李亞 郭慶歌 游雅 劉長(zhǎng)庚 李舒茵 雷博

(河南省人民醫(yī)院 鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 河南省立眼科醫(yī)院 河南省眼科疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 鄭州 450003)

Leber先天性黑矇(Leber congenital amaurosis,LCA)是一種嬰兒期起病，表型嚴(yán)重的視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良疾病，是導(dǎo)致失明的重要原因之一[1-2]。LCA在全世界的發(fā)病率約為3/100 000，具有較強(qiáng)的臨床表型和遺傳異質(zhì)性[2]。其主要臨床表現(xiàn)為視力下降、眼球震顫和嚴(yán)重的視網(wǎng)膜功能障礙。

目前發(fā)現(xiàn)有25個(gè)基因可導(dǎo)致LCA，包括AIPL1、CABP4、CCT2、CEP290、CLUAP1、CRB1、CRX、DTHD1、GDF6、GUCY2D、IFT140、IQCB1、KCNJ13、LCA5、LRAT、NMNAT1、PRPH2、RD3、RDH12、RPE65、RPGRIP1、SPATA7、TULP1、IMPDH1和OTX2(https://web.sph.uth.edu/RetNet/sumdis.htm#B-diseases)。雖有少數(shù)常染色體顯性遺傳LCA病例報(bào)道，但LCA最常見的遺傳方式為常染色體隱性遺傳[3-4]。這些基因在維持視網(wǎng)膜正常功能中起著重要作用，如光轉(zhuǎn)導(dǎo)、視覺循環(huán)、光感受器發(fā)育、鳥嘌呤合成和光感受器內(nèi)纖毛運(yùn)輸?shù)萚4-9]。在這些基因中，LCA5基因突變約占LCA患者的2%[10]。

LCA5基因位于6q14.1，編碼一種高度保守的80 kDa的纖毛蛋白。LCA5蛋白由697個(gè)氨基酸組成，包含2個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)域[11]。LCA5在發(fā)育過程中廣泛表達(dá)，但其變異導(dǎo)致的功能異常只引起視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良，說明LCA5蛋白在維持視網(wǎng)膜功能中起到重要作用。到目前為止，已報(bào)道的LCA5基因突變有57個(gè)，包括29個(gè)錯(cuò)義突變/無義突變、4個(gè)剪接突變、17個(gè)缺失突變、6個(gè)插入突變和1個(gè)插入缺失突 變(https://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=LCA5)。除了LCA之外，LCA5基因突變還可以引起早發(fā)型視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良(early-onsetretinal dystrophy,EORD)、視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)及視錐細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良(cone dystrophy，CD)[12-13]。

LCA5變異相關(guān)先天性黑矇在國(guó)內(nèi)很少報(bào)道。本研究結(jié)合臨床檢查和目的區(qū)域高通量測(cè)序?qū)?個(gè)LCA家系進(jìn)行臨床診斷和遺傳分析，探索LCA新的致病變異，拓展LCA5基因突變和臨床表型譜。

1 資料與方法

1.1 資料 本研究經(jīng)河南省立眼科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。遵循《赫爾辛基宣言》的基本原則，所有受試者均簽署了知情同意書。受檢者來自河南省立眼科醫(yī)院，包含1例LCA患者和2個(gè)家系成員。所有受試者均接受了眼科臨床檢查，包括最佳矯正視力(best corrected visual acuity，BCVA)、眼底照相、掃頻光學(xué)相干層析成像(swept-source optical coherence tomography，SS-OCT)、自發(fā)熒光和視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取和目的區(qū)域測(cè)序 采集家系中3個(gè)受試者的外周血，通過全血DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA抽提，用Nanodrop進(jìn)行濃度和純度的檢測(cè)，保存于-20 ℃。對(duì)先證者采用自行研發(fā)的視網(wǎng)膜遺傳病基因檢測(cè)Panel試劑盒(PS400)對(duì)376個(gè)視網(wǎng)膜遺傳病相關(guān)基因的外顯子、相鄰50 bp內(nèi)含子區(qū)域以及已報(bào)道的內(nèi)含子變異進(jìn)行二代測(cè)序，平均測(cè)序深度為200X。采用3個(gè)商業(yè)軟件(XYGeneRanger 2.0，上海尋因生物科技有限公司；TGex，上海閃譯生物科技有限公司；EGIS，上海瀚垚生物醫(yī)學(xué)科技有限公司)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行變異位點(diǎn)分析篩查，人類基因組參考序列為hg19。通過ExAC、gnomAD、1000Genomes公共數(shù)據(jù)庫對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行過濾，排除低質(zhì)量變異和MAF＞2%的變異[14-16]。

1.2.2 生物信息學(xué)分析和Sanger測(cè)序驗(yàn)證 為評(píng)估變異的致病性，使用Mutation Taster、SIFT、Polyphen-2、CADD及PROVEAN等軟件對(duì)變異位點(diǎn)的致病性進(jìn)行分析預(yù)測(cè)[14-16]。通過GERP++(http://mendel.stanford.edu/SidowLab/downloads/gerp/index.html)、Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)和Weblogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)對(duì)變異位點(diǎn)保守性進(jìn)行分析。對(duì)篩選出的位點(diǎn)在家系內(nèi)通過Sanger測(cè)序進(jìn)行家系共分離驗(yàn)證。根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)發(fā)布的《序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南》對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行致病性評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床表型 先證者Ⅱ-4，女性，16歲，自幼雙眼視力差，伴雙眼眼球震顫。BCVA：右眼0.05(＋1.5 DS/-2.25 DC×5°)，左眼0.05(＋2.25 DS /-2.25 DC×160°)。右眼外上斜。雙眼前節(jié)無明顯異常，眼底視網(wǎng)膜色素紊亂，呈斑駁樣改變。自發(fā)熒光示黃斑區(qū)呈弱熒光背景下的強(qiáng)自熒光，中周部視網(wǎng)膜散在點(diǎn)片狀弱熒光。SS-OCT示雙眼外層視網(wǎng)膜萎縮變薄，僅黃斑中心凹局部橢圓體帶殘留，視盤層間團(tuán)狀高反射。ERG呈熄滅型改變(圖1)。

圖1 先證者的臨床檢查資料 A和B.眼底彩照；C和D.眼底自發(fā)熒光；E和F.SS-OCT；G和H. ERG結(jié)果。A、C、E和G為右眼；B、D、F和G為左眼。

先證者姐姐有相似癥狀，但未就診。母親(Ⅰ-2)和哥哥(Ⅱ-3)眼部無明顯異常。

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果 通過目的區(qū)域高通量測(cè)序，檢測(cè)到先證者Ⅱ-4攜帶LCA5基因2個(gè)新的復(fù)合雜合突變c.91C＞T(p.Gln31X)和c.1457_1460delins21bp(p.Tyr486fs*113)，詳見圖2。c.91C＞T(p.Gln31X)是一個(gè)新的無義突變，位于LCA5基因的3號(hào)外顯子。該變異 在gnomAD(EAS)、ExAC(EAS)、1000Genomes等數(shù)據(jù)庫中未出現(xiàn)過。Mutation Taster和CADD預(yù)測(cè)該變異有害，GERP++顯示其影響的氨基酸高度保守。通過Clustal Omega軟件對(duì)p.Gln31位點(diǎn)在多物種間進(jìn)行多重序列比對(duì)分析以及Weblogo分析表明該位點(diǎn)具有高度保守性(圖3)。根據(jù)ACMG發(fā)布的指南，該變異為疑似致病性變異(likely pathogenic)：PVS1+PM2_Supporting。c.1457_1460delins21bp(p.Tyr486fs*113)是一個(gè)新的移碼突變，位于9號(hào)外顯子。該變異在gnomAD(EAS)、ExAC(EAS)、1000Genomes等數(shù)據(jù)庫中未出現(xiàn)過。根據(jù)ACMG發(fā)布的指南，該變異為疑似致病性變異：PVS1+PM2_Supporting。Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果表明，先證者母親(Ⅰ-2)和哥哥(Ⅱ-3)均攜帶c.1457_1460delins 21bp(p.Tyr486fs*113)雜合變異，未攜帶c.91C＞T(p.Gln31X)變異，符合家系共分離。

圖2 LCA家系圖及Sanger測(cè)序圖

圖3 LCA5基因p.Gln31位點(diǎn)的保守性分析 A.利用Clustal Omega軟件對(duì)p.Gln31位點(diǎn)在不同物種間進(jìn)行多重序列比對(duì)；B.利用Weblogo對(duì)p.Gln31位點(diǎn)的保守性進(jìn)行分析，橫坐標(biāo)代表氨基酸的位置，縱坐標(biāo)代表氨基酸的保守性，高度越高保守性越強(qiáng)。

3 討論

LCA是一種高致盲率的遺傳性視網(wǎng)膜疾病?；颊咄ǔ１憩F(xiàn)為視力下降、眼球震顫、眼底色素沉積以及嚴(yán)重的ERG異?；蛳纭１狙芯客ㄟ^目的區(qū)域高通量測(cè)序在1個(gè)LCA家系中檢測(cè)到LCA5基因的2個(gè)新復(fù)合雜合突變c.91C＞T(p.Gln31X)和c.1457_1460delins21bp(p.Tyr486fs*113)。在早發(fā)性視網(wǎng)膜變性疾病中，LCA5相關(guān)LCA表型較為嚴(yán)重，從兒童早期就出現(xiàn)嚴(yán)重的視力障礙和視網(wǎng)膜黃斑中心凹組織結(jié)構(gòu)異常[11-13,17-24]。與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的一致，本研究中先證者自幼視力差，視網(wǎng)膜層間結(jié)構(gòu)紊亂，ERG呈熄滅型。

LCA5基因由9個(gè)外顯子組成，其中7個(gè)外顯子編碼LCA5蛋白。LCA5蛋白在光感受器連接纖毛中表達(dá)，與光感受器內(nèi)外節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)中所需的纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互作用，在光感受器外段形成中發(fā)揮重要作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)2個(gè)人類LCA5變異被引入HEK293T細(xì)胞后，LCA5變異蛋白在細(xì)胞中鞭毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)(IFT)機(jī)制被破壞[25]。自2007年den Hollander等[11]首次在LCA患者中報(bào)道LCA5突變以來，越來越多的LCA5變異[13,18,26]被發(fā)現(xiàn)能夠?qū)е翷CA。在已發(fā)現(xiàn)的LCA5變異中，無義突變、移碼突變和剪接突變占70%以上，這些突變可能會(huì)引入提前終止密碼子(premature termination codons，PTCs)，產(chǎn)生截短蛋白或無義介導(dǎo)的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)，導(dǎo)致LCA5的功能喪失，產(chǎn)生較為嚴(yán)重的LCA表型[27-28]。

c.91C＞T(p.Gln31X)是一個(gè)新的無義突變，位于LCA5基因3號(hào)外顯子。該變異在第31位氨基酸位點(diǎn)產(chǎn)生了提前終止的密碼子，可能通過NMD造成LCA5蛋白表達(dá)量降低、功能異常。Boldt等[25]和Song等[29]研究表明，在LCA5gt/gt小鼠模型中，LCA5蛋白失活，表達(dá)量降低會(huì)干擾鞭毛內(nèi)運(yùn)輸，純合突變小鼠在出生后幾周內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的視網(wǎng)膜功能障礙等。

c.1457_1460delins21bp(p.Tyr486fs*113)是一個(gè)新的移碼突變，位于第9號(hào)外顯子。該變異會(huì)產(chǎn)生PTCs，但是由于該變異位于最后一個(gè)外顯子，只影響LCA5蛋白的30%左右，可能會(huì)產(chǎn)生截短蛋白或NMD。Wang等[30]在1例LCA患者中檢測(cè)到LCA5基因c.1466del(p.L489CfsX104)和c.238C＞T(p.R80X)的復(fù)合雜合突變。Ramprasad等[19]發(fā)現(xiàn)，c.955G＞A突變可以導(dǎo)致LCA轉(zhuǎn)錄翻譯中外顯子6的跳過，在攜帶該變異的患者淋巴細(xì)胞中，仍然可以檢測(cè)到存在顯著水平的LCA5的mRNA表達(dá)。因此c.1457_1460delins21bp(p.Tyr486fs*113)的致病機(jī)制仍需進(jìn)一步的探索。

本研究通過對(duì)1個(gè)LCA家系進(jìn)行目的區(qū)域高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了LCA5基因的2個(gè)新變異，拓展了LCA基因的表型和突變譜，為L(zhǎng)CA的致病機(jī)制以及基因型和表型的關(guān)聯(lián)研究提供了新的信息。