石碩，陳銘伍

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，廣西南寧 530021

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一[1-2]，全世界每年報(bào)道約180萬(wàn)例肺癌新發(fā)病例，占所有新發(fā)癌癥病例的12.9%[3]。三分之一的肺癌新發(fā)和致命病例發(fā)生在中國(guó)，對(duì)人類健康構(gòu)成巨大威脅[4]。大多數(shù)肺癌病例是惡性上皮腫瘤，包括非小細(xì)胞肺癌（NSCLC，85%）和小細(xì)胞肺癌（15%）[5]。NSCLC臨床癥狀具有隱匿性，大多數(shù)患者在確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，很大一部分患者不能耐受以手術(shù)為主的傳統(tǒng)治療[6-7]。此外，手術(shù)成功的患者經(jīng)常出現(xiàn)腫瘤耐藥性，導(dǎo)致放化療失敗，腫瘤復(fù)發(fā)甚至死亡[8]。目前免疫治療和以抗血管形成為主的靶向治療雖已廣泛應(yīng)用，但多數(shù)患者使用靶向藥物治療后9～13個(gè)月會(huì)產(chǎn)生耐藥[9]。因此探討新的廣譜的分子靶向藥物已成為當(dāng)代醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。有研究表明，麻醉和手術(shù)期間的可改變條件可能會(huì)影響癌癥復(fù)發(fā)，其中一個(gè)因素是阿片類藥物的用量，接受大量阿片類藥物全身麻醉的患者比接受局部麻醉或阿片類藥物量較低的患者表現(xiàn)出更多的癌癥進(jìn)展或復(fù)發(fā)[10]。阿片生長(zhǎng)因子受體（OGFR）是一種廣泛存在于多種細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和分化[11]，具有促血管生成的作用[10]。GOLDENBERG等[12]研究證實(shí)，OGFR可促進(jìn)肝癌、胃腸道腫瘤等多種癌細(xì)胞增殖，同時(shí)發(fā)現(xiàn)多種疾病存在OGFR表達(dá)差異。筆者前期通過基因芯片TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn)，OGFR基因與NSCLC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，本研究探討了在體外沉默OGFR基因?qū)SCLC常用細(xì)胞系——人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響，期待為NSCLC的靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 A549細(xì)胞株購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)?？俁NA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和cDNA擴(kuò)增試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司，小干擾RNA由湖州河馬生物科技有限公司合成，蛋白標(biāo)記（Marker）、兔多抗GAPDH、兔多抗OGFR一抗以及抗兔二抗均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)自美國(guó)MCE公司，胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗、胰蛋白酶EDTA（0.25%）及酚紅均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 在37℃、5% CO2環(huán)境條件下，將A549細(xì)胞株培養(yǎng)在含10%滅活胎牛血清、100 U/L青霉素、100 U/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中。顯微鏡下觀察A549細(xì)胞株生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，用胰酶進(jìn)行消化，對(duì)A549細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)傳代，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。于轉(zhuǎn)染前24 h，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞株接種于6孔板中，細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染si-NC陰性對(duì)照、OGFR特異性的小干擾RNA，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h換液，18～48 h后檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，發(fā)出明亮的綠色熒光者為陽(yáng)性細(xì)胞。轉(zhuǎn)染效率（%）=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞中OGFR mRNA檢測(cè) 采用RT-qPCR。收集轉(zhuǎn)染48 h后兩組細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA并擴(kuò)增進(jìn)行qPCR檢測(cè)。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃30 s，1個(gè)循環(huán)；變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。OGFR引物正義序列：5'-UAGAACUCAGUUGGCGTT-3'，反 義 序 列 ：5'-GCCAACAGUUUUUCUATT-3'；內(nèi)參GAPDH引物正義序列：5'-TCAAGAAGACGGTGAAGCAGG-3'，反義序列：5'-TCAGAAGGTAGGGGACAGGT-3'。 用 2-ΔΔCt法 分 析各組細(xì)胞中OGFR mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞中OGFR蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。收集轉(zhuǎn)染48 h后兩組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，抽提蛋白后用BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，后使蛋白變性。取30 μg蛋白上樣行凝膠電泳，電泳結(jié)束后使用濕轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，封閉2 h（5%的脫脂奶粉），在4℃下分別孵兔源一抗OGFR，GADPH 4℃孵育過夜（稀釋倍數(shù)1∶2 000）。24 h后，取出細(xì)胞室溫下復(fù)溫1.5 h，用等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗膜3次，加入通用型羊抗兔二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育1 h，再用TBST洗膜3次。用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影，ImageJ軟件測(cè)灰度 值，隨后記錄統(tǒng)計(jì)分析組織中蛋白的測(cè)定。

1.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8實(shí)驗(yàn)。取轉(zhuǎn)染后0、24、48、72 h的兩組細(xì)胞，以5×103/孔的密度轉(zhuǎn)移到平板上。各孔均加入CCK-8染色劑，添加染色劑后，將細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)6 h。隨后，收集細(xì)胞懸浮液，采用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定光密度（OD）值。

1.6 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。取轉(zhuǎn)染48 h后兩組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1～5×105個(gè)/孔，向每組 Transwell小室上室中加入 100 μL相應(yīng)細(xì)胞懸液，下室中加入800 μL含有青霉素鏈霉素的培養(yǎng)基。37°培養(yǎng)箱溫育20～24 h，用棉簽去除小室上層細(xì)胞，用結(jié)晶紫溶液室溫下染色后，室溫中放置20 min，以磷酸緩沖鹽溶液（PBS）浸洗。在顯微鏡下觀察拍照，每個(gè)樣本隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均值。

1.7 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。取轉(zhuǎn)染48 h后兩組細(xì)胞，接種于6孔板，Marker筆在培養(yǎng)板后均勻劃間距為0.5 cm的橫線，每孔中鋪1×105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞融合度≥80%時(shí)用無菌移液槍槍頭在單層細(xì)胞沿底部劃出“一”字劃痕，PBS沖洗3次，培養(yǎng)24 h后于固定位置用顯微鏡拍照，并計(jì)算劃痕愈合率。細(xì)胞遷移率=（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.8 細(xì)胞克隆形成能力檢測(cè) 采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)。收集轉(zhuǎn)染48 h后兩組細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，分別以300個(gè)/孔接種到6孔板中。將6孔板置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)14 d，直至細(xì)胞克隆形成。用4%多聚甲醛固定15 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，洗去染液，風(fēng)干后在倒置顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野觀察，判斷細(xì)胞克隆形成情況并計(jì)數(shù)大于50個(gè)克隆數(shù)的集落，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件及Graph Pad軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Student'st檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞中OGFR mRNA表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞中OGFR mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.16±0.03、1.00±0.03，兩組比較P＜0.05。

2.2 兩組細(xì)胞中OGFR蛋白表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞中OGFR蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.18±0.05、0.53±0.03，兩組比較P＜0.05。

2.3 兩組細(xì)胞增殖能力比較 實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)0、24、48、72 h細(xì) 胞 增殖 OD 值分別為 0.139±0.015、0.347±0.005、0.372±0.004、0.425±0.003，對(duì)照組分別為 0.134±0.018、0.501±0.019、0.676±0.023、0.714±0.022，兩組24、48、72 h細(xì)胞增殖OD值比較P均＜0.05。

2.4 兩組細(xì)胞侵襲能力比較 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組遷移穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（18±2）、（30±2）個(gè)，兩組比較P＜0.05。

2.5 兩組細(xì)胞遷移能力比較 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞遷移率分別為（30.13±6.33）%、（61.86±5.32）%，兩組比較P＜0.05。

2.6 兩組細(xì)胞克隆形成能力比較 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組克隆形成細(xì)胞集落數(shù)分別為（115±1）、（211±6）個(gè)，兩組比較P＜0.05。

3 討論

OGFR是一種含有677個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，由20號(hào)染色體處的OGFR基因編碼，是一種廣泛存在于多種細(xì)胞中的受體。OGFR可與阿片生長(zhǎng)因子（OGF）特異性結(jié)合，其調(diào)控軸不僅具有神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫調(diào)節(jié)活性，而且也具有直接的抗腫瘤活性[13]。近年來，在多種類型的癌癥中均發(fā)現(xiàn)OGFROGF對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為有調(diào)控作用。一項(xiàng)研究表明，OGF是細(xì)胞通過自分泌產(chǎn)生的阿片類肽，可顯著降低使用放射性標(biāo)記胸腺嘧啶核苷中的DNA合成，從而調(diào)控有絲分裂和細(xì)胞的增殖，OGFR與OGF結(jié)合后可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性抑制性激酶，作用于細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p16和p21的上調(diào)，導(dǎo)致Rb磷酸化抑制和在細(xì)胞周期S期停滯，從而對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響[14-15]。CHENG等[16]研究發(fā)現(xiàn)，OGF通過網(wǎng)格蛋白小干擾RNA受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞膜，隨后通過細(xì)胞質(zhì)中的OGFR進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到核內(nèi)發(fā)揮作用，整個(gè)OGF進(jìn)入細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)過程依賴于核定位信號(hào)并通過karyopherinβ1受體介導(dǎo)的核漿轉(zhuǎn)運(yùn)。ZHENG等[17]研究發(fā)現(xiàn)OGFR-OGF調(diào)控軸是介導(dǎo)上皮性卵巢癌中LINC00673致癌作用的潛在下游靶點(diǎn)，促進(jìn)腫瘤的遷移、侵襲和細(xì)胞生長(zhǎng)。還有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染OGFR cDNA后的胰腺細(xì)胞，轉(zhuǎn)染組腫瘤發(fā)生率增加了45%，腫瘤體積增加了60%，且在隨后的研究中證明，OGFR-OGF調(diào)控軸在三陰性乳腺癌MDA-MD-231、BT-20等細(xì)胞株的增殖中起決定性作用[18-19]。AVELLA等[20]采用高通量測(cè)序分析以篩選肝癌細(xì)胞中HOTAIR的下游效應(yīng)因子，發(fā)現(xiàn)OGFR在肝癌組織中顯著表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)HOTAIR可與OGFR的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，提高其轉(zhuǎn)錄水平，調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖過程。且有研究證實(shí)，OGF、OGFR在甲狀腺乳頭狀癌組織及正常組織中發(fā)揮著細(xì)胞增殖調(diào)控作用[21-22]。

為明確OGFR在NSCLC中的生物學(xué)功能，本研究采用小干擾RNA技術(shù)沉默實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞株中的OGFR基因，實(shí)驗(yàn)組OGFR mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組降低，表明轉(zhuǎn)染成功。本研究采用CCK-8實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組24、48、72 h細(xì)胞增殖OD值及克隆形成細(xì)胞集落數(shù)降低，表明抑制OGFR表達(dá)可抑制A549細(xì)胞增殖。同時(shí)，本研究細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移、侵襲能力較對(duì)照組降低，表明OGFR對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲起促進(jìn)作用。本研究結(jié)果與既往的多數(shù)研究結(jié)果一致。MCLAUGHLIN等[22]將人類頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（SCCHN）移植到裸鼠體內(nèi)，然后使用受體結(jié)合分析和定量免疫組織化學(xué)檢測(cè)不同大小腫瘤中與SCCHN相關(guān)的OGFR mRNA和蛋白表達(dá)差異。結(jié)果顯示，OGFR的表達(dá)隨著腫瘤的增大而下降，說明在不同體積的腫瘤組織中存在著一定的表達(dá)調(diào)控差異，這也將是筆者下一步的研究重點(diǎn)。另外，以O(shè)GFR為代表的阿片類藥物會(huì)影響免疫細(xì)胞和炎癥反應(yīng)，其在體外、體內(nèi)模型中發(fā)揮的作用可能不同，因此OGFR的機(jī)制應(yīng)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步評(píng)估。

綜上可見，沉默OGFR后A549細(xì)胞株增殖、遷移、侵襲能力降低，這為后續(xù)NSCLC的治療提供了基礎(chǔ)依據(jù)。