張 龍，梁振榮，郝俊光，李官連，葉靜萱，萬瑞杰，吳金燕，周碧宇，羅 丹

（1.勁牌廣西天龍泉酒業(yè)有限公司，廣西河池 546400；2.欽州市食品風(fēng)味分析與調(diào)控重點實驗室，北部灣大學(xué)食品工程學(xué)院，廣西欽州 535011）

酯類化合物是白酒中最重要的一類香氣成分，主要由它們區(qū)分各類不同香型的白酒[1-3]。酯類化合物形成的途徑有兩個，一是酵母菌合成產(chǎn)生的酯類，這是主要的途徑；二是白酒在蒸餾和存儲過程中發(fā)生酯化反應(yīng)，從而產(chǎn)生酯類化合物，這一途徑在常溫下反應(yīng)比較緩慢，需要很長時間的平衡，酯類含量會不斷增加[4]。米香型白酒香氣組成主要為乳酸乙酯[5]。乳酸乙酯由乳酸和酯類發(fā)生反應(yīng)形成[6]。白酒中的有機酸種類很多[7]，含量較大的是乳酸和乙酸。酸類化合物具有維持酯的香氣和調(diào)整酒的風(fēng)味的作用[8]。這些酸類主要來源于微生物的發(fā)酵，另一部分來源于原料本身[9]。因此想要提高酒的風(fēng)味品質(zhì)[10]，可以適當(dāng)添加乳酸菌微生物進行發(fā)酵實驗，對提高原酒酒體品質(zhì)有重要的作用[11-12]。

米香型白酒是白酒四大香型之一，在兩廣地區(qū)非常流行，以大米作基礎(chǔ)原料，小曲作輔助材料，經(jīng)清洗、蒸煮、攤晾、半固態(tài)糖化發(fā)酵、蒸餾等多道工藝釀造出白酒，酒體協(xié)調(diào)飽滿、濃郁且米香持久，因米香風(fēng)格著稱[13]。半固態(tài)法發(fā)酵[14]是米香型白酒工藝的特征，采取傳統(tǒng)固態(tài)糖化和近代液態(tài)發(fā)酵聯(lián)合法[15]。

白酒在發(fā)酵過程中以根霉菌[16]和酵母菌[17]為主要發(fā)酵微生物。為了使原酒得到更好的口感和風(fēng)味，在白酒的釀制過程中會添加乳酸菌[18]。過量乳酸菌的存在會對白酒發(fā)酵產(chǎn)生負面影響，所以在生產(chǎn)中可通過控制乳酸菌的數(shù)量來控制乳酸乙酯的含量，以保證白酒的品質(zhì)[19]。目前，米香型白酒在市場上呈現(xiàn)風(fēng)味多樣化，不同工廠的風(fēng)味物質(zhì)分布差異非常大[20]。關(guān)于米香型白酒接入乳酸菌對發(fā)酵過程乳酸和乳酸乙酯變化的影響少有報道，有待進一步細化研究[21]。針對乳酸菌在中國白酒發(fā)酵中的地位及作用并未有相關(guān)深入研究報道[22]。本研究從米香型白酒發(fā)酵液中分離的8 株乳酸菌和2 株實驗室乳酸菌中篩選出高產(chǎn)乳酸菌，以不添加乳酸菌實驗作空白對比[23]，跟蹤優(yōu)化菌株發(fā)酵過程的乳酸變化，以期闡明乳酸菌對米香型白酒中乳酸和乳酸乙酯的重要影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：米香型白酒發(fā)酵醪，廣西天龍泉酒業(yè)有限公司；米根霉曲，糖化力34 g/100 g，廣西天龍泉酒業(yè)有限公司。

菌種及耗材：酵母菌，發(fā)酵力37 %vol，廣西天龍泉酒業(yè)有限公司；晚稻大米，淀粉含量75 %，南寧市欣和福糧油有限公司；乳酸菌，廣西天龍泉酒業(yè)有限公司。

儀器設(shè)備：Alliance 高效液相色譜儀，配備2695HPLC 分離單元、2996 PDA 檢測器、Empower工作站，美國Waters 儀器公司；DK-98-II 電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；INNOVA 43R落地式低溫搖床，上海巴玖實業(yè)有限公司；H1850高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；ME204E 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Cascada I 實驗室超純水系統(tǒng)，美國Pall 公司；0.22 μm SLGP 033RB 針頭濾膜，美國Millipore公司；PHS-3E 雷磁pH 計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌種子的培養(yǎng)

乳酸菌來源：從醪液中篩選和實驗室乳酸菌。從醪液中篩選：取發(fā)酵天數(shù)靠前和靠后的醪液分離乳酸菌，表現(xiàn)在MRS 培養(yǎng)基平板上有溶解碳酸鈣的透明圈的大乳白、小灰白，且微凸的為乳酸菌菌落，經(jīng)過分離[24]，得到8 株乳酸菌。對從白酒醪中分離出的8 株乳酸菌和實驗室現(xiàn)有的2 株乳酸菌進行分離和篩選[25]，然后把篩選出的較優(yōu)菌株進行產(chǎn)酸[26]、耐酸[27]、耐酒精實驗[28]，得到優(yōu)選菌株2 株，分別進行發(fā)酵實驗。

1.2.2 米香型白酒發(fā)酵工藝流程

洗米→蒸煮→攪拌攤晾→入罐→下曲攪拌→固態(tài)糖化→加水發(fā)酵→蒸餾

1.2.3 米香型白酒發(fā)酵工藝要點

（1）洗米：取1 kg米，淘洗2～3次即可。

（2）蒸飯：按1∶1 的比例加入1 L 自來水，搖勻，使大米攤平于電飯鍋中煮20 min，保溫5 min 后可進行下一步驟。把勺子或筷子一起放入滅菌鍋，121 ℃滅菌30 min，備用。

（3）攪拌攤晾：趁熱取出米飯攪拌，使米飯降溫到30 ℃左右。

（4）入罐：盡量在安全無菌條件下，把米飯轉(zhuǎn)移到滅過菌的固定罐中。

（5）下曲攪拌：稱量成品混合酒曲（根酶∶酵母=1∶10）1%，即10 g 曲倒撒在飯面上，用滅菌過的勺子或者筷子攪拌均勻。乳酸菌的接入則是在攪拌與糖化之間進行的。

（6）固態(tài)糖化：放入恒溫烘箱30 ℃下糖化24 h，即可加水轉(zhuǎn)入發(fā)酵。

（7）加水發(fā)酵：按照130%的比例加水1.3 L，放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱，發(fā)酵從加水時開始算起，發(fā)酵13 d。

（8）蒸餾：發(fā)酵到15 %vol～18 %vol 即可停止發(fā)酵，開始蒸餾。

1.2.4 優(yōu)選乳酸菌的篩選實驗

（1）產(chǎn)酸實驗。比較實驗室乳酸菌菌株和從醪液中分離的乳酸菌菌株的產(chǎn)酸能力。從MRS 固態(tài)培養(yǎng)基斜面上選取的菌株和實驗室乳酸菌菌株，在米曲汁培養(yǎng)基中活化2～3 次；通過加熱使MRS 液態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)微生物和活細胞全部消滅后取10 mL，把經(jīng)挑選取得的一到兩環(huán)乳酸菌菌群接入其中，搖床37 ℃下恒溫培養(yǎng)1 d，取培養(yǎng)液0.1%接到50 mL滅過菌的MRS液態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)，在30 ℃下培養(yǎng)48 h，酸堿滴定法(GB/T 12456—1990)測定其總酸度，用吉爾涅爾度°T 表示，用精密度高的pH 計檢測其游離酸度。每樣品重復(fù)2次。

（2）耐酒精實驗。經(jīng)過一級篩選后的乳酸菌菌株，再進行耐酒精性檢測，將耐受酒精力較好的菌株保管好。將篩選出的菌株按1 %比例分別接種于溶液體積為20 mL 且乙醇含量分別為0%、4%、8%、12%、16%的米曲汁培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)24 h后再分別培養(yǎng)48 h，測定其在檢測波長605 nm 下的OD值和對應(yīng)pH值。每株菌做2次重復(fù)測定。

（3）不同pH 值對優(yōu)選菌株生長和產(chǎn)酸能力的影響。取含乳酸菌的液態(tài)MRS 培養(yǎng)基富集培養(yǎng)24～36 h，取旺盛生長期的富集液，按1 %接種量接入20 mL 的MRS 液態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基的pH 值分別為2、3、4、5、6、7，30 ℃培養(yǎng)36 h，在檢測波長為605 nm 處測OD 值和培養(yǎng)后含乳酸菌的MRS 肉湯培養(yǎng)液的pH值。

（4）篩選的乳酸菌生長曲線測定。把乳酸菌經(jīng)過活化后接入到MRS 肉湯內(nèi)，在30 ℃、60 r/min 搖晃震蕩箱中培養(yǎng)，每隔2 h，采用紫外分光光度計測波長605 nm 處OD 值，記數(shù)，以未添加菌株的MRS肉湯當(dāng)作空白對照。繪出篩選后菌株的生長曲線?？梢酝ㄟ^OD值進行乳酸菌活菌計數(shù)。

1.3 發(fā)酵米酒理化指標(biāo)檢測方法

1.3.1 取樣與檢測

因需檢測發(fā)酵過程的理化變化，連續(xù)檢測各個理化檢驗指標(biāo)，在發(fā)酵第1 天、第4 天、第7 天、第10天和第13 天的同一個時間段分別取樣檢測分析。根據(jù)各指標(biāo)數(shù)據(jù)隨時間變化趨勢進行討論分析。每個樣品測2～3次，取平均值。

1.3.2 酒精度測定

參考GB/T 15038—2006 的方法用酒精計法測蒸餾后的發(fā)酵液。

1.3.3 總酸的測定

參考GB/T 15038—2006 的方法用指示劑法測蒸餾后的酒的總酸。用0.1 mol/L 濃度的NaOH，用指示劑滴定法測過濾離心發(fā)酵醪液的總酸。

1.3.4 pH值測定

將樣品過濾離心，磁力攪拌器作輔助，pH 計直接法測發(fā)酵液。

1.3.5 乳酸的測定

利用液相色譜法檢測乳酸的含量，色譜條件參考《超高效液相色譜法對白酒乳酸含量的檢測》[29]。

1.3.6 乳酸乙酯的測定

利用氣相色譜法檢測乳酸乙酯的含量，色譜條件參考《米香型白酒中甲醇、乳酸乙酯和β-苯乙醇的氣相色譜法測定》[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)選菌株篩選

2.1.1 乳酸菌的分離

經(jīng)過檢測分離、純化富集從白酒醪液不同發(fā)酵時間不同罐中分離出有較明顯溶鈣圈的8 株乳酸菌，其中3 罐有4 株命名為TLQ-L1—4，5 罐有兩株為TLQ-L5 和6，14 罐有兩株為TLQ-L14 和TLQ-L15，2 株實驗室乳酸菌為TLQ-gtpp1和TLQgtpp2。

2.1.2 乳酸菌產(chǎn)酸能力的篩選

菌株產(chǎn)酸能力較強的有從白酒醪液不同發(fā)酵時間不同罐中分離出的有較明顯溶鈣圈的3 株乳酸菌，分別為3 罐的TLQ-L4，5 罐的TLQ-L5，14 罐的TLQ-L14，以及2 株實驗室乳酸菌TLQ-gtpp1 和TLQ-gtpp2。隨著總酸的升高，pH 值越低。其中TLQ-gtpp2 的酸度最高為63°T，pH2.99。分離乳酸菌總酸度與pH值見表1。

表1 分離乳酸菌的總酸度和pH值

2.1.3 乳酸菌的耐酒精試驗篩選

經(jīng)過乳酸菌產(chǎn)酸實驗篩選了5 株菌株，分別為TLQ-L3、TLQ-L5、TLQ-L14、TLQ-gtpp1 和TLQgtpp2，在此基礎(chǔ)上進行耐酒精能力篩選。培養(yǎng)48 h 后，在波長為605 nm 下測定其pH 和OD 值，見圖1和圖2。

圖1 培養(yǎng)48 h培養(yǎng)基中pH值變化

圖2 培養(yǎng)48 h培養(yǎng)基中OD值變化

在培養(yǎng)48 h 條件下菌株TLQ-gtpp1 和TLQgtpp2 生長情況受到抑制，pH 值偏高，最高為酒精度16 %vol 時TLQ-gtpp1 的pH4.6。菌株TLQ-L3、TLQ-L5 和TLQ-L14 生長情況較良好，受抑制狀況不明顯，最低pH 值為酒精度0 %vol 時的TLQ-L5，達到3.72。

在培養(yǎng)24 h 后分別培養(yǎng)48 h 條件下菌株TLQgtpp1 和TLQ-gtpp2 從酒精度0 %vol 到16 %vol 過程生長情況變化比較大，OD 值偏低，最高為TLQgtpp1OD 的0.892。菌株TLQ-L3、TLQ-L5 和TLQL14 從0 %vol 到16 %vol 過程生長趨勢變化不大，受抑制狀況不明顯，最高OD 值為TLQ-L5 達到2.775。

據(jù)5 株乳酸菌菌株耐酒精實驗，比較生長對數(shù)期內(nèi)OD 值上升，且pH 值下降較快的菌株，可知，菌株TLQ-L3、TLQ-L5 和TLQ-L14 的耐酒精能力較好，故選TLQ-L3、TLQ-L5 和TLQ-L14 作為發(fā)酵菌株進行米酒發(fā)酵。

2.1.4 不同pH 值對所篩選乳酸菌菌株生長和產(chǎn)酸能力的影響

TLQ-L14、TLQ-L3 和TLQ-L5 在初始pH 值小于5 的MRS 液態(tài)培養(yǎng)基中均能較好的生長，TLQL14 在pH 值小于3.4 的MRS 液態(tài)培養(yǎng)基中不能生長，相比之下菌株TLQ-L3 和TLQ-L5 的耐酸能力要強于TLQ-L14；當(dāng)pH 值高于6 時，3 株菌株生長開始部分受到抑制，繁殖量和產(chǎn)酸能力開始有所下降。不同pH 值對所篩選乳酸菌生長和產(chǎn)酸能力的影響見圖3。

圖3 不同初始pH值對所篩選菌株生長能力的影響

綜合以上實驗結(jié)果可知，TLQ-L14、TLQ-L3 和TLQ-L5 菌株的最適生長初始pH 為4.5～6，TLQL3 和TLQ-L5 菌株生長繁殖量和產(chǎn)酸能力較好，耐酸能力較強。

2.1.5 篩選乳酸菌的生長曲線測定

在4～8 h 后菌株TLQ-L3 和TLQ-L5 進入對數(shù)生長期，穩(wěn)定期是在18～20 h 后。培養(yǎng)4 h 后TLQL3 的活菌數(shù)為2.6×106CFU/mL，TLQ-L5 的活菌數(shù)為3.8×106CFU/mL，進入穩(wěn)定期后TLQ-L3 的最大活菌數(shù)可達到1.5×108CFU/mL，TLQ-L5 的最大活菌數(shù)可達到2.8×108CFU/mL。篩選過后的乳酸菌菌株的生長曲線測定見圖4。

圖4 篩選乳酸菌的生長曲線

由圖4 可知，菌株TLQ-L3 和TLQ-L5 生長需要的pH值范圍大致相同，相比之下TLQ-L5的耐酸性要強于菌株TLQ-L3，在米酒生產(chǎn)過程中，米酒的pH 值一般不會低于3，所以菌株TLQ-L3 在發(fā)酵過程中的生長不會受到太多限制，故可分別采用菌株TLQ-L3和TLQ-L5進行發(fā)酵實驗制作米酒。

2.2 優(yōu)選菌株進行接種發(fā)酵對應(yīng)理化檢測

2.2.1 優(yōu)選乳酸菌進行接種發(fā)酵

用菌株TLQ-L3 和TLQ-L5 進行發(fā)酵實驗制作米酒，發(fā)酵期每隔3 d 取樣進行檢測分析。大量實驗摸索發(fā)現(xiàn)在其他條件不變的情況下，5%乳酸菌添加量較為合適。根霉與酵母菌比例為10∶2，30 h糖化時間，根霉0 h 加入，乳酸菌8 h 加入，酵母22 h加入，30 h 后加水發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸和乳酸乙酯含量比較高。測定接入優(yōu)選菌株對原酒的發(fā)酵過程中乳酸、酒精產(chǎn)量、總酸、pH 值、乳酸乙酯產(chǎn)量的影響。

2.2.2 原酒中乳酸的含量變化

乳酸菌產(chǎn)生的乳酸是發(fā)酵過程中重要的代謝產(chǎn)物，乳酸在發(fā)酵中呈上升趨勢，前期上升比較快，中期緩慢過渡，后期又上升較快?？梢酝茰y出前期乳酸菌生長繁殖較快，產(chǎn)酸能力較強，產(chǎn)酸量較高；中期乳酸產(chǎn)生速度緩慢，發(fā)酵過程產(chǎn)生的乙醇發(fā)生轉(zhuǎn)化而被消耗；后期乳酸含量較多，是因為乳酸乙酯在后期開始水解成乳酸。相較于空白實驗，直接添加乳酸菌的發(fā)酵實驗的原酒中產(chǎn)生乳酸較高，相對于對照組，菌株TLQ-L3 提高了629.32 mg/L，菌株TLQ-L5 提高了717.22 mg/L。原酒中乳酸變化趨勢見圖5。

圖5 原酒中乳酸的含量變化

2.2.3 原酒中酒精的含量變化

在發(fā)酵前到后期，接入乳酸菌的樣品乙醇含量均低于空白，說明接入的菌株對于乙醇的產(chǎn)生起到一定的抑制作用，也可說明發(fā)酵過程中的酵母菌被接入的菌株抑制代謝活動。適量添加乳酸菌可對發(fā)酵微生物起促進作用，過量或者產(chǎn)酸能力極強的菌株會對發(fā)酵微生物起抑制作用。原酒中酒精的含量變化見圖6。

圖6 原酒中酒精的含量變化

2.2.4 原酒中總酸的含量變化

接入菌株TLQ-L3 和TLQ-L5 的樣品總酸均高于空白，空白樣品的總酸范圍在0～1 g/L，接入TLQ-L5 菌株的樣品總酸含量波動較大，呈先升再降再升趨勢，菌株TLQ-L3 和空白則處于緩慢上升或者保持同一水平，可見直接添加乳酸菌能提高樣品總酸含量。原酒中總酸的含量變化見圖7。

圖7 原酒中總酸的含量變化

2.2.5 原酒中pH值變化

由圖8可知，pH值均在降低，樣品為pH3～4之間，空白降低得比較緩慢，可見空白發(fā)酵液的pH 值變化不大，添入菌株TLQ-L3 和TLQ-L5 的樣品變化幅度比空白大，pH 值波動幅度最大的TLQ-L5 在1.0上下。

圖8 原酒中pH值變化

2.2.6 原酒中乳酸乙酯的含量變化

乳酸乙酯是由酸類和酯類發(fā)生簡單反應(yīng)而生成的，一定量乳酸乙酯的產(chǎn)生可使酒體感官更好。乳酸菌產(chǎn)生的乳酸乙酯在發(fā)酵中均呈上升狀態(tài)，前期上升比較慢，推測乳酸菌前期主要進行生長繁殖；中后期較快，乳酸菌開始大量產(chǎn)酸，與乙醇結(jié)合反應(yīng)生成乳酸乙酯，使乳酸乙酯含量增加。相較于空白發(fā)酵實驗，添加了乳酸菌的發(fā)酵實驗產(chǎn)生的乳酸乙酯較高。相對于對照組，菌株TLQ-L3 提高了489.7 mg/L，菌株TLQ-L5 提高了276.3 mg/L。原酒中乳酸乙酯的變化趨勢見圖9。

圖9 原酒中乳酸乙酯的含量變化

3 結(jié)論

實驗表明，不同乳酸菌的耐酒精度、耐酸和產(chǎn)酸能力不同，選取高耐酒精度的乳酸菌可以有效提高原酒中乳酸和乳酸乙酯的含量，說明優(yōu)選產(chǎn)酸能力突出的乳酸菌對提高原酒中乳酸和乳酸乙酯的含量有重要作用，具體添加時機、添加量對原酒品質(zhì)的影響有待細化，以明確乳酸菌對發(fā)酵出酒率、風(fēng)味的整體影響。為進一步研究接入優(yōu)選乳酸菌后米香型白酒發(fā)酵過程乳酸和乳酸乙酯含量變化差異提供理論基礎(chǔ)，使優(yōu)選乳酸菌對白酒發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的影響得到擴充和廣泛的應(yīng)用。