陳占秀，李善文，黃和強(qiáng)，祁萬(wàn)軍，車(chē)富紅，孔令武，馮聲寶

（1.中國(guó)青稞酒研究院，青?；ブ?810500；2.青?；ブ煊拥虑囡乒煞萦邢薰?，青海互助 810500）

白酒的釀造方式是多微共酵，科學(xué)認(rèn)識(shí)各種微生物在白酒中的作用，對(duì)于闡明白酒中復(fù)雜物質(zhì)的來(lái)源，科學(xué)提高白酒品質(zhì)與內(nèi)涵，提升白酒安全性有著非常重要的意義[1]。由于白酒釀造中微生物種類(lèi)和數(shù)量關(guān)系的不同，在白酒生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程中的代謝產(chǎn)物也不同，加上地域、氣候、環(huán)境等條件的差異，各白酒生產(chǎn)企業(yè)釀造中微生物種類(lèi)及數(shù)量存在較大差異，形成了風(fēng)格風(fēng)味迥異的白酒產(chǎn)品[2]。以青稞為原料，中低溫大曲為糖化發(fā)酵劑的青稞酒產(chǎn)地位于青海省互助縣，青藏高原上獨(dú)特的地理環(huán)境造就了獨(dú)特的微生物環(huán)境，賦予了青稞酒獨(dú)特的風(fēng)格特點(diǎn)。青稞酒釀造采用“清蒸清燒四次清工藝”，具有區(qū)別于絕大多數(shù)以高粱為原料釀造酒的獨(dú)特工藝特點(diǎn)，也就是“種釀合一”“曲糧合一”和“巖木合一”，即釀酒原料種植基地和釀造基地高度合一，釀酒原料和制曲原料高度合一，發(fā)酵窖池采用天然的昆侖山花崗巖為壁，祁連山松木板為底，這些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，賦予了青稞酒區(qū)別于其他白酒的典型風(fēng)格。

白酒中的風(fēng)味物質(zhì)主要是由發(fā)酵過(guò)程中微生物群落代謝生成，研究青稞酒釀造微生物和代謝，有助于解析青稞酒的風(fēng)味信息。關(guān)于傳統(tǒng)清香型白酒發(fā)酵微生物菌群的研究已有報(bào)道，多數(shù)研究采用微生物純種培養(yǎng)技術(shù)，研究發(fā)酵機(jī)理并分離獲得功能性微生物，發(fā)現(xiàn)了包括扣囊腹膜孢酵母、紅曲霉、芽孢桿菌、乳酸菌、白地霉等菌株[3-6]。純培養(yǎng)技術(shù)局限性較大，現(xiàn)代釀造微生物研究逐步采用高通量測(cè)序等現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，揭示釀造及制曲過(guò)程中的微生物結(jié)構(gòu)，并結(jié)合HS-SPME-GC-MS 等關(guān)聯(lián)分析可初步解析出釀造風(fēng)味功能菌，如Lactobacillus為乳酸乙酯提供前體物質(zhì)，提升白酒的醇厚感[7]；Pichia可以合成多種酚類(lèi)物質(zhì)及其前體物質(zhì)[8]，還可以合成3-甲基丁醛、2-苯乙醇、苯乙酸乙酯和2,3-丁二酮[9]；Saccharomyces是乙醇的主要產(chǎn)生微生物，還可以產(chǎn)生大量高級(jí)醇和大量酯類(lèi)物質(zhì)[10]；Aspergillus主要產(chǎn)生糖化酶，用以分解淀粉[11-12]。通過(guò)對(duì)功能菌的代謝研究，可分析出白酒中風(fēng)味物質(zhì)主要來(lái)源，信春暉等[14]通過(guò)分析得出高級(jí)醇主要是由酵母菌利用糖及氨基酸代謝而形成的，酯高的原因在于生香酵母豐富等。本試驗(yàn)在青稞酒釀造微生物高通量測(cè)序和風(fēng)味功能菌研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分離青稞酒釀造功能菌，在青稞原料中進(jìn)行培養(yǎng)及代謝研究，一方面為青稞酒菌種庫(kù)的建立奠定基礎(chǔ)，另一方面也為青稞酒中風(fēng)味來(lái)源分析提供新視角，對(duì)青稞酒釀造中優(yōu)良菌的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品

分別采集青稞酒發(fā)酵過(guò)程中一米查0 d、5 d、10 d、15 d、20 d、25 d 的酒醅樣本，二米查、三米查、四米查酒醅同樣每隔5 d采集樣品直至發(fā)酵結(jié)束。

1.1.2 試劑及耗材

無(wú)水葡萄糖、蛋白胨、瓊脂粉、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、MRS、冰乙酸、氯化鈉，國(guó)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；真菌基因組快速提取試劑盒、細(xì)菌基因組快速提取試劑盒，酵母提取物，引物27f、1492r、NL1、NL4、Tris、Taq DNA 聚合酶，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker、dNTP Mixture,10mM、4S Green核酸染色劑，EDTA 溶液、pH8.0，瓊脂糖，生工生物工程股份有限公司；色譜醇，德國(guó)默克；薄荷醇，德國(guó)Dr.E。

青稞糖液制備：稱(chēng)取適量青稞（500 g對(duì)應(yīng)加2 L水），進(jìn)行破碎浸泡，加入適量高溫淀粉酶蒸煮2 h，當(dāng)糖度達(dá)到15°Bx 時(shí)停止蒸煮，冷卻后加入50 U/g糖化酶，于60 ℃烘箱保溫過(guò)夜處理，兩層紗布過(guò)濾，濾液8000 r/min 離心10 min，取上清液，加水稀釋到適當(dāng)糖度10°Bx，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 儀器設(shè)備

潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司；HYG-B 全溫?fù)u瓶柜，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱，泰斯特儀器有限公司；高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；厭氧工作站、高速冷凍離心機(jī)、梯度PCR 儀、蛋白核酸測(cè)定分光光度計(jì)，美國(guó)賽默飛科技公司；凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀，北京六一生物科技有限公司；超聲波處理儀，天津Autoscience 公司；Milli-O 超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore 公司；制冰機(jī)，斯科茨曼制冰系統(tǒng)有限公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC6890N-MSD5975），美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 操作流程

取樣→混合→菌懸液→傾倒平皿→稀釋涂布平板→培養(yǎng)→平板計(jì)數(shù)、計(jì)算菌落總數(shù)→菌種分離純化→核酸的提取和PCR 擴(kuò)增測(cè)序→青稞糖液培養(yǎng)→酸度、乙醇含量、代謝等檢測(cè)。

1.2.2 微生物分離純化[15]

樣品預(yù)處理：稱(chēng)取5 g 酒醅樣品，放入100 mL滅菌后的0.9%生理鹽水中，30 ℃搖床200 r/min 振蕩10 min。

微生物檢測(cè)分離：吸取振蕩后的菌懸液100 μL，用0.9%的生理鹽水稀釋到10-1～10-5等不同梯度，分別吸取100 μL 稀釋后的各菌懸液在不同培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：濕度60 %，溫度方面真菌30 ℃，細(xì)菌37 ℃，培養(yǎng)48～72 h，厭氧培養(yǎng)操作在厭氧工作站進(jìn)行。觀(guān)察記錄菌落信息，挑取平板上形態(tài)特征不同的單菌落，通過(guò)劃線(xiàn)純化，接種于斜面（4 ℃）保藏和甘油冷凍（-80 ℃）保藏。

1.2.3 核酸提取方法[16]

分離純的菌株分別進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，酵母菌用YPD 液態(tài)培養(yǎng)基、細(xì)菌LB 培養(yǎng)基、厭氧菌用PYG液態(tài)培養(yǎng)基，取2 mL 菌液，加入滅菌后的離心管中，在4 ℃下以12000 r/min 離心2 min 后棄上清液收集菌體，用基因組快速提取試劑盒進(jìn)行核酸提??；向離心管中加入50 μL 超純水，溶解核酸，用核酸濃度儀測(cè)定核酸濃度和A260/A280 值（1.8～2.0）。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及瓊脂糖電泳檢測(cè)

對(duì)所提取的細(xì)菌基因組DNA 進(jìn)行16S rRNA基因片段擴(kuò)增，采用細(xì)菌16S rRNA 基因的通用引物：正向引物F27（AGAGTTTGATCCTGGCTCA），反向引物R1492（GGTTACCTTGTTACGACTT）；真菌基因片段擴(kuò)增選擇通用引物：NL1（GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG），NL4（GGTCCGTGTTTCAAGACGG）；PCR 采用50 μL 體系，擴(kuò)增反應(yīng)條件如表1，反應(yīng)完成后，取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)PCR 擴(kuò)增片段并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對(duì)，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。

表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

1.2.5 純菌培養(yǎng)方法

于250 mL 三角瓶中分別封裝100 mL 青稞糖液（10°Bx）進(jìn)行真菌培養(yǎng)，乳桿菌等用YPG液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)，每株菌做2 個(gè)平行，按5%的接菌量接入純菌種，用無(wú)菌水密封發(fā)酵栓，恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件30 ℃、200 r/min，每隔12 h 稱(chēng)重檢測(cè)CO2失重量，12 h 之內(nèi)CO2失重小于0.2 g 時(shí)停止培養(yǎng)，離心取上清液檢測(cè)風(fēng)味物質(zhì)及其他理化指標(biāo)。

1.2.6 代謝分析

運(yùn)用頂空固相微萃取技術(shù)(HS-SPME)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)方法對(duì)揮發(fā)性產(chǎn)物進(jìn)行分析，色譜柱為DB-Wax（30 m×0.25 mm×0.25 μm，J&W Scientific），內(nèi)標(biāo)為分析級(jí)薄荷醇（34.5 μg/L），儀器條件：50 ℃保持2 min，以6 ℃/min 升到230 ℃保持15 min，分流比10∶1，取8 mL樣品放入裝有3 g Na-Cl 的頂空進(jìn)樣瓶中，加入4μL 的薄荷醇為內(nèi)標(biāo)，頂空瓶于50 ℃恒溫萃取45 min，萃取結(jié)束后進(jìn)行GC-MS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞酒釀造功能菌確認(rèn)

通過(guò)Illumina Miseq 測(cè)序技術(shù)，黃和強(qiáng)等[17]分析了青?；ブ貐^(qū)的夏季和冬季青稞酒酒醅中微生物種群結(jié)構(gòu)及多樣性，Weissella、Lactobacillus、Pichia、Saccharomyces及Hyphopichia是青稞酒發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物；劉沖沖等[18]統(tǒng)計(jì)分析青稞酒發(fā)酵過(guò)程中微生物群落，共獲得9 個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬和8 個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，與其他清香型白酒相比有新的優(yōu)勢(shì)真菌屬[19]，Pichia、Hyphopichia、Komagataella、Aspergillus、Saccharomyces和Candida在整個(gè)青稞酒發(fā)酵過(guò)程具有一定的優(yōu)勢(shì)。對(duì)于細(xì)菌屬，在發(fā)酵0 d 占優(yōu)勢(shì)的是Weissella、Pantoea、Acinetobacter和Staphylococcus，從 發(fā) 酵5 d 開(kāi) 始Lactobacillus從25.80 %增加到99.11 % (30 d)，取代其他微生物成為細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)微生物。通過(guò)相關(guān)性分析確定在青稞酒發(fā)酵過(guò)程中主要的風(fēng)味功能菌包含Aspergillus、Komagataella、Lactobacillus、Pichia、Saccharomyces和Weissella。

2.2 青稞酒釀造微生物分離

通過(guò)純培養(yǎng)方法分離青稞酒酒醅微生物，分離得到61 株細(xì)菌，90 株酵母菌，27 株霉菌。通過(guò)分子生物學(xué)鑒定，細(xì)菌主要為葡萄球菌屬(Staphylococcus)10 株，芽孢桿菌屬(Bacillus)41 株，海洋桿菌屬（Oceanobacillus）2 株，梭狀芽孢菌屬（Clostridium）1株，乳桿菌屬（Lactobacillus）3 株，賴(lài)氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）3 株，蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）2 株；霉菌主要有鏈格孢（Alternaria）1 株，曲酶屬（Aspergillus）9 株，卷霉屬（Circinella）1 株，螺旋聚孢霉（Clonostachys）1 株，鐮刀菌屬（Fusarium）1 株，橫梗霉屬（Lichtheimia）1 株，毛霉菌（Mucor）1 株，擬青霉屬（Paecilomyces）1 株，青霉屬（Penicillium）3 株，根毛霉屬（Rhizomucor）1 株，籃狀菌屬（Talaromyces）1 株，外瓶霉（Exophiala）1 株，地霉屬（Geot-richum）1 株；酵母菌有釀酒酵母（Saccharomyces）37株，畢赤酵母屬（Pichia）17 株，異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）11 株，德巴利酵母屬（Debaryomyces）2 株，有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）1 株，生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）4 株，伊薩酵母屬（Issatchenkia）4株，單胞菌屬（Kazachstania）1株，葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum）2 株，覆膜孢酵母（Saccharomycopsis) 4 株，有孢圓酵母屬（Torulaspora）5株。

2.3 Saccharomyces cerevisiae代謝檢測(cè)

青稞酒酒醅微生物中分離鑒定出Saccharomyces cerevisiae37 株，部分菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(WL)上菌落特征見(jiàn)圖1。將其接種于青稞汁中培養(yǎng)，并利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)連用方法，分析28 株釀酒酵母液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物。

圖1 青稞酒中部分釀酒酵母菌落形態(tài)

經(jīng)過(guò)分析可知，Saccharomyces cerevisiae定性到的化合物數(shù)量和種類(lèi)都較多，有共有的也有特有的，總風(fēng)味種類(lèi)定性到290 種，主要集中在醇類(lèi)、酸類(lèi)和酯類(lèi)中，也有少量的芳香族化合物、醛酮類(lèi)其他雜環(huán)化合物等，部分菌株在青稞原料中的代謝情況見(jiàn)圖2。

圖2 Saccharomyces cerevisiae風(fēng)味物質(zhì)熱圖

通過(guò)風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)，Saccharomyces cerevisiae在青稞糖液發(fā)酵中相對(duì)含量較高的代謝產(chǎn)物醇類(lèi)有苯乙醇、異戊醇，以及少量的正丁醇、正庚醇、正己醇、正辛醇等，正丁醇、異戊醇都呈苦味，其中正丁醇的苦味較重，異戊醇則是微帶甜苦[20]，適量的高級(jí)醇是青稞酒香味的主要組成成分，但當(dāng)含量過(guò)高時(shí)，會(huì)給酒體帶來(lái)苦澀味；酸類(lèi)物質(zhì)有正癸酸、辛酸、乙酸、己酸等；酯類(lèi)有乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯、正己酸乙酯等；萜烯類(lèi)檢測(cè)出21 種，有橙花叔醇、α-松油醇、芳樟醇、香茅醇、α-紫羅酮、橙化基丙酮、大馬酮、傘花烴、α-法呢烯、α-柏木烯、姜黃烯、β-紅沒(méi)藥烯、花側(cè)柏烯、羅漢柏烯、菖蒲烯、α-紅沒(méi)藥烯、β-法呢烯、萜品油烯等，所有Saccharomyces cerevisiae代謝中均檢測(cè)出相對(duì)含量較高的的大馬酮，占萜烯類(lèi)的49%。

2.4 Wickerhamomyces anomalus代謝檢測(cè)

青稞酒酒醅和大曲中分離鑒定出Wickerhamomyces anomalus21株，部分菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(WL)上菌落特征見(jiàn)圖3，利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)連用方法，分析17 株Wickerhamomyces anomalus在青稞汁中的發(fā)酵產(chǎn)物，如圖4所示。

圖3 青稞酒中部分Wickerhamomyces anomalus菌落形態(tài)

Wickerhamomyces anomalus定性到的化合物種類(lèi)有141 種，主要以醇類(lèi)、酯類(lèi)、酸類(lèi)為主，也有一定量的烯烴類(lèi)和呋喃類(lèi)以及少量醛酮類(lèi)和酚類(lèi)，部分菌株在青稞原料中的代謝情況見(jiàn)圖4。

圖4 Wickerhamomyces anomalus風(fēng)味物質(zhì)熱圖

通過(guò)風(fēng)味物質(zhì)分析，Wickerhamomyces anomalus在青稞糖液發(fā)酵中相對(duì)含量較高的醇類(lèi)代謝產(chǎn)物有異丁醇、苯乙醇、橙花醇，其中異丁醇極苦；酸類(lèi)有辛酸、乙酸、正癸酸；酯類(lèi)主要為乙酸乙酯，占酯類(lèi)總含量的74.3%，該菌是青稞酒釀造中主產(chǎn)乙酸乙酯的微生物，在青稞酒釀造中添加適量Wickerhamomyces anomalus菌種，能提高原酒乙酸乙酯含量；在發(fā)酵液中還定性出2,3-丁二醇，該物質(zhì)和其他多元醇在酒中起助香作用，能增加酒體的綿、甜、柔軟及細(xì)膩感[21]。

白酒中的萜烯類(lèi)化合物具有呈香或呈味作用，除了單萜和少量的倍半萜具有氣味外，大部分萜烯類(lèi)物質(zhì)呈現(xiàn)一定的苦味[22]，萜烯類(lèi)物質(zhì)一般都有一定的功能活性作用，因此，萜烯類(lèi)物質(zhì)一直是白酒中的熱門(mén)研究對(duì)象。青稞酒功能菌Wickerhamomyces anomalus發(fā)酵液中共定性出18 種萜烯類(lèi)物質(zhì)，分別為橙花醇、里那醇、α-松油醇、香茅醇、橙花叔醇、金合歡醇、α-萜品醇、反式-橙花叔醇、椰子醛、β-大馬酮、月桂烯、α-蒎烯、α-柏木烯、β-紅沒(méi)藥烯、α-金合歡烯、長(zhǎng)葉蒎烯、d-檸檬烯、柏木腦等，其中橙花醇為Wickerhamomyces anomalus代謝主要萜烯醇，占萜烯類(lèi)總含量的70%。

2.5 青稞酒釀造功能菌代謝研究

據(jù)《青海通史》記載，互助青稞酒釀造始于明代中后期，悠久的釀造歷史，適宜的氣候條件，開(kāi)放式的固態(tài)發(fā)酵體系，使青稞酒發(fā)酵環(huán)境中存在大量馴化了的功能菌參與釀造，為了解其他功能菌在青稞酒中的代謝貢獻(xiàn)，對(duì)Torulaspora delbrueckii、Hyphopichia burtonii、Kazachstania unispora、Hanseniaspora uvarum、Pichia kudriavzevii、Pichia scaptomyzae、Pichia membranifaciens、Pichia manshurica等8株菌進(jìn)行揮發(fā)性代謝物質(zhì)檢測(cè)，如圖5所示。

圖5 青稞酒功能酵母菌代謝特征風(fēng)味相對(duì)含量

Saccharomyces cerevisiae整體風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)總含量遠(yuǎn)高于其他菌株，是青稞酒釀造中的優(yōu)勢(shì)菌和功能菌，且發(fā)酵速率最快，發(fā)酵能力最強(qiáng)，在釀造中主導(dǎo)著乙醇發(fā)酵。Pichia membranifaciens風(fēng)味物質(zhì)含量也高于其他菌株，該菌產(chǎn)乙酸乙酯能力最高，產(chǎn)乙酸能力僅次于釀酒酵母，在青稞酒釀造應(yīng)用實(shí)驗(yàn)中添加適量此菌種，表現(xiàn)出了高出酒率和原酒高酸、高酯的能力。大部分酵母菌在青稞原料中代謝較多的是苯乙醇、異戊醇、異丁醇等，這些物質(zhì)都有一定的苦味，通過(guò)蒸餾帶入到青稞酒中，適量的高級(jí)醇是青稞酒香味的主要組成成分，含量過(guò)高時(shí)，會(huì)給酒體帶來(lái)苦澀味。

在萜烯類(lèi)物質(zhì)方面，Saccharomyces cerevisiae和Torulaspora delbrueckii代謝較高含量的萜烯類(lèi)，包括芳樟醇、橙花叔醇、里那醇、香茅醇、香葉醇等，代謝γ-壬內(nèi)酯能力也遠(yuǎn)高于其他菌株，Hanseniaspora uvarum、Pichia membranifaciens也能代謝較高含量的香葉醇，還能代謝α-松油醇、橙花醇、雪松醇、β-大馬酮、香葉基丙酮、2-茨醇、2-莰酮、月桂烯、2-蒎烯等萜烯類(lèi)物質(zhì)。在前期研究中將代謝萜烯的酵母與典型清香型酒進(jìn)行對(duì)比分析，Wickerhamomyces anomalus、Pichia membranifaciens等 代謝萜烯菌含量高于典型清香型白酒，Saccharomyces cerevisiae夏季略低，秋季含量高于典型清香型白酒，含量更高的萜烯轉(zhuǎn)化酵母有助于提高青稞酒中萜烯種類(lèi)與含量。

白酒中的醇類(lèi)物質(zhì)能為白酒增甜增香，在酒中可起到調(diào)和作用，醇類(lèi)的味覺(jué)作用在白酒中也相當(dāng)重要，它是白酒綿甜和香氣的基本來(lái)源。醇是酯、酸的前驅(qū)，能增加白酒的甜味，并讓香氣濃郁持久，如果過(guò)量，則會(huì)使白酒發(fā)苦、發(fā)臭，香氣不協(xié)調(diào)。

2.6 青稞酒中功能細(xì)菌代謝分析

細(xì)菌在釀酒微生物群落中扮演著重要角色，主要參與形成白酒復(fù)雜的風(fēng)味和香氣[21]，通過(guò)特異性分離，篩選到青稞酒中5 株細(xì)菌并進(jìn)行代謝分析，分別為Clostridium sp、Bacillus subtilis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus acetotolerans、Lactobacillus paracasei，將5 株細(xì)菌純種液態(tài)培養(yǎng)后，氣相色譜分析液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物，主要有醇類(lèi)、酸類(lèi)、酮類(lèi)及少量酯類(lèi)、醛類(lèi)等，與真菌代謝比較，細(xì)菌代謝物質(zhì)中吡嗪類(lèi)含量明顯高于真菌，主要有2-乙基-5-甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-甲基-5-異丙基吡嗪、3,5-二乙基-2-甲基-吡嗪、2-丁基-3,5-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪等，吡嗪類(lèi)化合物蒸汽壓低、易揮發(fā)，香勢(shì)強(qiáng)、香味閾值低，在食品中為重要的風(fēng)味物質(zhì)[21]。嗜熱芽孢桿菌可以代謝2,3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮（醋酉翁）等物質(zhì)形成吡嗪類(lèi)化合物，為酒體帶來(lái)焙烤香氣和焦香味，通過(guò)本文前期分析，吡嗪類(lèi)前體物質(zhì)2,3-丁二醇，部分酵母菌及Saccharomyces cerevisiae等都會(huì)代謝產(chǎn)生，Bacillus subtilis代謝中也定性出2,3-丁二醇，為吡嗪類(lèi)形成提供條件。

細(xì)菌不僅代謝豐富的吡嗪類(lèi)，還有5 株細(xì)菌共有的苯乙醇、1-壬醇，如圖6，Bacillus subtilis和Lactobacillus paracasei代謝風(fēng)味相對(duì)含量較高；與其他4 株細(xì)菌相比，Bacillus subtilis能代謝2,3-丁二醇、橙花醇、異戊酸、己酸、香葉基丙酮、2-戊酮、4-乙基愈創(chuàng)木酚、月桂烯等物質(zhì)，且乙酸、苯乙醇、2.3-丁二醇、異戊酸、3-羥基-2-丁酮等相對(duì)含量較高；Lactobacillus paracasei能代謝較高含量的2,3-丁二酮、乙酸和丁酸；Clostridium sp、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus acetotolerans中也定性出一定量的異戊醇、苯乙醇、丁酸等，這些功能菌在青稞酒釀造中代謝豐富的風(fēng)味物質(zhì)，形成了青稞酒獨(dú)特的風(fēng)格。

圖6 細(xì)菌代謝風(fēng)味物質(zhì)Venn圖

3 結(jié)論

前期通過(guò)高通量測(cè)序?qū)η囡漆勗旄鳝h(huán)節(jié)和不同季節(jié)釀造微生物結(jié)構(gòu)有了一定的研究基礎(chǔ)，結(jié)合頂空固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)，揭示了青稞酒釀造中的風(fēng)味功能菌，本文在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)行微生物分離獲取活體菌株，經(jīng)測(cè)序，酵母菌有26 個(gè)種屬，霉菌19 個(gè)種屬，細(xì)菌27 個(gè)種屬，為青稞酒菌種庫(kù)建立和釀酒微生物研究奠定基礎(chǔ)。

代謝方面，通過(guò)青稞酒釀造優(yōu)勢(shì)菌和風(fēng)味功能菌在青稞原料中的代謝分析，發(fā)現(xiàn)Saccharomyces cerevisiae可代謝苯乙醇、異戊醇及少量正丁醇、正庚醇、正己醇、正辛醇等，酸類(lèi)物質(zhì)正癸酸、辛酸、乙酸、己酸等，酯類(lèi)物質(zhì)乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯、正己酸乙酯等，另外定性出21 種萜烯類(lèi)物質(zhì)，如芳樟醇、香茅醇、α-紫羅酮、大馬酮、傘花烴等。Wickerhamomyces anomalus在青稞糖液發(fā)酵中相對(duì)含量較高的醇類(lèi)代謝產(chǎn)物有異丁醇、苯乙醇、橙花醇、辛酸、乙酸、正癸酸、乙酸乙酯等，萜烯類(lèi)18 種，如橙花醇、里那醇、α-蒎烯等，細(xì)菌除了吡嗪類(lèi)物質(zhì)豐富外，也能代謝較多的異戊醇、苯乙醇、丁酸。張芬軍等[23]通過(guò)HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析方法對(duì)青稞酒風(fēng)味成分進(jìn)行了定性定量分析，共鑒定出天佑德青稞酒中含有32 種萜烯類(lèi)物質(zhì)，有香茅醇、香葉醇、橙花醇、里那醇、β-大馬酮、芳樟醇、2-蒎烯等，通過(guò)代謝研究，上述萜烯類(lèi)物質(zhì)都是青稞酒功能菌、優(yōu)勢(shì)菌代謝產(chǎn)生，如Saccharomyces cerevisiae代謝的β-大馬酮占萜烯類(lèi)的49 %、Wickerhamomyces anomalus代謝的橙花醇占萜烯類(lèi)的70 %，β-大馬酮具有花香、蜜香特征，是清香型白酒中的重要化合物。乙酸乙酯、乙酸等是青稞酒的大骨架成分，青稞酒中還有仲丁醇、正丙醇、異丁醇、正戊醇、異戊醇、苯乙醇等微量成分，豐富的微生物代謝風(fēng)味物質(zhì)形成了天佑德青稞酒獨(dú)特的風(fēng)格，研究青稞酒微生物代謝物質(zhì)，能快速找到青稞酒中化合物對(duì)應(yīng)的主要代謝微生物，有利于釀造功能菌的選擇和應(yīng)用，為青稞酒菌種庫(kù)的建立奠定基礎(chǔ)，也能為青稞酒風(fēng)味物質(zhì)來(lái)源解析提供新視角。