張 楷 徐 普

骨缺損是較為常見的一種疾病，每年至少有數(shù)百萬相關(guān)病例需要進(jìn)行骨修復(fù)。而珍珠粉具有良好的生物相容性，價(jià)格低廉、易獲取，因而有進(jìn)一步深入相關(guān)研究的必要[1,2]?，F(xiàn)在學(xué)者常將珍珠粉制備成復(fù)合支架，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以研究其骨修復(fù)能力，故本文選取常用相關(guān)復(fù)合支架以探討其性能及發(fā)展前景。

1.珍珠粉在骨修復(fù)的作用

珍珠粉主要產(chǎn)于珍珠貝類和珠母貝類軟體動(dòng)物體內(nèi)，由珍珠研磨而成。很早以前即開始應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)，作為中藥歷史悠久[3,4]，有明目[5]、護(hù)肝[6]、緩解心律失常[7]、抗皮膚衰老[8]等功效，同時(shí)，也可消炎抑菌[9]、促進(jìn)創(chuàng)口愈合[10]。其理化和生物學(xué)特性接近骨[11]，自Lo?pez 發(fā)現(xiàn)其成骨潛能以來受到國內(nèi)學(xué)者廣泛的關(guān)注[12]。

其組成、結(jié)構(gòu)類似骨,由95%的無機(jī)物和5%的蛋白質(zhì)、多糖、幾丁質(zhì)等有機(jī)物組成[1]。無機(jī)部分多為碳酸鈣，可作為成骨的原料。相比羥基磷灰石，珍珠粉的有機(jī)基質(zhì)可作為粘接劑分布于碳酸鈣板層間，二者形成的磚墻結(jié)構(gòu)使珍珠具有良好的力學(xué)性能，同時(shí)也增強(qiáng)了骨誘導(dǎo)和蛋白吸附能力[1,13]。雖然只占5%，但有機(jī)基質(zhì)才是珍珠粉對(duì)于生物活性起主要作用的成分。一方面，它可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，并產(chǎn)生新的界面結(jié)構(gòu)，影響表面穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)組織特性，在晶體成核、微觀結(jié)構(gòu)中起著相當(dāng)重要的作用[14]。另一方面，有機(jī)基質(zhì)本身也有多種促進(jìn)成骨效果的成分。珍珠蛋白N16能抑制核因子κB受體活化因子配體，減少破骨細(xì)胞的骨吸收，而骨形態(tài)蛋白2也使得其相比羥基磷灰石有更好的骨再生活性[15,16]。

珍珠粉可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成和組織再生，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均顯示了它有良好的生物相容性以及優(yōu)于羥基磷灰石的成骨作用及骨誘導(dǎo)性[17]。陳靈將其植入兔股骨遠(yuǎn)端缺損處，3個(gè)月后可見骨缺損邊界模糊，新生組織幾乎覆蓋完全。而CBCT顯示材料基本降解完全，缺損邊緣新生成組織的灰度值與周圍正常骨組織相近。同時(shí)組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)有大量的軟骨細(xì)胞及軟骨基質(zhì)增生，有較明顯軟骨化現(xiàn)象[18]。而毛秋華實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將其浸提液加入肘部靜脈血后溶血率為僅為1.01%，注入兔背部皮內(nèi)72 h后皮膚無紅斑和水腫表現(xiàn)[19]。鄭斌將其與小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性為Ⅰ級(jí)，細(xì)胞形態(tài)呈梭形、無明顯改變，未見大面積細(xì)胞脫落，符合我國生物材料應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)，與同濃度納米羥基磷灰石相比，具有更好的細(xì)胞相容性，是良好的骨修復(fù)材料[20]。而將其小鼠成骨細(xì)胞共培養(yǎng)后，廖軍發(fā)現(xiàn)，在各時(shí)間點(diǎn)堿性磷酸酶活性高于加入納米羥基磷灰石的陽性實(shí)驗(yàn)組，且細(xì)胞匯合呈集落生長,細(xì)胞間紅褐色，茜素紅結(jié)節(jié)面積可達(dá)45.79% ，亦大于納米羥基磷灰石組[21]。

然而，該材料孔隙率較低，機(jī)械強(qiáng)度不足以有效支撐，且不易成形，在體內(nèi)易流失[14,22]，有機(jī)基質(zhì)將無機(jī)質(zhì)連接成同一晶型方向的結(jié)構(gòu)也阻礙了其降解，故臨床上需要將珍珠粉作為功能性填料，制成復(fù)合支架，進(jìn)行骨組織工程以改善其性能，使之易加工、便于操作，作用持久[1,23]。

2.珍珠粉復(fù)合支架在骨修復(fù)中的作用

骨組織工程是目前修復(fù)骨缺損最有前景的方法之一，即將自體細(xì)胞種植于支架內(nèi)，培養(yǎng)一段時(shí)間后移植體內(nèi)，以修復(fù)骨組織[24]。而構(gòu)建支架對(duì)組織工程技術(shù)最為關(guān)鍵，即采用支架為種子細(xì)胞、生長因子提供空間，自身降解的同時(shí)引導(dǎo)新骨的長入，達(dá)到骨修復(fù)的目的。

能與珍珠粉共同制備成復(fù)合支架的材料，多為可降解聚合物，如聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸、聚己內(nèi)酯、多羥基苯甲酸酯、透明質(zhì)酸、殼聚糖等?？筛鶕?jù)需要人為調(diào)節(jié)理化及生物學(xué)性能，實(shí)現(xiàn)高孔隙率和表面積。其降解速度可控、產(chǎn)物可吸收，故而能避免二次手術(shù)。同時(shí)易成型，可在無機(jī)非金屬材料之間可充當(dāng)粘接劑[25]。但是，純聚合物單一組分的生物活性較弱，且它們多存在機(jī)械性能不足、降解快且產(chǎn)物呈酸性而引起不良反應(yīng)等缺點(diǎn)，骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)能力尚不足[26]。而將珍珠粉均勻分散于支架中，可與可降解聚合物取長補(bǔ)短，使其獲得理想的孔隙結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度，更有利于細(xì)胞的生長及礦化，從而提高成骨效果[27]。因此，以聚合物為基質(zhì)、無機(jī)非金屬材料為功能填料的復(fù)合支架得到了廣泛發(fā)展。

目前研究最多的珍珠粉復(fù)合支架為珍珠粉/殼聚糖-透明質(zhì)酸復(fù)合支架和珍珠粉/聚乳酸復(fù)合支架[1,28]。

2.1 珍珠粉/聚乳酸復(fù)合支架及珍珠粉/聚乳酸-羥基乙酸復(fù)合支架聚乳酸由L-乳酸、D-乳酸聚合而成，易于加工制成有各種孔結(jié)構(gòu)和孔隙率的三維多孔支架，且降解產(chǎn)物易為人體所吸收，在各種珍珠粉復(fù)合支架中最廣為學(xué)者所研究[28]。

珍珠粉均勻分布于支架，可改善支架親水性和成骨效果。朱磊制備出圓柱體的左旋聚乳酸/珍珠層粉復(fù)合支架，電鏡下見階梯狀多孔結(jié)構(gòu)，孔壁和邊緣上珍珠層粉均勻分布，未見明顯團(tuán)聚，部分珍珠層粉粘附在左旋聚乳酸表面，使孔壁粗糙。將其植入兔1.5 cm橈骨骨缺損處，12周時(shí)骨折斷端有大量骨痂連接，骨髓腔基本再通達(dá)到骨性愈合[29]。而珍珠粉的結(jié)構(gòu)也影響著性能，Qianli Huang將文石結(jié)構(gòu)的聚乳酸/文石復(fù)合支架與人成骨肉瘤細(xì)胞SaOS-2共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)3天后細(xì)胞接近融合，邊界模糊，在第4 天和第7 天，對(duì)SAOS-2細(xì)胞的堿性磷酸酶活性有促進(jìn)作用，14天后，觀察到左旋聚乳酸/文石支架表面形成骨樣結(jié)節(jié)，探測到Ca、P元素，骨鈣蛋白和骨橋蛋白的表達(dá)水平顯著升高。證明要聚乳酸/文石復(fù)合支架對(duì)細(xì)胞的促進(jìn)增殖作用與成骨作用要優(yōu)于聚乳酸/球文石復(fù)合支架[23]。乳酸可造成酸性環(huán)境，但相關(guān)實(shí)驗(yàn)無明顯炎癥反應(yīng)，劉淵聲認(rèn)為，這是因?yàn)檎渲榉蹓A性產(chǎn)物提供了相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境，中和了酸性，也延緩了支架降解，故無明顯炎癥反應(yīng)[30]，也有學(xué)者認(rèn)為這是由于其酸性弱，對(duì)高孔隙率支架影響過小[23]。除此以外，也有人將抗生素加入了支架，制成了同時(shí)具備抗感染和成骨能力的利福平/莫西沙星-聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球，將其植入兔長度、直徑6 mm的橈骨感染性骨缺損模型，8周后Micro?-CT見無感染跡象，新生骨在骨缺損處形成持續(xù)愈合的骨組織，表明其在治療感染性骨缺損方面具有顯著的潛力[28]。

然而聚乳酸自身機(jī)械強(qiáng)度不足，且有大量酯鍵，因此親水性、生物相容性不足，故而骨誘導(dǎo)性不足。除此以外，其降解緩慢，難以控制降解周期[30]。而羥基乙酸擁有較好的生物降解性、生物相容性，可與聚乳酸共聚形成聚乳酸-羥基乙酸[31]。因此，胡濤以低溫沉積法1:1還原制備了珍珠粉/聚乳酸-羥基乙酸下頜骨骨塊[32]?？赏ㄟ^聚乳酸-羥基乙酸與珍珠粉的比例控制其降解速率，通常羥基乙酸含量越高，降解越快，但比例為1：1時(shí)，降解最快[30]。珍珠粉的引入能改善支架的壓縮強(qiáng)度等綜合性能，尤以聚乳酸-羥基乙酸：珍珠粉比例為5：2時(shí)綜合評(píng)價(jià)最好：壓縮彈性模量為36.097MPa；接觸角為77.98°；14 天降解了40.23%。

2.2 珍珠粉/聚己內(nèi)酯復(fù)合支架聚己內(nèi)脂由己內(nèi)酯單體聚合而來，具有良好的生物相容性，在37°C生理溶液中比較穩(wěn)定，與珍珠粉幾乎無化學(xué)反應(yīng)，因此具有長期的機(jī)械強(qiáng)度[22]。雖力學(xué)性能不足，且本身疏水，不利于細(xì)胞粘附生長，但可溶于多種有機(jī)溶劑，通過與其他材料共混或表面改性來改善自身不足[33]。

三維打印法是較新穎的支架制備技術(shù)，能精細(xì)控制支架的孔徑、孔隙率和強(qiáng)度，在口腔領(lǐng)域應(yīng)用愈發(fā)增多[34]。杜曉宇用三維打印法制備出的具有約350 mm大孔，強(qiáng)度約8 Mpa的珍珠粉-硫酸鈣/聚己內(nèi)脂復(fù)合支架，大體滿足松質(zhì)骨抗壓強(qiáng)度的要求，同時(shí)也能調(diào)節(jié)支架降解并穩(wěn)定環(huán)境PH變化。相比其他組，隨著珍珠粉含量增加，支架力學(xué)強(qiáng)度得到了更好的改善，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞增長率及細(xì)胞在支架表面的增長率也顯著增加。這表明珍珠粉含量可調(diào)控復(fù)合支架的理化和生物學(xué)性能[35]。而Xu Zhang等通過三維打印制備了不同濃度珍珠粉的復(fù)合支架，使孔徑得到了嚴(yán)格控制，規(guī)則均勻的500 μm方形大孔結(jié)構(gòu)與58.4%的孔隙率利于細(xì)胞血管長入、細(xì)胞增殖分化，也保證了支架2.47±0.40 MPa到7.58±0.15 MPa的近似于骨小梁的抗壓強(qiáng)度[22]。

2.3 珍珠粉/聚3-羥基丁酸-3-羥基戊酸共聚物(po?ly lactic-co?-glyco?lic acid，PHBV)復(fù)合支架PHBV是微生物合成的高分子材料。因其降解性、生物相容性和優(yōu)異的材料改性而被廣泛研究。降解物不含有害物質(zhì)，且有很好的誘導(dǎo)骨細(xì)胞生長的作用。但是，該材料也有機(jī)械性能不足、熱穩(wěn)定性低、強(qiáng)疏水性等不足，無法單獨(dú)使用[36]。

白敬敬發(fā)現(xiàn)不含珍珠粉的試樣在1-3天羥基磷灰石增長率小，長量約為0.23 mg/cm2，而后增長率增加，但小于加珍珠粉的復(fù)合薄膜。這是因?yàn)榍罢叩V化初期會(huì)先形成晶核，而含珍珠粉的PHBV薄膜會(huì)釋放鈣離子，使周圍局部濃度升高，羥基磷灰石更快成核及沉積，在相同條件下生成羥基磷灰石更多。同時(shí)，為了緩釋藥物、治療腫瘤，白敬敬又采用電紡法制備了載阿霉素(do?xo?rubicin,DOX)的DOX/PHBV/珍珠粉靜電紡纖維支架，發(fā)現(xiàn)珍珠粉含量高則緩釋藥物快，其對(duì)于腫瘤的治療有一定的前景[37]。

2.4 珍珠粉/殼聚糖-透明質(zhì)酸復(fù)合支架殼聚糖由氨基葡萄糖和N-二氨基葡萄糖組成，生物相容性、降解性、粘附力、可塑性較優(yōu)，也有良好的擴(kuò)散特性[38]。雖然有抑菌、促進(jìn)愈合等優(yōu)點(diǎn)，但也有機(jī)械性能較弱，β-（1,4）鍵導(dǎo)致的降解過快等不足。然而，其陽離子性質(zhì)及氨基反應(yīng)活性，使其易修飾成各種物理或化學(xué)衍生物以改善其性質(zhì)，同時(shí)可調(diào)節(jié)體內(nèi)PH值，改善部分材料降解時(shí)產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)[39]。

透明質(zhì)酸由存在于人體的大多數(shù)結(jié)締組織中，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。具有抗炎、抑菌、抗腫瘤的能力[40]，能調(diào)節(jié)基質(zhì)中的水分，可被用于構(gòu)建具有結(jié)構(gòu)的支架[24]。但機(jī)械性能較低，性能不穩(wěn)定，無法單獨(dú)用做骨替代材料。然而，可與殼聚糖發(fā)生反應(yīng)生成穩(wěn)定聚合物，彌補(bǔ)殼聚糖脆性大，黏彈性弱等缺點(diǎn)[41]。

為模擬骨基質(zhì)，王秋子[1]等采用低溫干燥法制成了納米珍珠粉/殼聚糖-透明質(zhì)酸復(fù)合支架。該支架的孔隙率在89%～93%之間，隨著珍珠粉的增加而略有降低。同時(shí)，復(fù)合支架的親水性和力學(xué)性能增加，但孔形態(tài)略微受到干擾，其中25%的支架表現(xiàn)尤為明顯。珍珠粉含量較高的支架有利于小鼠顱頂前成骨細(xì)胞增殖和分化，其中珍珠粉含量為10 wt%和25 wt%的支架效果最好，第14天，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)可見添加10%和25%納米珍珠粉的支架骨鈣蛋白、成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.05)。并且蛋白印跡條帶清晰，形狀規(guī)則，與對(duì)照組相比，添加10%和25%納米珍珠粉的復(fù)合支架對(duì)骨鈣蛋白、骨橋蛋白、I型膠原蛋白和成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子的蛋白的合成增加。而骨鈣蛋白、骨橋蛋白、I型膠原蛋白和成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)上調(diào)可能是其促進(jìn)分化的機(jī)制之一[42,43]。

2.5 其他復(fù)合支架除組成上述支架以外，珍珠粉還可與聚氨基酸[44]等可降解聚合物以及硫酸鈣[45]等骨水泥復(fù)合成支架，骨形態(tài)蛋白2[46]等生長因子作為第三要素亦可載入其中，但物理刺激等第四元素尚少見于相關(guān)支架。

3.珍珠粉及其復(fù)合支架在骨修復(fù)應(yīng)用中的可能機(jī)制

一方面，珍珠粉可以通過經(jīng)絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞自噬，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[47]。另一方面，它能抑制破骨細(xì)胞組織蛋白酶K進(jìn)而減少骨吸收[48,49]。除此以外，珍珠粉還可通過c-Jun氨基末端激酶信號(hào)通路調(diào)控Fo?s相關(guān)抗原-1表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化[50]。

珍珠粉的各組分也有促進(jìn)骨修復(fù)的作用。其無機(jī)部分多為碳酸鈣，多孔性結(jié)構(gòu)可令生物組織可長入其中并與其表面鍵合，同時(shí)產(chǎn)生成骨作用，因此具有骨傳導(dǎo)性[38]。同時(shí)，其降解時(shí)可改變鈣離子濃度，隨之產(chǎn)生的堿性微環(huán)境也可刺激成骨細(xì)胞活性[51]。它也具有良好的生物相容性，能促進(jìn)成骨細(xì)胞的粘附生長，誘導(dǎo)骨形成，因此具有骨誘導(dǎo)性[22]。雖然有機(jī)基質(zhì)只占5%，但該部分才是珍珠粉對(duì)于生物活性起主要作用的成分。一方面，它可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，并產(chǎn)生新的界面結(jié)構(gòu)，有機(jī)/無機(jī)界面的電荷可影響表面穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)組織特性，在晶體成核、微觀結(jié)構(gòu)中起著相當(dāng)重要的作用[14]。另一方面，有機(jī)基質(zhì)能清除細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基及抑制脂質(zhì)體氧化，維持活性，阻止成骨細(xì)胞凋亡[15]。而珍珠的有機(jī)基質(zhì)本身也有多種促進(jìn)成骨效果的成分。珍珠蛋白N16能抑制核因子κB受體活化因子配體，減少破骨細(xì)胞的骨吸收，而骨形態(tài)蛋白2也使得其相比羥基磷灰石有更好的骨再生活性[15,16]。

將珍珠粉均勻分散于支架中，可與可降解聚合物取長補(bǔ)短，使其獲得理想的孔隙結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度，提高親水性。更有利于細(xì)胞的生長及礦化，從而提高成骨效果[27]。同時(shí)，降解產(chǎn)物產(chǎn)生的堿性微環(huán)境可穩(wěn)定環(huán)境PH，減輕部分可降解聚合物導(dǎo)致的炎癥[30]。

4.總結(jié)和展望

因相關(guān)蛋白與磚墻結(jié)構(gòu)，珍珠粉具有優(yōu)于羥基磷灰石的成骨性能和生物相容性。制成復(fù)合支架時(shí)，也能均勻分散于支架，從而提高力學(xué)性能和親水性。同時(shí)，降解產(chǎn)物產(chǎn)生的堿性微環(huán)境可穩(wěn)定環(huán)境PH，減輕部分可降解聚合物導(dǎo)致的炎癥。

目前研究較多的為珍珠粉/聚乳酸復(fù)合支架以及珍珠粉/殼聚糖-透明質(zhì)酸復(fù)合支架。在搭載藥物方面，不少支架已開始探尋抗感染、抗腫瘤的方法，以及在制備方法上使用三維打印令孔隙形狀更適合細(xì)胞的長入和力學(xué)性能的改善。在眾多研究中，珍珠粉復(fù)合支架均展現(xiàn)了其潛力，但目前僅是實(shí)驗(yàn)室研究和簡單的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，與其它材料的比較也需進(jìn)一步探索。與此同時(shí)，種子細(xì)胞的研究，金屬離子摻雜的研究，磁等物理刺激的研究等，尚少見于珍珠粉復(fù)合支架。同時(shí)，細(xì)胞毒性、成血管、免疫排斥等性質(zhì)以及何種復(fù)合支架更適合人體骨修復(fù)仍需進(jìn)一步研究。