伍錫棟 林引花 徐麗瑛 朱思睿 孫英朔
1 江西省醫(yī)療器械檢測中心檢測四室 (江西 南昌 330000)
2 南昌大學(xué)藥學(xué)院 (江西 南昌 330000)
內(nèi)容提要: 目的:對聚氯乙烯(Polyvinyl Chloride,PVC)材質(zhì)醫(yī)療器械的浸提液制備方法進(jìn)行探索,為其細(xì)胞毒性檢測提供依據(jù)。方法:按照GB/T16886.12中規(guī)定的浸提比例(0.2g/mL),改變浸提溫度(36°C、36.5°C、37°C、38°C)、時間(2h、4h、8h、12h、24h、48h)、濕度(100%、90%、80%、70%)和搖床速率(5000r/min、8000r/min、10000r/min),通過體外細(xì)胞毒性檢測方法評價PVC材質(zhì)醫(yī)療器械不同的浸提液對細(xì)胞毒性的影響。結(jié)果:細(xì)胞毒性與浸提樣品的時間、溫度及搖床轉(zhuǎn)速呈正相關(guān)性,其中38°C、48h及搖床轉(zhuǎn)速8000r/min細(xì)胞毒性最高,均<70%,按照GB/T16886.5-2017判定均具有細(xì)胞毒性;結(jié)論:PVC材質(zhì)醫(yī)療器械的體外細(xì)胞毒性對樣品浸提液制備過程中浸提時間和搖床速率要求嚴(yán)格,在制備浸提液時應(yīng)該根據(jù)產(chǎn)品的臨床使用情況合理選擇浸提時間和搖床的速率。
聚氯乙烯(Polyvinyl Chloride,PVC)是由氯乙烯單體在過氧化物等引發(fā)劑或者光熱條件下聚合而成的高分子聚合物,是世界上最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的合成樹脂之一,具有加工方便、可消毒、柔軟、耐壓等優(yōu)良特性,被廣泛應(yīng)用于日常生活。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示,2018年我國醫(yī)用塑料市場消費(fèi)中PVC的用量占比高達(dá)28%,以PVC為材料的醫(yī)療器械普遍使用,PVC材質(zhì)的醫(yī)療器械因會與人體接觸所以需要格外注意其生物安全性[1]。細(xì)胞毒性試驗(yàn)是一種在體外借助相關(guān)的細(xì)胞,模擬細(xì)胞生長環(huán)境,具有廣泛的通用性,在醫(yī)療器械的生物學(xué)評價中作為常規(guī)評價方法之一,是對醫(yī)療器械生物學(xué)評價的重要指標(biāo)之一。GB/T16886.12針對樣品浸提液制備方法比較統(tǒng)籠,然市場上PVC材料來源質(zhì)量參差不齊,且加工過程中常添加增塑劑等物質(zhì),加工的產(chǎn)品狀態(tài)及形狀等均可能影響其浸出物的不同,直接影響產(chǎn)品細(xì)胞毒性等生物學(xué)的評價,本文針對PVC材質(zhì)的醫(yī)療器械在制備浸提液時可能的影響因素進(jìn)行比較探究,為此類材質(zhì)的醫(yī)療器械產(chǎn)品的浸提液制備方法提供依據(jù)。
細(xì)胞與試劑:L929細(xì)胞(來源于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫);MEM培養(yǎng)基(Gibco公司,批號:2085588);胎牛血清(Excell公司,批號2261480CP);0.25%胰蛋白酶EDTA消化液(Solarbio公司,批號:20210717);100×青鏈霉素混合液(Solarbio公司,批號:20210625)等。
儀器設(shè)備:恒溫培養(yǎng)搖床(KYC-1102C),二氧化碳培養(yǎng)箱(CLM-170B-8-NF),倒置生物顯微鏡(AE31),電子天平(JY2003),自動細(xì)胞計數(shù)儀(IC1000),壓力蒸汽滅菌器(DSX-280KB24),全自動酶標(biāo)儀(ELx800)等。
1.2.1 浸提液制備
無菌條件下制備供試品浸提液,浸提比例為0.2g/mL,改變浸提溫度(36°C、36.5°C、37°C、38°C)、時間(2h、4h、8h、12h、24h、48h)、濕度(100%、90%、80%、70%)和搖床速率(5000r/min、8000r/min、10000r/min),浸提液為含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液。陰性對照為高密度聚乙烯浸提液,陽性對照為10%二甲基亞砜(DMSO)培養(yǎng)液,置于振幅為100r/mim恒溫震蕩箱中24h[2,3]。
1.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察
24h后,棄去加入96孔板中細(xì)胞孔的原培養(yǎng)液,加入空白對照液、陰性對照液、陽性對照液及供試液,置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h,于生物學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、空泡形成、脫落、細(xì)胞溶解和細(xì)胞膜完整性等方面的改變。
1.2.3 MTT細(xì)胞毒性檢測
棄去培養(yǎng)液,每孔加入50μL 1mg/mL的MTT溶液,37°C孵育2h后棄去所有孔內(nèi)液體,加入0.1mL異丙醇,置振蕩器上振蕩10min,在酶標(biāo)儀上雙波長(570nm)測定吸光度,計算細(xì)胞存活率(%)=OD570e/OD570b×100(OD570e試樣樣品浸提液光密度平均值;OD570b空白液光密度平均值)。
在不同濕度(100%、90%、80%、70%)制備試驗(yàn)液,試驗(yàn)液接觸24h后觀察細(xì)胞形態(tài)、空泡、溶解等情況,并MTT法檢測其OD值,計算細(xì)胞存活率,結(jié)果見圖1和表1。
在不同溫度(36°C、36.5°C、37°C、38°C)制備試驗(yàn)液,試驗(yàn)液接觸24h后觀察細(xì)胞形態(tài)、空泡、溶解等情況,并MTT法檢測其OD值,計算細(xì)胞存活率,結(jié)果見圖2和表2。
在不同時間(2h、4h、8h、12h、24h、48h)制備試驗(yàn)液,試驗(yàn)液接觸24h后觀察細(xì)胞形態(tài)、空泡、溶解等情況,并MTT法檢測其OD值,計算細(xì)胞存活率,結(jié)果見圖3和表3。
在不同搖床速率(5000r/min、8000r/min、10000r/min)下制備試驗(yàn)液,試液液接觸24h后觀察細(xì)胞形態(tài)、空泡、溶解等情況,并MTT法檢測其OD值,計算細(xì)胞存活率,結(jié)果見圖4和表4。
聚氯乙烯(Polyvinyl Chloride,PVC)材質(zhì)的醫(yī)療器械對接觸的藥品影響非常巨大,不僅會改變藥品的成分,而且還會加快藥物的聚合反應(yīng),影響人體健康,甚至影響到人生命。國家藥品監(jiān)督管理局國家藥品包裝容器(材料)標(biāo)準(zhǔn)YBB00012003中關(guān)于細(xì)胞毒性檢查法的供試液制備要求用玻璃器皿作為浸提容器[4,5];中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886.5中體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的浸提條件要求在無菌、化學(xué)惰性的封閉容器中進(jìn)行,ISO10993中體外細(xì)胞毒性測試中浸提條件要求盡量模擬臨床使用條件,應(yīng)在無菌、化學(xué)惰性的封閉容器中進(jìn)行[6,7]。然而PVC因?yàn)樾阅芊€(wěn)定、價格低廉而廣泛應(yīng)用于醫(yī)療器械領(lǐng)域,企業(yè)生產(chǎn)PVC材質(zhì)的產(chǎn)品需要根據(jù)使用的需求不同而加入不同比例的增塑劑、熱穩(wěn)定劑、色素等添加劑,但是因?yàn)樘砑觿┑氖褂脮斐梢欢ǖ纳锒拘?,對人體健康造成危害,在PVC材料加工時增塑劑和熱穩(wěn)定劑的使用量最大。細(xì)胞毒性研究是醫(yī)療器械生物學(xué)評價經(jīng)典的試驗(yàn)方法,其干擾和影響因素復(fù)雜,類似上述列舉的添加劑極其常見,故會給產(chǎn)品的生物性能帶來一定的不可控的風(fēng)險點(diǎn),其中,產(chǎn)品的使用溫度要求等都會影響產(chǎn)品的實(shí)際生物學(xué)性能等,故對其在生物學(xué)評價的細(xì)胞毒性浸提液制備中可能影響的因素有必要深入的研究。
本項(xiàng)目從通過體外細(xì)胞毒性檢測方法評價PVC材質(zhì)醫(yī)療器械不同的浸提液對細(xì)胞毒性的影響,對浸提樣品浸出物可能影響的因素進(jìn)行深入的研究比較,得出浸提時間、浸提溫度、搖床轉(zhuǎn)速等都會對細(xì)胞毒性的檢測產(chǎn)生不同的影響,浸提時間越長、浸提溫度越高及搖床轉(zhuǎn)速越高,細(xì)胞毒性越大,提示可能跟樣品浸提溶出物濃度有關(guān),也可能材料中確實(shí)存在一些不確定的物質(zhì)等,此實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為企業(yè)有關(guān)生產(chǎn)工藝改進(jìn)提供試驗(yàn)基礎(chǔ),同時為此類產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢測提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),在實(shí)際檢驗(yàn)檢測中應(yīng)該根據(jù)產(chǎn)品的實(shí)際使用情況選擇不同的浸提條件,才能比較客觀地反映產(chǎn)品的生物學(xué)毒性等。