張杏羨

（天津華興醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300270）

生物分子的定量檢測是實(shí)現(xiàn)疾病診斷與健康監(jiān)測的重要方式，傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、化學(xué)發(fā)光法（chemi luminescence，CL）等，其檢測靈敏度多限制在10-14～10-12mol/L，無法滿足疾病的早期診斷需求[1]。對此，臨床提出采用單分子免疫檢測技術(shù)（single molecule detection，SMD），用以提高免疫檢測靈敏度。單分子免疫檢測是一種“數(shù)字化”免疫檢測技術(shù)，可將免疫復(fù)合物限制在極小范圍內(nèi)（nl 以下），對產(chǎn)生的信號進(jìn)行絕對計數(shù)，其靈敏度高達(dá)10-18mol/L，可充分滿足多種生物標(biāo)志物的檢測需求[2]。目前，單分子免疫檢測模式可分為原位檢測與隨機(jī)分配檢測，前者所需儀器昂貴，對操作者要求較高，當(dāng)前難以實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用[3]。隨機(jī)分配檢測則包括微陣列芯片與微液滴兩種形式，其中，基于微陣列技術(shù)的單分子免疫檢測已實(shí)現(xiàn)一定的自動化與商業(yè)化，是當(dāng)前單分子檢測最常用技術(shù)，而Quantarix 公司的Simoa 是目前最具代表性的單分子免疫檢測技術(shù)[4]。本文以Simoa 為代表，對單分子免疫檢測的技術(shù)原理及臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為超高靈敏度檢測方法的進(jìn)一步開放提供理論基礎(chǔ)。

1 技術(shù)原理

以Simoa 為例，基于微陣列芯片的單分子免疫檢測是在毫米級芯片上雕刻（或澆筑）成千上萬個微米級微井，每個微井體積約40 fl 左右，隨后將免疫復(fù)合物磁珠分配于微井中，再借助高分辨率熒光顯微鏡對熒光點(diǎn)進(jìn)行計數(shù)，依據(jù)泊松分布理論，計算同時含珠子與熒光產(chǎn)物孔的數(shù)量/含珠子孔總數(shù)的比值，以此確定測試樣品中的蛋白質(zhì)濃度[5]。相較于傳統(tǒng)檢測方式，以Simoa 為代表的單分子免疫檢測技術(shù)可通過數(shù)字方式確定標(biāo)志物濃度，其靈敏度高，可同時完成多達(dá)10 種目標(biāo)分子的檢測，且重復(fù)性好、線性范圍高、靈活度強(qiáng)，可依據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行方案開發(fā)與優(yōu)化[6]。近年來，磁珠的全自動化檢測發(fā)展逐漸成熟，僅需增加磁珠分配和信號讀取模塊，便可實(shí)現(xiàn)單分子免疫檢測的全自動。目前，Quanterix Simoa HD-1 數(shù)字式單分子免疫陣列分析儀這一全自動方案已進(jìn)入市場應(yīng)用，前景廣闊。

2 臨床應(yīng)用

目前，單分子免疫技術(shù)主要應(yīng)用于生物標(biāo)志物的檢測，包括蛋白質(zhì)、核酸與生物小分子等，可準(zhǔn)確監(jiān)測生物標(biāo)志物變化，有助于疾病的早期診斷與預(yù)后評估。研究證實(shí)[7，8]，單分子免疫技術(shù)具有超高靈敏度，其靈敏度與核酸檢測較為相似，且檢出限低，大大避免了靈敏度不足引起的假陰性，在神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、傳染病等領(lǐng)域均具有理想檢測價值。

2.1 在神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域中的應(yīng)用 神經(jīng)退行性疾病是神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與功能退化引起的功能障礙性疾病，包括阿爾茲海默癥（alzheimer disease，AD）、多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）、帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）及脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)（spinocerebellar ataxias）等，早期診斷尤為重要?，F(xiàn)階段，神經(jīng)絲蛋白（neurofilament protein，NFP）、β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）、tau（T-tau）蛋白和磷酸化tau（P-tau）蛋白等均為神經(jīng)退行性疾病的常用生物標(biāo)志物[9]。當(dāng)神經(jīng)元膜結(jié)構(gòu)受損，相關(guān)標(biāo)志物可釋放入組織液中，最終游離于腦脊液與血液中，隨著病情進(jìn)展，其標(biāo)志物水平可發(fā)生不同程度變化[10]。因此，通過腦脊液與血液的標(biāo)志物檢測，可獲取相關(guān)疾病的動態(tài)信息。研究發(fā)現(xiàn)[11]，受到血-腦屏障的影響，血液中的標(biāo)志物濃度遠(yuǎn)低于腦脊液，且無法用現(xiàn)有手段準(zhǔn)確檢測。因此，臨床多以腦脊液作為此類疾病的檢測標(biāo)本，但腦脊液采集需穿刺取樣，創(chuàng)傷較大，不利于臨床推廣，相較而言，血液檢測不僅取樣方便、損傷較小，且易于保存，整體成本較低[12]?；诖耍e極尋求血液替代腦脊液的檢測方式，是改善標(biāo)志物檢測體驗(yàn)的重要方向，而單分子免疫檢測技術(shù)的出現(xiàn)恰好滿足了以上需求。借助單分子免疫檢測技術(shù)的超高靈敏特性，可充分檢測出血液樣本中的生物標(biāo)志物水平[13]，在神經(jīng)性退行性疾病的診斷中具有重要意義。

2.1.1 阿爾茲海默癥 阿爾茲海默癥是典型的神經(jīng)退行性疾病，其生理表現(xiàn)主要為Aβ 蛋白沉積與神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles）的形成，其中神經(jīng)纖維纏結(jié)是由Tau 蛋白組成，因此，檢測其Aβ 蛋白與Tau 蛋白濃度，是獲取其病情信息的重要方式[14]。Mielke MM 等[15]采用單分子檢測技術(shù)對464 名認(rèn)知正常者的血漿總Tau 含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，認(rèn)知正常者血漿總Tau 水平每升高1 個log 單位，其認(rèn)知障礙風(fēng)險可增加2.5 倍。Hwang SS 等[16]對耗散型石英晶體微量天平（QCM-D）技術(shù)與Simoa 技術(shù)在Aβ 蛋白檢測中的應(yīng)用價值進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)Simoa 的靈敏度為QCM-D 技術(shù)的500 倍，其檢測限分別為0.22 nmol/L 與125 nmol/L。由此可見，單分子免疫技術(shù)對阿爾茲海默癥標(biāo)志物具有積極檢測價值，有助于該病發(fā)生風(fēng)險及病情進(jìn)展的評估。

2.1.2 多發(fā)性硬化癥 多發(fā)性硬化癥屬于炎癥性神經(jīng)退行性疾病，據(jù)Ferraro D 等[17]研究證實(shí)，神經(jīng)絲輕鏈（neurofilament light，NfL）與多發(fā)性硬化癥患者疾病嚴(yán)重程度及殘疾進(jìn)展相關(guān)聯(lián)，該生物標(biāo)志物有作為多發(fā)性硬化癥疾病活動度的潛力。因此，臨床多以NfL 作為多發(fā)性硬化癥疾病的敏感生物標(biāo)志物，用于監(jiān)測組織損傷和MS 的治療效果[18]。Disanto G等[19]采用單分子陣列對健康對照組（n=254）與兩個獨(dú)立多發(fā)性硬化癥組（n=142、246）的血清NfL 水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，單分子陣列技術(shù)的檢測靈敏度是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)與電化學(xué)發(fā)光檢測的126、25 倍，該法可準(zhǔn)確量化健康對照組中預(yù)期的低NfL濃度，有助于異常值與正常值的準(zhǔn)確區(qū)分。綜合可見，單分子免疫檢測對多發(fā)性硬化癥標(biāo)志物具有較高靈敏度，診斷價值顯著。

2.1.3 脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào) 脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)是遺傳性共濟(jì)失調(diào)的主要類型。Wilke C 等[20]研究指出，NfL 可作為神經(jīng)元損傷的標(biāo)志物，在退行性共濟(jì)失調(diào)中發(fā)揮外周生物標(biāo)志物作用，用于預(yù)測脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)的小腦萎縮與臨床進(jìn)展。Ljungqvist JC等[21]采用新型超靈敏單分子陣列技術(shù)對患者血清NfL 濃度進(jìn)行了測定，檢出效果顯著。綜上可知，單分子免疫檢測技術(shù)可有效測定脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)的血清生物標(biāo)志物，有助于疾病的檢出與鑒別。

2.2 在傳染病領(lǐng)域中的應(yīng)用 目前，傳染病檢測多集中于病原體自身標(biāo)志物與細(xì)胞因子等方面。在病原體標(biāo)志物的檢測中，高分子免疫檢測技術(shù)對病原蛋白的檢測靈敏度較高，可作為核酸檢測的有效補(bǔ)充手段，對感染的診斷與病情監(jiān)測具有重要意義[22]。在細(xì)胞因子檢測方面，已有研究證實(shí)[23]，高分子免疫檢測技術(shù)可檢出血液中82%的細(xì)胞因子，而ELISA 法只能檢出25%。此外，高分子免疫檢測可在傳染病潛伏期和免疫反應(yīng)前，檢測其生物標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)更早期的實(shí)時診斷，為傳染病篩查、治療與疾病監(jiān)測提供有利幫助，對傳染病傳播概率的下降具有重要價值。

2.2.1 獲得性免疫缺陷綜合征 獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）簡稱艾滋病，由人類免疫缺陷病毒（HIV）感染引起，其免疫相關(guān)性病毒蛋白含量是反映疾病情況的重要標(biāo)志物，其中HIV p24 抗原是最豐富的HIV 蛋白，但常規(guī)方式尚無法早期檢測其HIV 特異性抗體[24]。基于此，有學(xué)者開發(fā)了超靈敏p24 定量分析的高分子免疫檢測技術(shù)，用以測定HIV 變化，其檢出限與定量限分別為2.5 fg/ml、7.6 fg/ml，較傳統(tǒng)免疫測定法高出400 倍[25]。在一項針對成人患者抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療研究中[26]，利用高分子免疫檢測技術(shù)對HIV 生長情況進(jìn)行了測定，研究發(fā)現(xiàn)，潛伏感染過程中HIV指數(shù)級復(fù)制僅發(fā)生于CD32-CD4+T 細(xì)胞中，只能通過此類高分子免疫檢測技術(shù)檢測到。由此可見，高分子免疫檢測技術(shù)對潛伏期HIV 具有良好檢出作用，有利于AIDS 病情的阻斷與控制。

2.2.2 結(jié)核病 結(jié)核?。╰uberculosis）是由結(jié)核桿菌感染引起的慢性傳染病，主要侵害人體肺部，以活動性肺結(jié)核的傳染性最為嚴(yán)重。因此，對可能發(fā)展為活動性結(jié)核病的潛伏感染患者需及時檢出并采取措施，但常規(guī)超敏反應(yīng)皮試試驗(yàn)、γ 干擾素釋放試驗(yàn)分析技術(shù)（IGRA）均無法有效區(qū)分潛伏性感染與活動性結(jié)核[27]。對此，Ben Salah E 等[28]利用高分子免疫檢測技術(shù)，對IGRA 無法區(qū)分的標(biāo)本進(jìn)行了高靈敏檢測，結(jié)果顯示，基于高分子免疫檢測技術(shù)開展的γ 干擾素檢測，其靈敏度是IGRA 技術(shù)的100 倍，可進(jìn)一步鑒別不確定結(jié)果中的真陽性與陰性樣本。以上研究說明，利用高分析免疫檢測技術(shù)，有助于結(jié)核病的鑒別與診斷。

2.2.3 新型冠狀病毒肺炎 新型冠狀病毒肺炎是指2019 新型冠狀病毒感染引起的急性呼吸道傳染病，其病原物為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）。目前為止，臨床尚無針對SARSCoV-2 特效藥。因此，早期診斷與防控是阻止其傳播的最有效手段[29]。2020 年12 月28 日，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)使用全自動高通量免疫分析儀器Simoa HD-X Analyzer檢測IgG 抗體，其檢測目標(biāo)為人體針對新冠病毒刺突蛋白區(qū)域產(chǎn)生的抗體，通過疑似感染者IgG 抗體的檢測開展COVID-19 診斷。據(jù)臨床研究顯示[30]，Simoa 對抗體檢測的敏感性高達(dá)100%，特異性為99.2%，由此可見，高分子免疫檢測技術(shù)可用于測定疫苗免疫誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)。此外，有研究證實(shí)[31]，通過高分子免疫檢測技術(shù)檢測免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子與趨化因子等超敏感蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物，有望實(shí)現(xiàn)COVID-19 的早期高靈敏度診斷，對輕、重癥區(qū)分及疾病感染進(jìn)程的監(jiān)測均具有重要意義。

2.3 在腫瘤領(lǐng)域中的應(yīng)用 腫瘤屬于復(fù)雜性疾病，根據(jù)癌變器官的不同可分為多種亞型，具有較高的致死風(fēng)險，其早期診斷尤為重要。據(jù)Wilson DH 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，使用單分子陣列檢測技術(shù)可有效測量根治性前列腺切除術(shù)后患者的血清前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）水平，且術(shù)后測量最低點(diǎn)PSA，對患者預(yù)后情況具有積極預(yù)測價值，可減少不必要的輔助放射，有利于復(fù)發(fā)等情況的及早發(fā)現(xiàn)與治療。Shi Y 等[33]基于高分子陣列技術(shù)開發(fā)了超靈敏定量血液LIF 檢測試劑盒，用于測定胰腺導(dǎo)管腺癌患者的血液LIF 水平，以監(jiān)測其疾病變化。另有研究應(yīng)用高分子陣列技術(shù)開發(fā)了細(xì)胞外囊泡免疫測定方法，用于通用細(xì)胞外囊泡與腫瘤衍生細(xì)胞外囊泡的測定，在腫瘤診斷中更具有積極評估作用?？傊?，高分子免疫檢測技術(shù)對腫瘤標(biāo)志物診斷具有較高檢測價值，有助于患者預(yù)后與治療反應(yīng)的評估，對復(fù)發(fā)篩查患者的靶向二級治療提供了良好基礎(chǔ)。除此之外，受到檢測靈敏度的限制，當(dāng)前臨床使用的腫瘤標(biāo)志物依然為血液水平較高的普適性標(biāo)志物，在腫瘤疾病的檢測中，其敏感度及特異性均存在一定限制。在此背景下，高分子免疫檢測在發(fā)現(xiàn)新型高特異性標(biāo)志物方面具有較大潛力。Limor C 等[34]研究顯示，應(yīng)用單分子陣列技術(shù)可對microRNA 進(jìn)行數(shù)字直接檢測，對提高檢測效率及大規(guī)模篩選新型靶標(biāo)具有意義。

3 總結(jié)與展望

單分子免疫檢測技術(shù)具有超高靈敏度，可充分反映疾病的病理信息與發(fā)展進(jìn)程，在神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、傳染病等疾病的體外診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景，大大推動了相關(guān)疾病的早期診斷、治療與藥物開發(fā)。近年來，以Simoa 技術(shù)為代表的單分子免疫檢測技術(shù)已逐步向高靈敏、高通量、自動化等方向發(fā)展，其臨床應(yīng)用也日趨成熟，有望成為重大疾病早期診斷與預(yù)后評估的有力工具。但目前為止，單分子檢測技術(shù)被正式商業(yè)化的產(chǎn)品極少，且均為國外研制，國內(nèi)則主要停留在實(shí)驗(yàn)室科研層面，其應(yīng)用發(fā)展尚面臨著許多挑戰(zhàn)，有待技術(shù)層面與商業(yè)化層面的多重優(yōu)化。