伍錫棟 林引花 徐麗瑛 朱思睿 孫英朔

1 江西省醫(yī)療器械檢測中心檢測四室 （江西 南昌 330000）

2 南昌大學(xué)藥學(xué)院 （江西 南昌 330000）

內(nèi)容提要： 目的：對聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride，PVC）材質(zhì)醫(yī)療器械的浸提液制備方法進(jìn)行探索，為其細(xì)胞毒性檢測提供依據(jù)。方法：按照GB/T16886.12中規(guī)定的浸提比例（0.2g/mL），改變浸提溫度（36°C、36.5°C、37°C、38°C）、時間（2h、4h、8h、12h、24h、48h）、濕度（100%、90%、80%、70%）和搖床速率（5000r/min、8000r/min、10000r/min），通過體外細(xì)胞毒性檢測方法評價PVC材質(zhì)醫(yī)療器械不同的浸提液對細(xì)胞毒性的影響。結(jié)果：細(xì)胞毒性與浸提樣品的時間、溫度及搖床轉(zhuǎn)速呈正相關(guān)性，其中38°C、48h及搖床轉(zhuǎn)速8000r/min細(xì)胞毒性最高，均＜70%，按照GB/T16886.5-2017判定均具有細(xì)胞毒性；結(jié)論：PVC材質(zhì)醫(yī)療器械的體外細(xì)胞毒性對樣品浸提液制備過程中浸提時間和搖床速率要求嚴(yán)格，在制備浸提液時應(yīng)該根據(jù)產(chǎn)品的臨床使用情況合理選擇浸提時間和搖床的速率。

聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride，PVC）是由氯乙烯單體在過氧化物等引發(fā)劑或者光熱條件下聚合而成的高分子聚合物，是世界上最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的合成樹脂之一，具有加工方便、可消毒、柔軟、耐壓等優(yōu)良特性，被廣泛應(yīng)用于日常生活。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，2018年我國醫(yī)用塑料市場消費(fèi)中PVC的用量占比高達(dá)28%，以PVC為材料的醫(yī)療器械普遍使用，PVC材質(zhì)的醫(yī)療器械因會與人體接觸所以需要格外注意其生物安全性[1]。細(xì)胞毒性試驗(yàn)是一種在體外借助相關(guān)的細(xì)胞，模擬細(xì)胞生長環(huán)境，具有廣泛的通用性，在醫(yī)療器械的生物學(xué)評價中作為常規(guī)評價方法之一，是對醫(yī)療器械生物學(xué)評價的重要指標(biāo)之一。GB/T16886.12針對樣品浸提液制備方法比較統(tǒng)籠，然市場上PVC材料來源質(zhì)量參差不齊，且加工過程中常添加增塑劑等物質(zhì)，加工的產(chǎn)品狀態(tài)及形狀等均可能影響其浸出物的不同，直接影響產(chǎn)品細(xì)胞毒性等生物學(xué)的評價，本文針對PVC材質(zhì)的醫(yī)療器械在制備浸提液時可能的影響因素進(jìn)行比較探究，為此類材質(zhì)的醫(yī)療器械產(chǎn)品的浸提液制備方法提供依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 一般材料

細(xì)胞與試劑：L929細(xì)胞（來源于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫）；MEM培養(yǎng)基（Gibco公司，批號：2085588）；胎牛血清（Excell公司，批號2261480CP）；0.25%胰蛋白酶EDTA消化液（Solarbio公司，批號：20210717）；100×青鏈霉素混合液（Solarbio公司，批號：20210625）等。

儀器設(shè)備：恒溫培養(yǎng)搖床（KYC-1102C），二氧化碳培養(yǎng)箱（CLM-170B-8-NF），倒置生物顯微鏡（AE31），電子天平（JY2003），自動細(xì)胞計數(shù)儀（IC1000），壓力蒸汽滅菌器（DSX-280KB24），全自動酶標(biāo)儀（ELx800）等。

1.2 方法

1.2.1 浸提液制備

無菌條件下制備供試品浸提液，浸提比例為0.2g/mL，改變浸提溫度（36°C、36.5°C、37°C、38°C）、時間（2h、4h、8h、12h、24h、48h）、濕度（100%、90%、80%、70%）和搖床速率（5000r/min、8000r/min、10000r/min），浸提液為含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液。陰性對照為高密度聚乙烯浸提液，陽性對照為10%二甲基亞砜（DMSO）培養(yǎng)液，置于振幅為100r/mim恒溫震蕩箱中24h[2,3]。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

24h后，棄去加入96孔板中細(xì)胞孔的原培養(yǎng)液，加入空白對照液、陰性對照液、陽性對照液及供試液，置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，于生物學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、空泡形成、脫落、細(xì)胞溶解和細(xì)胞膜完整性等方面的改變。

1.2.3 MTT細(xì)胞毒性檢測

棄去培養(yǎng)液，每孔加入50μL 1mg/mL的MTT溶液，37°C孵育2h后棄去所有孔內(nèi)液體，加入0.1mL異丙醇，置振蕩器上振蕩10min，在酶標(biāo)儀上雙波長（570nm）測定吸光度，計算細(xì)胞存活率（%）=OD570e/OD570b×100（OD570e試樣樣品浸提液光密度平均值；OD570b空白液光密度平均值）。

2.結(jié)果

2.1 改變浸提液制備的濕度

在不同濕度（100%、90%、80%、70%）制備試驗(yàn)液，試驗(yàn)液接觸24h后觀察細(xì)胞形態(tài)、空泡、溶解等情況，并MTT法檢測其OD值，計算細(xì)胞存活率，結(jié)果見圖1和表1。

2.2 改變浸提液制備的溫度

在不同溫度（36°C、36.5°C、37°C、38°C）制備試驗(yàn)液，試驗(yàn)液接觸24h后觀察細(xì)胞形態(tài)、空泡、溶解等情況，并MTT法檢測其OD值，計算細(xì)胞存活率，結(jié)果見圖2和表2。

2.3 改變浸提液制備的時間

在不同時間（2h、4h、8h、12h、24h、48h）制備試驗(yàn)液，試驗(yàn)液接觸24h后觀察細(xì)胞形態(tài)、空泡、溶解等情況，并MTT法檢測其OD值，計算細(xì)胞存活率，結(jié)果見圖3和表3。

2.4 改變浸提液制備的搖床速率

在不同搖床速率（5000r/min、8000r/min、10000r/min）下制備試驗(yàn)液，試液液接觸24h后觀察細(xì)胞形態(tài)、空泡、溶解等情況，并MTT法檢測其OD值，計算細(xì)胞存活率，結(jié)果見圖4和表4。

3.討論

聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride，PVC）材質(zhì)的醫(yī)療器械對接觸的藥品影響非常巨大，不僅會改變藥品的成分，而且還會加快藥物的聚合反應(yīng)，影響人體健康，甚至影響到人生命。國家藥品監(jiān)督管理局國家藥品包裝容器（材料）標(biāo)準(zhǔn)YBB00012003中關(guān)于細(xì)胞毒性檢查法的供試液制備要求用玻璃器皿作為浸提容器[4,5]；中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886.5中體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的浸提條件要求在無菌、化學(xué)惰性的封閉容器中進(jìn)行，ISO10993中體外細(xì)胞毒性測試中浸提條件要求盡量模擬臨床使用條件，應(yīng)在無菌、化學(xué)惰性的封閉容器中進(jìn)行[6,7]。然而PVC因?yàn)樾阅芊€(wěn)定、價格低廉而廣泛應(yīng)用于醫(yī)療器械領(lǐng)域，企業(yè)生產(chǎn)PVC材質(zhì)的產(chǎn)品需要根據(jù)使用的需求不同而加入不同比例的增塑劑、熱穩(wěn)定劑、色素等添加劑，但是因?yàn)樘砑觿┑氖褂脮斐梢欢ǖ纳锒拘?，對人體健康造成危害，在PVC材料加工時增塑劑和熱穩(wěn)定劑的使用量最大。細(xì)胞毒性研究是醫(yī)療器械生物學(xué)評價經(jīng)典的試驗(yàn)方法，其干擾和影響因素復(fù)雜，類似上述列舉的添加劑極其常見，故會給產(chǎn)品的生物性能帶來一定的不可控的風(fēng)險點(diǎn)，其中，產(chǎn)品的使用溫度要求等都會影響產(chǎn)品的實(shí)際生物學(xué)性能等，故對其在生物學(xué)評價的細(xì)胞毒性浸提液制備中可能影響的因素有必要深入的研究。

本項(xiàng)目從通過體外細(xì)胞毒性檢測方法評價PVC材質(zhì)醫(yī)療器械不同的浸提液對細(xì)胞毒性的影響，對浸提樣品浸出物可能影響的因素進(jìn)行深入的研究比較，得出浸提時間、浸提溫度、搖床轉(zhuǎn)速等都會對細(xì)胞毒性的檢測產(chǎn)生不同的影響，浸提時間越長、浸提溫度越高及搖床轉(zhuǎn)速越高，細(xì)胞毒性越大，提示可能跟樣品浸提溶出物濃度有關(guān)，也可能材料中確實(shí)存在一些不確定的物質(zhì)等，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為企業(yè)有關(guān)生產(chǎn)工藝改進(jìn)提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，同時為此類產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢測提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，在實(shí)際檢驗(yàn)檢測中應(yīng)該根據(jù)產(chǎn)品的實(shí)際使用情況選擇不同的浸提條件，才能比較客觀地反映產(chǎn)品的生物學(xué)毒性等。