mutant的PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 人CYP4V2致病位點的篩查結(jié)果 結(jié)合gnomAD與ClinVar上關(guān)于質(zhì)變變異的突變數(shù)據(jù)，gnomAD共收錄860種突變，其中明確致病的突變有24種；ClinVar數(shù)據(jù)庫中共檢索到560個突變信息，其中致病突變144個，30個致病位點與BCD相關(guān)。將gnomAD與ClinVar的致病信息取交集，得到12個變異位點，認為這12個是較為明確的致病位點(表4)。根據(jù)課題組既往對于基于我國眼遺傳病患者基因突變情況的臨床研究，最終選定CYP4V2c.1091-2 A＞G作為后續(xù)人源化動物模型的致病突變位點。在Ensmbl數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)出小鼠CYP4V3基因序列，與人CYP4V2基因進行比對，發(fā)現(xiàn)人CYP4V2c.1091-2 A＞G基因與小鼠相應(yīng)區(qū)域序列一致性較高(圖2)。

表 4 gnomAD與ClinVar中收錄的CYP4V2致病突變情況

圖 2 人CYP4V2與鼠CYP4V3基因序列的比較 其中紅色堿基代表外顯子區(qū)域，藍色標志為人、鼠一致的基因序列。紅框所示c.1091-2，為本研究確定的突變區(qū)域，可見人、鼠在該區(qū)域的序列一致。

2.2CYP4V3人源化小鼠在DNA水平構(gòu)建成功 如圖3所示，通過二代測序結(jié)果可以確定，構(gòu)建完成的基因編輯鼠在CYP4V31091-2的位置發(fā)生了A＞G的突變。攜帶1091-2 A＞G突變的CYP4V3人源化小鼠參考序列包括人工插入替換的攜帶1091-2 A＞G突變?nèi)嗽磧?nèi)含子部分以及人源CYP4V2中原本具有的第11個外顯子部分。經(jīng)測序，陽性小鼠的序列完全符合陽性小鼠參考序列的堿基排列，1091-2位置的A已經(jīng)突變?yōu)镚，并有干凈穩(wěn)定的峰圖；而野生型作為對照，不含有人工插入替換的人源內(nèi)含子部分，但含有野生型小鼠CYP4V3基因第11個外顯子部分。

圖 3 攜帶1091-2 A＞G突變的CYP4V3人源化小鼠在DNA水平上構(gòu)建成功

為了保證得到的小鼠模型能夠模擬人體內(nèi)的情況，為今后的臨床篩查做準備，我們將小鼠CYP4V3基因的第9和第10個外顯子，包括其中的內(nèi)含子，完全替換成了人源。由于1091-2 A＞G突變位點正好在人第9個外顯子前的內(nèi)含子的堿基最后一位，我們將第9個外顯子前的內(nèi)含子后910 bp也替換成了人源內(nèi)含子。因此，一共需要將910 bp攜帶點突變的內(nèi)含子及其后的第9、10兩個外顯子替換成人源。確定好替換方案后，在需要替換的基因前后分別設(shè)計了4個sgRNA識別位點，體外驗證這8個sgRNA的工作效率，希望通過基因編輯的方式將野生型小鼠里的這段整段敲除，并替換成攜帶1091-2 A＞G突變的CYP4V3人源化片段。

經(jīng)過對插入片段的完整測序，我們確認插入段堿基與陽性小鼠參考序列對比一致，且測序峰圖干凈單一，排除因測序過程帶來的實驗誤差。此外，我們用野生型小鼠對比測序，發(fā)現(xiàn)野生型小鼠沒有插入片段，且CYP4V3基因的第9個外顯子與陽性小鼠參考序列斷斷續(xù)續(xù)有部分堿基重合，證明小鼠和人的CYP4V3基因第9個外顯子有一定的同源性。至此，我們在DNA水平上證明了攜帶1091-2 A＞G突變的CYP4V3人源化小鼠構(gòu)建成功。

2.3 無法判斷攜帶1091-2 A＞G突變的CYP4V3人源化小鼠CYP4V3mRNA 是否產(chǎn)生剪切突變 根據(jù)臨床上的報道[9]，CYP4V2基因上攜帶有1091-2 A＞G突變患者的mRNA在加工過程中會產(chǎn)生剪切突變，從而跳過整個第9號外顯子，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。如圖4所示，我們?nèi)?gòu)建完成的基因編輯鼠視網(wǎng)膜處的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，并對得到的cDNA進行測序后發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建完成的小鼠會在小鼠第8號外顯子和人的第9號外顯子中間產(chǎn)生無規(guī)則序列，并導(dǎo)致后續(xù)一系列堿基異常表達，既無法判斷其是否跳過了第9號外顯子導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生，也無法判斷其是否能夠讓第8、9號外顯子正常表達。

圖 4 攜帶1091-2 A＞G突變的CYP4V3人源化小鼠cDNA測序結(jié)果

3 討論

本研究中，我們通過應(yīng)用Tild-CRISPR技術(shù)，成功將攜帶1091-2 A＞G突變的人CYP4V2基因片段408 bp導(dǎo)入了小鼠CYP4V3基因，DNA測序結(jié)果提示，本次實驗成功地引入了1091-2 A＞G突變，對于后續(xù)CYP4V2基因的研究具有重要的借鑒意義。

盡管CYP4V2基因全身均有表達，但是目前數(shù)據(jù)庫中記錄CYP4V2基因突變僅引起眼部病變，由于CYP4V2蛋白活性異常導(dǎo)致的脂肪酸代謝紊亂并不能完全解釋這一現(xiàn)象，因此探索其發(fā)病機制、尋找有針對性的治療手段，阻斷這一常見致盲性眼病進程，具有重要的臨床價值。通過誘導(dǎo)CYP4V2突變患者的干細胞并分化形成視網(wǎng)膜色素上皮層(retinal pigment epithelium，RPE)，Hata等[10]報道了CYP4V2突變的RPE細胞中葡糖苷酰鞘氨醇(GlcCer)的累積以及膽固醇酯的減少。這與此前研究人員在CYP4V2突變患者成纖維細胞上，應(yīng)用放射性同位素標記觀察到脂肪酸向n-3多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化減少[11]，共同說明了CYP4V2突變可引起了體內(nèi)脂質(zhì)代謝的多個環(huán)節(jié)異常，破壞了細胞內(nèi)的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[12]。但是CYP4V2突變產(chǎn)生的具體分子生物學效應(yīng)，目前仍不清楚。因此我們應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，開展了對攜帶人CYP4V2熱點突變的模式動物的探索。

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)的發(fā)展，使得組織、細胞基因水平的原位糾正變?yōu)楝F(xiàn)實，也推動了基因治療領(lǐng)域的極大發(fā)展。Cas9切割后產(chǎn)生的雙鏈斷裂，在沒有模板存在的情況下，會利用非同源末端連接的方式進行修復(fù)；而在有修復(fù)模板的時候，DNA斷端可以通過高保真的同源重組方式，將模板DNA序列精確插入到目標DNA序列中。非同源末端連接的發(fā)生率非常高，而同源重組的發(fā)生率較低。tild-CRISPR是由中國科學院腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心楊輝教授團隊報道的一種新型基因打靶策略，其優(yōu)勢在于更高的DNA敲入效率[8]。同時對于插入片段的大小從800 bp到6 000 bp都能夠精確整合到不同的位點。與以往的基因編輯方式不同，tild-CRISPR采用的是線性的DNA供體，可以顯著提高基因編輯的效率。在本研究中，我們應(yīng)用tild-CRISPR成功替換了小鼠基因組上的408 bp。DNA水平，小鼠CYP4V3基因序列中成功實現(xiàn)了攜帶人源1091-2 A＞G點突變序列的同源定點替換；RNA水平，利用反轉(zhuǎn)錄PCR分析cDNA序列，發(fā)現(xiàn)突變小鼠cDNA在1091-2 A＞G點突變序列附近發(fā)生了錯誤的可變剪切，這與臨床上攜帶1091-2 A＞G點突變的患者表型一致。然后在后續(xù)的表型鑒定中，我們并沒有發(fā)現(xiàn)與預(yù)期一致的蛋白水平表達變化(數(shù)據(jù)未展示)，提示錯誤的可變剪切可能并未改變CYP4V3總體的蛋白水平。考慮到該病的發(fā)病周期個體差別較大，未來我們將對模型進行更長周期的觀察以及表型的鑒定。

綜上所述，我們利用CRISPR/Cas技術(shù)，成功制備了攜帶患者特異性遺傳突變的小鼠模型，為以后深入探索CYP4V21091-2 A＞G點突變的致病機制以及開發(fā)相應(yīng)的基因治療藥物奠定了基礎(chǔ)。