喬云圣 陳宇虹 孫興懷 陳雪莉 陳君毅

(復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031)

正常眼壓性青光眼(normal tension glaucoma,NTG)的特點是在沒有眼壓升高(未經(jīng)治療眼壓＜21 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)以及房角開放的情況下出現(xiàn)青光眼性視神經(jīng)萎縮和相應(yīng)的視野缺損[1]。在中國人口中，NTG發(fā)病率約為1%，占所有原發(fā)性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma, POAG)病例的70%[2]?？紤]到NTG患者的眼壓處于正常范圍，研究者提出了其他病理生理學(xué)假說，包括血管功能障礙[3]、跨篩板壓力梯度增加[4-5]、免疫疾病[6-7]以及遺傳缺陷[8-9]等。

青光眼性視野改變是由于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell, RGC)的損傷和丟失。RGC發(fā)出的軸突直到篩板后才被髓鞘包繞[10]，為了完成電信號的傳遞，需要線粒體提供大量能量。據(jù)估計，每個細胞都含有數(shù)百個線粒體，每個線粒體都有2～10套DNA拷貝，即線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)[11]。mtDNA編碼13種蛋白質(zhì)(氧化磷酸化的重要亞單位)、22種tRNA和2種rRNA[12]。除mtDNA外，許多核基因也參與構(gòu)建和維持線粒體的結(jié)構(gòu)和功能[13]。

目前已有許多疾病確定為線粒體病，例如：Leber遺傳性視神經(jīng)病變[14]、線粒體腦肌病伴乳酸酸中毒和卒中樣發(fā)作(MELAS)[15]和母系遺傳的Leigh綜合征[16]等。而OPA1(一種調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜融合的核基因)的變異可以引起常染色體顯性遺傳的視神經(jīng)萎縮[17]。越來越多的研究提示，POAG與線粒體基因組突變以及單倍群之間可能存在聯(lián)系[18-21]。在其他神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病和帕金森病中，研究者也觀察到由遺傳因素引起的線粒體功能障礙[22]。

在本研究中，我們將核編碼的線粒體基因和mtDNA基因結(jié)合起來定義為線粒體相關(guān)基因組(參考MitoCarta2.0[13])，并首次嘗試通過高通量測序來探究其變異與NTG的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 資料 本研究納入了自2017年6月～2018年2月在本院治療的10例NTG患者、10例高眼壓性原發(fā)性開角型青光眼(high tension POAG, HTG)患者和10例年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract,ARC)患者。所有患者均為漢族，彼此之間沒有親屬關(guān)系?；颊叱浞至私庋芯磕康?、取樣方法、可能的風(fēng)險和益處。每個參與者都簽署了知情同意書。本研究獲得了復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院人類研究倫理委員會的批準(zhǔn)，并遵守《赫爾辛基宣言》的基本原則。

NTG診斷標(biāo)準(zhǔn)：存在青光眼性視神經(jīng)病變，包括盤沿丟失和對應(yīng)的視野缺損，房角開放，21 h眼壓監(jiān)測值正常(＜21 mmHg)。HTG的診斷標(biāo)準(zhǔn)與NTG相同，只是眼壓高于正常上限(＞21 mmHg)。ARC組納入標(biāo)準(zhǔn)：裂隙燈下觀察到晶狀體混濁，同時標(biāo)準(zhǔn)對數(shù)視力表檢查視力≤0.5。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有繼發(fā)性青光眼(青光眼睫狀體炎綜合征、色素播散性青光眼、假性脫落綜合征、葡萄膜炎等)；患有其他視力和視野受損的眼科疾病(視網(wǎng)膜色素變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性、病理性近視等)或有眼部表現(xiàn)的遺傳性疾病。

1.2 方法 二代測序：使用High Pure PCR Template Preparation試劑盒(Roche，Basel，CH)從患者外周靜脈血樣本中提取基因組DNA。使用定制測序panel對37個mtDNA編碼基因和1121個核編碼線粒體基因[13]進行靶向富集與擴增。文庫構(gòu)建后使用Illumina Hiseq2500 測序平臺 (Illumina,San Diego,CA,USA)進行高通量測序。使用Burrows–Wheeler Aligner (版本0.7.11)經(jīng)過初步質(zhì)控，讀段與劍橋參考序列修訂版(revised Cambridge Reference Sequence，rCRS)和人類基因組hg19進行比對。使用GATK(版本3.3)找到變異位點，使用ANNOVAR[23]對插入缺失位點(indels)和單核苷酸變異(single nucleotide variations,SNV)進行注釋。

致病性預(yù)測：對于mtDNA變異，變異位點使用Mitomaster[24]進一步注釋。符合以下標(biāo)準(zhǔn)的錯義突變將被視為致病。①罕見變異：次等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)＜0.5%(基于GenBank頻率)；②異質(zhì)性＞80%；③進化保守性＞60%；④非同義突變；⑤未在對照組中出現(xiàn)；⑥文獻報道為致??；⑦單倍群特異性。應(yīng)用PON-mt-tRNA[25]、MitoTIP[26]和MSeqDR mvTool[27]來注釋和評估tRNA突變；由于沒有可用的注釋工具，rRNA基因的變異通過查閱文獻進行評估。

對于核基因變異，符合以下標(biāo)準(zhǔn)的變異被認為是致病的。①罕見變異：MAF(在國際千人基因組計劃、gnomAD_genome、gnomAD_Exon、ESP6500、CG69和ExAC數(shù)據(jù)庫中取最高值)＜1%；②無義、移碼、剪接位點和起始密碼子突變；③在ClinVar數(shù)據(jù)庫中被列為“致病”和“可能致病”的變異。符合以下標(biāo)準(zhǔn)的非同義突變將被納入后續(xù)分析：①MAF＜1%；②預(yù)測軟件(SIFT、Polyphen2、PROVEAN、MutationTaster和MutationAssessor)中至少有4個給出有害預(yù)測；③GERP++得分＞3，PhyloP 100way_vertebrate得分＞1.5。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Stata 15.1和R 3.5.2進行統(tǒng)計分析。應(yīng)用Fisher精確檢驗來比較3組之間的變異頻率差異，采用Pearson卡方檢驗比較線粒體單倍群在各組間的分布差異。對于定量數(shù)據(jù)，采用Kruskal-Wallis檢驗，通過Mann-Whitney檢驗進行事后多重比較，并通過Bonferroni法調(diào)整校正P值。差異顯著性閾值設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 mtDNA 變異分布 本次測序總共檢測到296個變異(ARC組157個，NTG組130個，HTG組158個)，詳見圖1。NTG組的轉(zhuǎn)換(transition,Ts)與顛換(transversion,Tv)之比(Ts/Tv)以及非同義突變平均數(shù)量較高(表1)，然而差異不具統(tǒng)計學(xué)意義。mtDNA基因間變異分布的比較：與ARC組相比，NTG組在12S rRNA基因中含有較少的罕見突變(NTG組0.1個/人，ARC組0.7個/人，P=0.009)。根據(jù)編碼產(chǎn)物可將mtDNA分為幾個功能區(qū)，即rRNA區(qū)(12S和16S)、復(fù) 合 體Ⅰ區(qū)(MT-ND1～6和MT-ND4L)、復(fù)合體Ⅲ區(qū)(MT-CYB)、復(fù)合體Ⅳ區(qū)(MT-CO1～3)和ATP合成酶區(qū)(MT-ATP6和MTATP8)，tRNA編碼區(qū)因其突變少而被排除。與ARC組相比，NTG組在rRNA區(qū)域含有較少的罕見變異(NTG組1.1個/人，ARC組1.7個/人，P=0.009)。

圖 1 mtDNA變異分布 外圈表明了各個基因在mtDNA上的相對位置及大小。中圈的空心圓點標(biāo)示了各個變異的位置。內(nèi)圈的實心圓點指示了各變異的出現(xiàn)頻次。其中黑色代表僅在ARC組出現(xiàn)的變異，紅色代表僅在NTG組出現(xiàn)的變異，綠色代表僅在HTG組出現(xiàn)的變異，藍色代表任意2組或3組中均存在的變異。

表 1 各類型罕見mtDNA突變平均數(shù)量在3組中的分布

2.2 線粒體單倍型分布 各組的單倍型分布列于表2。此患者群體共涉及8個亞型，包括M大類(D、M7)和N大類(H、B、A、F、R9、N9)。根據(jù)大類劃分數(shù)據(jù)時，分布差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.366)。

表 2 3組患者的線粒體單倍型分布(人)

2.3 線粒體相關(guān)核基因組變異分布 二代測序共檢測到1 881個突變(ARC組1 276個，NTG組1 331個，HTG組1 214個)，涉及754個基因(ARC組615個，NTG組641個，HTG組599個)。與ARC組相比，NTG組含有更多的缺失(NTG組8.5個/人，ARC組6.1個/人，P=0.006)和罕見的移碼突變(NTG組1.6個/人，ARC組0.1個/人，P=0.002)，與HTG組相比，NTG組的總突變數(shù)(NTG組557.7個/人，ARC組525.5個/人，P=0.005)和罕見突變數(shù)(NTG組34.8個/人，ARC組26.7個/人，P=0.002)更多，且罕見突變占總突變數(shù)比值更大(NTG組6.2%，ARC組5.1%，P=0.005)。

2.4 線粒體相關(guān)核基因組變異致病性分析 變異致病性評價的標(biāo)準(zhǔn)如“方法”一節(jié)所述。共有149個變異被認為是可能致病的(ARC組51個，NTG組59個，HTG組50個，P=0.491)，涉及127個基因(ARC組45個，NTG組52個，HTG組47個，P=0.647)。雖然差異無統(tǒng)計意義，但是NTG組均為最高。

3 討論

NTG缺乏青光眼的主要風(fēng)險因素，即眼壓升高。對潛在病理生理機制的探索有助于更好地理解疾病本質(zhì)。在本研究中，我們推測遺傳因素引起的線粒體功能障礙可能會導(dǎo)致NTG，因此對線粒體相關(guān)基因組進行測序，以探索可能的關(guān)聯(lián)。

青光眼的根本病理改變是RGC損傷，表現(xiàn)為典型的視神經(jīng)萎縮和視野缺損[10]。RGC發(fā)出的軸突構(gòu)成視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層，最終在視乳頭處匯集[28]。RGC的軸突內(nèi)含有大量線粒體[29]，側(cè)面反映了其高度的能量需求。三磷酸腺苷(ATP)的合成過程可產(chǎn)生大量活性氧，使mtDNA面臨額外的損傷風(fēng)險。事實上，mtDNA突變隨著年齡的增長而累積[30]，并被認為與年齡相關(guān)疾病和衰老本身相關(guān)[31]。綜上所述，mtDNA突變符合NTG發(fā)病的時間性(老年)和空間性(RGC損傷)特征，提示mtDNA突變與NTG發(fā)病相關(guān)。

高通量測序技術(shù)的進步極大促進了遺傳學(xué)研究。然而，測序偏差、生物信息大數(shù)據(jù)的處理等問題仍然阻礙了它在某些領(lǐng)域的應(yīng)用。就mtDNA而言，其異質(zhì)性[22]和鑲嵌性[32]現(xiàn)象對測序技術(shù)的準(zhǔn)確性提出了更高要求。Piotrowska-Nowak等[33]用Sanger測序和限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)驗證了二代測序檢測到的每個mtDNA變異。他們還證明，二代測序技術(shù)可以檢測到異質(zhì)性低至5%的變異。在更高的測序深度下，可以捕獲異質(zhì)性只有1%的突變[34]。

已有許多研究報道了線粒體單倍群與青光眼之間的關(guān)系。在沙特阿拉伯人[35]和非裔美國人[20]中發(fā)現(xiàn)L單倍群與POAG有關(guān)，這與POAG在后者人口中的發(fā)病率較高相符[36]。另一方面，N1單倍群可能是高加索人種患青光眼的一個保護因素[35]。在波蘭的一項關(guān)于NTG的線粒體基因組研究[33]中，與對照組(ARC)相比，H1單倍群在病例組中的所占比例較大。

在本研究中，NTG組在mtDNA中含有較少的變異，但在線粒體相關(guān)核基因組中含有更多的變異。例如我們觀察到NTG組在12S rRNA以及rRNA區(qū)域的罕見變異比對照組少。Piotrowska-Nowak等[33]在其對照組中發(fā)現(xiàn)一些變異的頻率較高。其中一些變異也在我們的樣本中檢測到，如：m.93A＞G、m.310T＞C、m.14470T＞C，并且只出現(xiàn)在對照組。同樣地，Singh等[18]報道，對照組中MT-ND2的罕見變異多于POAG患者。這些發(fā)現(xiàn)可能表明，罕見變異并不總是意味著較高的疾病風(fēng)險，而可能為保護因素。另一項韓國的病例對照研究[37]在NTG患者中報道了3個與疾病相關(guān)的變異：m.4883C＞T(MTND2:P138P)、m.9540T＞C(MT-CO3:L112L)、m.14766C＞T(MT-CYB:T7I)，且m.4883C＞T與 更 嚴(yán)重的視野缺損有關(guān)。然而，我們在研究中發(fā)現(xiàn)，前2個變異均勻分布在3組中，并且m.4883C＞T是D單倍型的標(biāo)記變異，在亞洲人群中比較常見。因此，對單倍型的忽視可能導(dǎo)致錯誤的相關(guān)性。

核基因組對線粒體功能的貢獻甚至比mtDNA本身更大。MitoCarta[13]已經(jīng)確定了一千多個線粒體相關(guān)基因。線粒體相關(guān)基因組的變化有可能會導(dǎo)致各種疾病。常染色體顯性遺傳的視神經(jīng)萎縮(ADOA)是由OPA1基因突變引起的，OPA1編碼一種線粒體內(nèi)膜蛋白，調(diào)節(jié)線粒體的融合和分裂[38]。既往研究[39-40]表明，一些線粒體相關(guān)核基因與POAG和NTG有關(guān)，包括OPA1、MFN1、MFN2、PARL等。我們的研究也檢測到了這些基因的變異。然而，在對突變頻率、類型和組間分布進行過濾后，它們都不被認為是致病的。

綜上所述，我們首次在中國患者中使用靶向二代測序技術(shù)探索NTG與線粒體相關(guān)基因組的關(guān)聯(lián)，這為NTG發(fā)病機制的研究提供了有益參考。同時，我們也納入了HTG患者，希望能在線粒體相關(guān)基因組方面區(qū)分這2種疾病。然而，我們的研究也存在一些不足：①研究群體較??；②從外周血樣中提取DNA，不能反映RGC的實際情況；③沒有用Sanger測序驗證所有變異。但我們的初步探索能夠提示NTG和線粒體遺傳學(xué)之間存在關(guān)聯(lián)。某些變異的存在可能是保護因素，當(dāng)然這需要更大的隊列和深入的試驗來證實。