王堯，錢軍 綜述孫云浩，季明明，朱敏，許建寧 審校

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鹽城第一醫(yī)院(鹽城市第一人民醫(yī)院)胸心外科，江蘇鹽城 224005

氣管切除并端端吻合是當(dāng)前氣管重建的金標(biāo)準(zhǔn)，但僅限于病變氣管段不超過(guò)成人總氣管長(zhǎng)度的1/2或小兒的1/3[1-4]。當(dāng)病變氣管超過(guò)最大限度時(shí)，進(jìn)行氣管重建有一定難度，因?yàn)闅夤懿粌H僅是一個(gè)簡(jiǎn)單的圓柱狀通氣管道，而是由復(fù)雜的多層結(jié)構(gòu)組成[5]。氣管是由15～20個(gè)“C”形軟骨構(gòu)成，在氣管內(nèi)表面覆有纖毛上皮，外表面含有平滑肌、血管等結(jié)締組織。氣管軟骨維持著氣管圓柱狀形態(tài)，防止氣管塌陷；而氣管內(nèi)表面呼吸上皮中的纖毛對(duì)氣管的清潔有著重要作用；氣管軟骨周圍的結(jié)締組織則保證了氣管的曲伸及收縮、擴(kuò)張等機(jī)械運(yùn)動(dòng)[6-7]。因此，還沒(méi)有辦法完全重建這樣復(fù)雜的多層結(jié)構(gòu)以及完全模擬其功能。目前在氣管組織工程構(gòu)建中常用技術(shù)是脫細(xì)胞與3D打印技術(shù)，本文主要對(duì)脫細(xì)胞技術(shù)在組織工程氣管中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 脫細(xì)胞技術(shù)

通過(guò)化學(xué)和生物酶、物理或組合方法去除組織/器官內(nèi)的細(xì)胞成分，有效地保留組織/器官的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)及三維結(jié)構(gòu)，同時(shí)誘導(dǎo)并促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化、黏附，最終重建或修復(fù)組織/器官原本的功能[8-9]。

2 脫細(xì)胞方法

2.1 化學(xué)方法該方法原理為利用去污劑、酸堿溶液等化學(xué)試劑處理組織/器官，通過(guò)溶解細(xì)胞膜和解離細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，同時(shí)完整保留細(xì)胞外基質(zhì)，從而達(dá)到脫細(xì)胞的目的[10]。理想的化學(xué)脫細(xì)胞試劑應(yīng)具有毒性低、清除細(xì)胞效率高及最大程度保留基質(zhì)生物力學(xué)特性等優(yōu)點(diǎn)。Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate，SDS)與脫氧膽酸鈉(deoxycholate，SD)是脫細(xì)胞過(guò)程中最常用的脫細(xì)胞試劑[11]。SDS是最廣泛使用的離子型去污劑，它通過(guò)溶解細(xì)胞膜和核膜起作用，能完全去除細(xì)胞及消除至少90%的宿主DNA。但SDS在脫細(xì)胞同時(shí)使基質(zhì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)含量減少，彈性模量減低，且SDS具有細(xì)胞毒性，組織脫細(xì)胞后需要進(jìn)行反復(fù)的清洗后才能接種細(xì)胞[12-13]。SD是另一種離子型去污劑，通過(guò)溶解細(xì)胞膜起作用，與SDS相比，SD不會(huì)破壞基質(zhì)結(jié)構(gòu)且毒性低，但會(huì)導(dǎo)致DNA凝集在組織表面[14]。Triton X-100是一種非離子型去污劑，可以通過(guò)其分子上的親水基團(tuán)溶解細(xì)胞而達(dá)到清除血管壁細(xì)胞成分的目的。相比SDS，Triton X-100對(duì)組織結(jié)構(gòu)完整性的損害及細(xì)胞毒性較小，但清除細(xì)胞能力欠佳[15]。三種常用化學(xué)脫細(xì)胞試劑都有各自不足，須與物理方法及酶等方法聯(lián)合使用才能達(dá)到理想的脫細(xì)胞效果。

2.2生物方法該方法原理為用胰蛋白酶、核酸酶等來(lái)處理組織/器官，清除細(xì)胞DNA及細(xì)胞外基質(zhì)中的某些成分來(lái)達(dá)到脫細(xì)胞效果[16]。酶處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高，可顯著改變基質(zhì)結(jié)構(gòu)，破壞層黏連蛋白并去除GAG，嚴(yán)重?fù)p害基質(zhì)的生物力學(xué)性能[17]。因此，為了制備優(yōu)質(zhì)的脫細(xì)胞基質(zhì)，酶常與化學(xué)脫細(xì)胞試劑聯(lián)合使用。ZHANG等[18]聯(lián)合使用胰蛋白酶、SDS、Triton X-100對(duì)豬腹直肌進(jìn)行脫細(xì)胞處理后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞和DNA被充分去除，層黏連蛋白、Ⅳ型膠原和纖連蛋白得以完整保留。同時(shí)，脫細(xì)胞肌肉顯示出與天然肌肉相似的機(jī)械強(qiáng)度，超微結(jié)構(gòu)、脈管系統(tǒng)和神經(jīng)通道也完好無(wú)損。同樣，先用Triton X-100及SD對(duì)人肺進(jìn)行脫細(xì)胞處理后再用脫氧核糖核酸酶處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)殘留DNA被完全清除，從而避免了體內(nèi)潛在的免疫反應(yīng)[19]。

2.3 物理方法該方法原理為借助超聲波、凍融、高壓與超臨界二氧化碳等方法來(lái)脫細(xì)胞，通過(guò)溶解細(xì)胞和破壞細(xì)胞基質(zhì)黏附蛋白來(lái)達(dá)到消除細(xì)胞的目的。凍融法是最常用的物理方法，其通過(guò)冷凍組織，形成細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶，破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞溶解。但該方法必須控制溫度變化速率，控制形成冰晶的大小，防止對(duì)ECM的過(guò)度損傷[20-21]。高壓法是通過(guò)對(duì)組織施加壓力來(lái)達(dá)到溶解細(xì)胞的目的，但這種方法只對(duì)ECM致密的組織或器官有效(如肝和肺)[22]。超聲波法是運(yùn)用超聲波在液體中的空化作用以及強(qiáng)烈的振動(dòng)與攪拌作用將細(xì)胞擊碎[23-24]。但是，目前尚未研究出破壞細(xì)胞時(shí)超聲波的最佳幅度和頻率。超臨界二氧化碳法是一種有前景的方法，由于超臨界二氧化碳具有類液體的密度和類氣體的擴(kuò)散率，其臨界溫度為31.1℃，臨界壓力為7.40 MPa，與生物系統(tǒng)兼容[25-26]。該方法優(yōu)點(diǎn)在于二氧化碳不會(huì)留在組織內(nèi)，因此不需要大量清洗。然而，二氧化碳是非極性的，需要加入極性?shī)A帶劑(如乙醇)來(lái)去除細(xì)胞的極性磷脂膜，從而清除細(xì)胞核和膜。所有的物理方法優(yōu)點(diǎn)在于可以避免化學(xué)試劑或酶的毒性，減少對(duì)ECM的損害，但缺點(diǎn)在于需要反復(fù)清洗才能去除殘留的細(xì)胞碎片及DNA，避免免疫排斥反應(yīng)。因此，物理方法需要結(jié)合化學(xué)或生物方法才能進(jìn)一步提高脫細(xì)胞效率。

3 脫細(xì)胞技術(shù)在氣管組織工程構(gòu)建中的應(yīng)用

脫細(xì)胞氣管基質(zhì)不僅具有無(wú)免疫原性、無(wú)毒性、良好的生物相容性，同時(shí)還保留原生氣管的三維結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)，是長(zhǎng)段氣管缺損修復(fù)的理想支架材料。

3.1 脫細(xì)胞技術(shù)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用楊文龍等[27]利用去污劑聯(lián)合酶法制備脫細(xì)胞氣管支架，隨后與京尼平交聯(lián)后進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果顯示移植后15 d未出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫排斥及炎癥反應(yīng)，效果與自體氣管移植無(wú)明顯差異。但長(zhǎng)時(shí)間移植后脫細(xì)胞氣管支架的穩(wěn)定性及生物相容性有待進(jìn)一步研究。王志豪等[28]采用兩個(gè)周期的改良去污劑聯(lián)合酶法制備的兔脫細(xì)胞氣管基質(zhì)，生物力學(xué)性能較原生氣管僅輕微下降，組織學(xué)結(jié)果顯示上皮及黏膜層細(xì)胞被完全去除，免疫原性下降。改良的去污劑聯(lián)合酶法雖然縮短了脫細(xì)胞周期，節(jié)約成本，但未進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，移植效果尚不確定。蔣媛等[29]采用2%TritonX-100聯(lián)合脫氧核糖核酸酶Ⅰ和核糖核酸酶對(duì)兔氣管進(jìn)行脫細(xì)胞處理，組織學(xué)分析表明黏膜上皮細(xì)胞成分基本被去除，軟骨細(xì)胞少量殘留；掃描電鏡結(jié)果顯示氣管內(nèi)表面無(wú)細(xì)胞殘留，基底膜光滑，有輕微破壞。同樣，ZHANG等[30]分別使用1%、2%、3%、4%TritonX-100和核酸酶對(duì)兔氣管進(jìn)行脫細(xì)胞處理，組織學(xué)與掃描電鏡結(jié)果顯示經(jīng)2%TritonX-100和核酸酶處理的氣管纖毛上皮細(xì)胞完全消失，軟骨細(xì)胞大量保留，基底膜完整。異體皮下埋植實(shí)驗(yàn)證實(shí)了脫細(xì)胞氣管基質(zhì)無(wú)免疫原性，具有良好的生物相容性。細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明脫細(xì)胞氣管基質(zhì)提供的微環(huán)境有利于細(xì)胞增殖。因此，2%TritonX-100處理制備的脫細(xì)胞氣管基質(zhì)具有良好的力學(xué)性能和生物相容性，可幫助氣管損傷的修復(fù)重建。KAJBAFZADEH等[31]將十二烷基硫酸鈉制備的脫細(xì)胞氣管植入裸鼠體內(nèi)，利用其自身作為天然生物反應(yīng)器，結(jié)果證實(shí)了脫細(xì)胞氣管基質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)得以保留，并具有良好的生物力學(xué)性能。移植后3個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月獲取的活檢樣品中軟骨成分和結(jié)締組織中的細(xì)胞播種程度均較高。AOKI等[32]提出了一種使用雙室生物反應(yīng)器使氣管移植物去上皮化并隨后用外源細(xì)胞重新填充移植物的新穎方法。他們首先用十二烷基硫酸鈉通過(guò)內(nèi)室灌注3 h可有效去除大部分氣管上皮細(xì)胞，同時(shí)經(jīng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基灌注的外室可使大部分軟骨細(xì)胞存活，最后使氣管移植物重新上皮化。這項(xiàng)研究將脫細(xì)胞技術(shù)與生物反應(yīng)器結(jié)合制備氣管移植物，既保留了移植物的結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能，同時(shí)保持了軟骨的活力，并實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞附著和再填充。上述研究都為進(jìn)一步原位氣管移植提供了一些基礎(chǔ)，但仍需要長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)研究，將來(lái)才有望應(yīng)用于臨床。GIRALDO-GOMEZ等[33]使用胰蛋白酶法對(duì)長(zhǎng)段豬氣管進(jìn)行脫細(xì)胞處理，HE染色與DNA殘留含量定量分析表明氣管腔內(nèi)無(wú)細(xì)胞成分及DAN含量明顯減少；抗原性消失；掃描電鏡顯示膠原纖維在軟骨周圍組織中保留下來(lái)；生物力學(xué)結(jié)果證實(shí)脫細(xì)胞氣管基質(zhì)與正常氣管兩者的機(jī)械性能無(wú)顯著性差異；細(xì)胞跟蹤和活力分析顯示軟骨細(xì)胞在接種8 d后依然保持軟骨細(xì)胞特征形態(tài)及活力。該研究表明胰蛋白酶制備的脫細(xì)胞氣管基質(zhì)可作為氣管替代物，但體內(nèi)移植效果需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)驗(yàn)證。OHNA等[34]利用高靜水壓技術(shù)對(duì)豬氣管進(jìn)行脫細(xì)胞處理后進(jìn)行體內(nèi)移植，術(shù)后6個(gè)月和12個(gè)月研究發(fā)現(xiàn)氣管腔被脫細(xì)胞氣管補(bǔ)片修復(fù)，周圍有再生軟骨，部分均勻地結(jié)合到脫細(xì)胞氣管補(bǔ)片中，誘導(dǎo)了氣管重構(gòu)。但是過(guò)高的壓力會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，影響脫細(xì)胞氣管基質(zhì)的生物力學(xué)性能，因此，選擇合適的壓力至關(guān)重要。LANGE等[35]通過(guò)將真空脫細(xì)胞法制備的脫細(xì)胞豬氣管，與正常氣壓下制備的脫細(xì)胞豬氣管進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，真空脫細(xì)胞法制備的脫細(xì)胞氣管完全清除纖毛上皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，殘留的DNA少，膠原蛋白、糖胺聚糖含量及生物力學(xué)性能無(wú)明顯差異。隨后，他們將用真空脫細(xì)胞法制備的脫細(xì)胞人氣管埋植到大鼠體內(nèi)14 d，研究發(fā)現(xiàn)氣管支架均保持良好的形態(tài)，未出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)等不良反應(yīng)。BULTER等[36]將通過(guò)真空脫細(xì)胞法制備的脫細(xì)胞人氣管與去污劑聯(lián)合酶法所制的脫細(xì)胞人氣管進(jìn)行比較，研究發(fā)現(xiàn)兩者脫細(xì)胞效果相似，雞絨毛尿囊膜和皮下植入實(shí)驗(yàn)證實(shí)了脫細(xì)胞氣管基質(zhì)不僅促進(jìn)血管向內(nèi)生長(zhǎng)，同時(shí)具有較好的生物相容性。真空脫細(xì)胞法制備周期短(約9 d)，成本相對(duì)較低，但在負(fù)壓影響下組織結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生膨脹，且細(xì)胞黏附情況、糖胺聚糖丟失影響、原位移植效果仍需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步研究，最終形成真空脫細(xì)胞法的標(biāo)準(zhǔn)程序以便將來(lái)應(yīng)用在臨床上解決氣管替代物缺乏的難題。

3.2 脫細(xì)胞技術(shù)在臨床中的應(yīng)用MACCHIARINI等[37]2008年在《柳葉刀》雜志上報(bào)道了首例由去污劑聯(lián)合酶法制備的脫細(xì)胞氣管移植病例。患者因肺結(jié)核浸潤(rùn)導(dǎo)致左主支氣管塌陷引起嚴(yán)重的呼吸困難，他們將人供體氣管通過(guò)去污劑聯(lián)合酶法進(jìn)行25個(gè)周期的脫細(xì)胞處理后，去除了細(xì)胞、HLA和MHC抗原并保留細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)將患者自身上皮細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的軟骨細(xì)胞種植到脫細(xì)胞氣管內(nèi)表面，最后進(jìn)行左主支氣管重建。術(shù)后第4天細(xì)胞學(xué)分析表明腔內(nèi)有大量上皮細(xì)胞，纖毛中見(jiàn)到軟骨細(xì)胞。術(shù)后4個(gè)月隨訪顯示：患者恢復(fù)可，未服用免疫抑制藥物，可進(jìn)行正常生活，肺功能檢測(cè)在正常范圍內(nèi)，CT提示氣管通暢、無(wú)塌陷。該案例雖然取得了成功，但組織工程氣管的血供及如何在氣管內(nèi)外表面均勻且高效種植細(xì)胞等問(wèn)題仍需要進(jìn)一步研究。GONFIOTTI等[38]報(bào)道了該患者5年隨訪結(jié)果顯示：患者正常生活，肺功能檢測(cè)在正常范圍內(nèi)，未出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)及癌變等情況。1年后支氣管鏡檢查發(fā)現(xiàn)吻合口處出現(xiàn)進(jìn)行性瘢痕狹窄，需要反復(fù)進(jìn)行腔內(nèi)支架置入術(shù)。然而，組織工程化氣管仍保持開放，血管化良好，呼吸道上皮細(xì)胞重新形成，纖毛功能和黏液清除功能正常。因此，通過(guò)去污劑聯(lián)合酶法制備的人脫細(xì)胞氣管與自體上皮細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)后用于長(zhǎng)段氣管病變的修復(fù)重建是可行的，但由于制備周期長(zhǎng)，且移植后基質(zhì)機(jī)械性能下降容易導(dǎo)致狹窄、塌陷等并發(fā)癥，未能在臨床上廣泛推廣和應(yīng)用。ELLIOTT等[39]報(bào)道了一例12歲患兒因長(zhǎng)段先天性氣管狹窄進(jìn)行氣管移植的病例。術(shù)前他們將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植到脫細(xì)胞氣管上，隨后移植到患兒體內(nèi)。術(shù)后予以注射轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)促進(jìn)軟骨生成及人類重組促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)促進(jìn)血管生成。術(shù)后1周脫細(xì)胞氣管已重新血管化，1年后細(xì)胞學(xué)檢查提示氣管腔已上皮化，18個(gè)月后部胸部CT掃描和通氣-灌注掃描均正常。在隨訪的2年中，患者呼吸功能正常，已正常生活。之后研究者們陸續(xù)報(bào)道了兒童脫細(xì)胞氣管移植案例，但兒童脫細(xì)胞氣管移植的難點(diǎn)在于移植物需要適應(yīng)生長(zhǎng)的需要及如何快速的血管化。因此，對(duì)所有年齡段的兒童進(jìn)行氣管移植，移植物生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)收集對(duì)臨床至關(guān)重要。

4 展望

組織工程學(xué)是一門結(jié)合工程學(xué)、材料學(xué)和生命科學(xué)相結(jié)合的的交叉學(xué)科，用于替代、修復(fù)或改善人體組織器官的形態(tài)和功能[40]。組織工程氣管旨在替換或再生人體氣管組織，以恢復(fù)長(zhǎng)段氣管損傷患者正常的呼吸功能。組織工程氣管三個(gè)關(guān)鍵因素包括細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞和生物反應(yīng)器，其中細(xì)胞外基質(zhì)是氣管功能重建的基礎(chǔ)。利用脫細(xì)胞技術(shù)制備的脫細(xì)胞氣管基質(zhì)已得到廣泛認(rèn)可，不僅可以保留細(xì)胞外基質(zhì)、去抗原性、具有良好的生物相容性和力學(xué)性能，且可支持種植細(xì)胞的黏附、增殖、分化，最終實(shí)現(xiàn)組織功能修復(fù)和結(jié)構(gòu)重塑。但目前脫細(xì)胞技術(shù)研究主要停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，應(yīng)用于臨床上仍需進(jìn)一步的研究，氣管脫細(xì)胞過(guò)程中仍有許多問(wèn)題亟待解決[9]，譬如：如何縮短脫細(xì)胞周期和降低成本；如何更好地清除細(xì)胞成分和維持基質(zhì)穩(wěn)定性和完整性；如何更好地促進(jìn)種植細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)；如何更好地將生物方法、化學(xué)方法與物理方法三者結(jié)合使用進(jìn)一步提高脫細(xì)胞效率。目前有將脫細(xì)胞氣管支架與其他氣管支架聯(lián)合使用用于氣管移植。TAN等[41]將豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)與鎳鈦合金支架構(gòu)建成復(fù)合氣管支架，用于替代治療1例晚期肺癌侵犯左主支氣管的患者。術(shù)后患者恢復(fù)良好，支氣管鏡檢查及活檢結(jié)果顯示術(shù)后4個(gè)月復(fù)合氣管支架完全血運(yùn)重建和再上皮化，未發(fā)生與氣管替代物植入的相關(guān)并發(fā)癥。

相信隨著組織工程氣管及脫細(xì)胞技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，其可以不斷改善氣管基質(zhì)的缺陷，優(yōu)化氣管基質(zhì)的性能，同時(shí)與其他氣管基質(zhì)結(jié)合使用，構(gòu)建出安全、高效的氣管基質(zhì)，為解決臨床上長(zhǎng)段氣管替代物缺乏提供有效的途徑，減輕患者的痛苦，提高生活質(zhì)量。