葛侖華

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384）

近年來，由于水產(chǎn)養(yǎng)殖的爆發(fā)式和集約式增長導(dǎo)致魚類對各種疾病的易感性增加，而腸道作為魚類重要的消化和免疫器官在抵御病原體入侵方面起著重要作用。魚類的腸道粘膜免疫系統(tǒng)由一系列獨(dú)特的先天性和獲得性免疫細(xì)胞及分子組成，它們協(xié)同行動(dòng)以保護(hù)宿主免受病原體的侵襲。此外粘液起到物理屏障，抵御病原體入侵的作用。本文總結(jié)了魚類腸道免疫系統(tǒng)的研究進(jìn)展，以期為更深入研究奠定理論基礎(chǔ)，對魚類養(yǎng)殖以及疾病預(yù)防有重要意義。

1 魚腸道屏障功能

腸道是機(jī)體面對外部環(huán)境最大的表面，它與共生微生物區(qū)系及飲食中的抗原直接接觸。為了確保體內(nèi)平衡，腸道充當(dāng)著一個(gè)可選擇性滲透的屏障，吸收營養(yǎng)和水分以獲取能量，并阻止抗原和細(xì)菌進(jìn)入內(nèi)部環(huán)境，腸道的這一關(guān)鍵特性稱為腸道屏障功能。

在魚類中，腸道不僅承擔(dān)著消化食物和營養(yǎng)吸收的多種生理功能，同時(shí)它也是一個(gè)重要的免疫器官，是魚體與外部環(huán)境之間的屏障。腸道屏障主要由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障和生物屏障組成，這些屏障在抵御病原體入侵、防止微生物和細(xì)菌毒素進(jìn)入到體循環(huán)中起著核心作用。因此，腸道屏障在維持腸道和全身免疫平衡方面起著極其重要的作用。它由一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的細(xì)胞、黏液和腸道微生物區(qū)系組成。復(fù)雜的蛋白質(zhì)系統(tǒng)會(huì)對營養(yǎng)物質(zhì)和必要的元素進(jìn)行選擇性滲透。而腸道屏障緊密性的紊亂會(huì)導(dǎo)致毒素和其他有害抗原滲透到系統(tǒng)中，使得機(jī)體出現(xiàn)各種消化道功能障礙、系統(tǒng)性感染和自身免疫性疾病發(fā)生。以往研究表明，病原體和宿主腸道之間復(fù)雜的相互作用會(huì)導(dǎo)致緊密連接屏障的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，從而誘導(dǎo)離子運(yùn)輸和炎癥反應(yīng)發(fā)生。因此，腸道被認(rèn)為是魚類病原體感染的主要途徑之一[1]。

腸上皮是腸道屏障功能中的關(guān)鍵角色，它主要由吸收性腸上皮細(xì)胞組成，此外還包括杯狀細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞和簇狀細(xì)胞等。上皮單層充當(dāng)選擇性屏障，調(diào)節(jié)物質(zhì)在管腔和粘膜環(huán)境之間的雙向通道。除了構(gòu)成純粹的物理屏障外，上皮細(xì)胞也通過表達(dá)與先天免疫反應(yīng)有關(guān)的受體，分泌趨化因子和細(xì)胞因子，并作為一種非專業(yè)抗原呈遞細(xì)胞類型在免疫反應(yīng)中發(fā)揮積極作用。腸道上皮細(xì)胞之間連接的復(fù)合物被稱為上皮連接復(fù)合物，它是由緊密連接（Tight Junction，TJ）、間隙連接（Gap Junction，GJ）、粘合連接 （Adherens Junction，AJ） 和橋粒（Desmosomes，DE）組成[2]。物質(zhì)跨上皮運(yùn)輸通過跨細(xì)胞或細(xì)胞旁途徑進(jìn)行。前者涉及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的大分子攝取、內(nèi)吞或胞吐作用，而細(xì)胞旁途徑涉及離子、水和分子穿過的細(xì)胞間隙。組成腸道屏障功能的其他因素還可以避免微生物群直接接觸上皮細(xì)胞表面，主要包括：（1）粘液層、免疫球蛋白和抗菌肽的分泌；（2）運(yùn)動(dòng)性，防止微生物過度管腔生長；（3）腸道微生物群的組成，共生細(xì)菌除了有助于消化過程外，還參與免疫反應(yīng)的發(fā)展和控制，減少病原體定植，并影響上皮細(xì)胞動(dòng)力學(xué)。（4）粘膜免疫系統(tǒng)，這是全身免疫細(xì)胞比例最高的系統(tǒng)，對先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的發(fā)育和調(diào)節(jié)至關(guān)重要。

2 魚粘膜免疫系統(tǒng)

脊椎動(dòng)物的粘膜免疫系統(tǒng)由一系列獨(dú)特的先天性和獲得性免疫細(xì)胞和分子組成，它們協(xié)同作用以保護(hù)宿主免受病原體侵襲。同時(shí)，粘膜免疫系統(tǒng)已經(jīng)進(jìn)化到允許具有復(fù)雜多樣化的微生物群落定居在粘膜表面。例如通過發(fā)展具有高度特異性和記憶能力的淋巴細(xì)胞來記憶共生體和病原體，同樣共生體通過進(jìn)化降低了其致病性，以便有利于棲息在富有營養(yǎng)的腸道粘膜表面而不被消除[3]。病原體和共生體都有由模式識別受體（PRRs）識別的微生物相關(guān)分子模式（MAMPs），當(dāng)病原微生物感染宿主時(shí)，宿主通過模式識別受體識別病原體并啟動(dòng)信號級聯(lián)，從而誘導(dǎo)腸道發(fā)生炎癥反應(yīng)。

2.1 粘液

硬骨魚的粘膜相關(guān)淋巴組織（MALT）按解剖位置可分為腸相關(guān)淋巴組織（GALT）、鰓相關(guān)淋巴組織（GIALT）和皮膚相關(guān)淋巴組織（SALT）。它們與水環(huán)境直接接觸，是病原體入侵的重要入口點(diǎn)，也是魚體的第一道防線。這些組織表面不斷更新由杯狀細(xì)胞分泌的粘液，并起到物理屏障的作用。粘液是粘膜表面最重要的天然防御機(jī)制之一，它是一種選擇性滲透的粘彈性凝膠狀物質(zhì)，在滲透調(diào)節(jié)、呼吸、攝食、繁殖、排泄和交流中具有多種重要作用。這種粘彈性主要來自粘蛋白，粘蛋白是一種聚合物，具有與寡糖相連的肽骨架，含有一個(gè)或多個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域。寡糖的側(cè)鏈根據(jù)唾液酸或硫酸鹽基團(tuán)的優(yōu)勢來決定粘蛋白是酸性還是中性的。除了粘蛋白，粘液中還發(fā)現(xiàn)了其他蛋白質(zhì)、離子和脂質(zhì)的復(fù)雜混合物，為微生物的粘附和生長創(chuàng)造了理想環(huán)境。粘液的組成決定了其粘附性、粘彈性、運(yùn)輸性和保護(hù)性。粘液中的生化防御是由蛋白酶、溶菌酶、堿性磷酸酶、組織蛋白酶B和抗菌肽等蛋白質(zhì)提供的。除杯狀細(xì)胞外，與炎癥或先天免疫功能相關(guān)的分泌細(xì)胞類型還有囊狀細(xì)胞、棒狀細(xì)胞、小棒狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞，它們同樣是粘液蛋白庫的組成部分[4]。

2.2 先天免疫

2.2.1 天然免疫分子

酶：目前在魚粘液中研究最多的酶是溶菌酶。溶菌酶（N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶或胞壁質(zhì)酶）是一種在大多數(shù)魚類的粘液、淋巴組織和血清中廣泛存在的殺菌酶。魚腸道粘液和其他組織中的溶菌酶是正常機(jī)體防御機(jī)制的組成部分，有助于宿主抵御細(xì)菌的感染。酸性和堿性磷酸酶是魚粘液中重要的溶酶體酶，與魚類的天然免疫系統(tǒng)相關(guān)[5]。這些酶的活性在不同的樣本及環(huán)境條件中會(huì)觀察到顯著差異。此外還有包括蛋白酶，脂酶，芳香酰胺酶，過氧化物酶等多種酶參與了硬骨魚類先天性免疫應(yīng)答。

抗菌肽：抗菌肽（AMPs）被認(rèn)為是宿主抵御病原體感染的重要組成部分。抗菌肽是從微生物、動(dòng)植物等多種生物中分離出來的抗生素。迄今為止，已有超過1 000種抗菌肽被鑒定出來，它們在氨基酸序列、長度和結(jié)構(gòu)等生化特性上表現(xiàn)出不同。但它們也有共同的特征，對包括細(xì)菌、酵母、真菌、包膜病毒和寄生蟲在內(nèi)的多種病原體顯示出廣泛的活性，對宿主細(xì)胞的毒性很小甚至沒有。它們還能抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成。這些抗菌肽存在于接觸微生物的組織中，如粘膜表面，皮膚和免疫細(xì)胞。目前已在許多硬骨魚的粘膜組織或免疫細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了多種類型的抗菌肽，它們被認(rèn)為是魚粘液和腸道屏障功能的重要部分。

補(bǔ)體蛋白：補(bǔ)體系統(tǒng)在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中都存在。在哺乳動(dòng)物中，補(bǔ)體負(fù)責(zé)多種功能，包括調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，消除凋亡和壞死的細(xì)胞以及破壞病原體[6]。并且補(bǔ)體蛋白C3對調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物腸道耐受性和建立共生體也至關(guān)重要。補(bǔ)體的三種激活途徑（經(jīng)典途徑、凝集素途徑和替代途徑）同樣存在于硬骨魚中。

2.2.2 先天免疫細(xì)胞

上皮細(xì)胞：上皮屏障是由上皮細(xì)胞、粘液產(chǎn)生細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和固有免疫系統(tǒng)組成的，它將底層組織與環(huán)境中的潛在危害隔離開。其中上皮細(xì)胞不僅是形成屏障的“磚塊”，還是參與體內(nèi)平衡、共生定植、先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的積極協(xié)調(diào)者[7]。上皮細(xì)胞通過表達(dá)PRRs直接與病原體和共生體相互作用。同哺乳動(dòng)物一樣，魚類腸上皮細(xì)胞可以表達(dá)腸堿性磷酸酶，這種酶在斑馬魚身上被證明能夠解毒脂多糖（LPS），并防止腸道炎癥對常駐微生物群的影響。通過對魚類上皮細(xì)胞與微生物相互作用的研究發(fā)現(xiàn)，常駐腸道菌群可增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定性，并促進(jìn)發(fā)育中斑馬魚腸道的細(xì)胞增殖。此外，已知病毒等病原體會(huì)誘導(dǎo)魚類上皮細(xì)胞凋亡。

肥大細(xì)胞：肥大細(xì)胞是廣泛存在于全身的組織細(xì)胞，特別是與血管和神經(jīng)等結(jié)構(gòu)相關(guān)的組織，并且靠近與外部環(huán)境接觸的表面。在魚類中，肥大細(xì)胞在腸道、皮膚和鰓中最為豐富。電鏡下，肥大細(xì)胞的特征是有一個(gè)大的橢圓形常染核，周圍環(huán)繞著大量的胞質(zhì)電子致密顆粒。這些細(xì)胞的特點(diǎn)是大小不一的圓形胞體，細(xì)胞核偏中心，HE染色呈嗜酸性顆粒。硬骨魚中的肥大細(xì)胞與哺乳動(dòng)物中的肥大細(xì)胞相似，可以產(chǎn)生許多介質(zhì)、趨化因子及細(xì)胞因子。

巨噬細(xì)胞/粒細(xì)胞：巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞也存在于所有硬骨魚的粘膜相關(guān)淋巴組織中。粘膜巨噬細(xì)胞有助于維持局部內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和保持共生微生物區(qū)平衡。但腸道巨噬細(xì)胞在健康的腸道中部分是惰性的，即使長期暴露在細(xì)菌和其他刺激下也不能促進(jìn)炎癥反應(yīng)。

粘膜樹突狀細(xì)胞：粘膜樹突狀細(xì)胞是哺乳動(dòng)物粘膜免疫系統(tǒng)中最重要的組成部分之一。與系統(tǒng)性樹突狀細(xì)胞相比，粘膜樹突狀細(xì)胞特異性地在B和T淋巴細(xì)胞上印記粘膜歸巢分子。粘膜樹突狀細(xì)胞有助于抑制粘膜免疫反應(yīng)，避免全身免疫反應(yīng)。在哺乳動(dòng)物中，粘膜樹突狀細(xì)胞能夠直接從腸腔采集抗原，吸收共生菌和病原體，并且可以在幾天內(nèi)保留少量活的共生體。

2.3 獲得性免疫

與無脊椎動(dòng)物不同，硬骨魚進(jìn)化出了先天免疫和獲得性免疫以保護(hù)自己免受水環(huán)境中的病原體侵襲。與哺乳動(dòng)物相似，硬骨魚也產(chǎn)生B細(xì)胞和T細(xì)胞，這是所有硬骨脊椎動(dòng)物的第一個(gè)適應(yīng)性免疫機(jī)制。免疫球蛋白（Igs）是高度專門化的識別糖蛋白，由兩條重的（H）鏈和兩條輕的（L）鏈組成，可以識別細(xì)菌、病毒和其他致病生物體中的各種抗原，并招募其他細(xì)胞和分子來消滅這些病原體[8]。在硬骨動(dòng)物和四足動(dòng)物中都發(fā)現(xiàn)了兩種形式的免疫球蛋白：一種是膜結(jié)合型的Igs，作為細(xì)胞的抗原受體，也被稱為B細(xì)胞受體（BCR）；另一種是分泌型的Igs，它由終末分化的B細(xì)胞、漿母細(xì)胞和漿細(xì)胞產(chǎn)生，作為B細(xì)胞在適應(yīng)性免疫中的主要效應(yīng)因子。硬骨魚腸道中的免疫球蛋白在抵抗?jié)撛诓≡w通過腸上皮入侵機(jī)體方面起著重要作用。目前在硬骨魚中已經(jīng)鑒定出3種主要的Igs亞型，包括IgM、IgD和IgT/Z，其中IgT/Z被認(rèn)為是專門用于粘膜免疫。粘膜相關(guān)淋巴組織中的B細(xì)胞和免疫球蛋白被認(rèn)為介導(dǎo)了粘膜的動(dòng)態(tài)平衡，因?yàn)橐阎置谛兔庖咔虻鞍祝贵w）可以中和病原體或促進(jìn)其在粘膜中的消除，從而防止進(jìn)一步的感染。此外，在魚類粘膜表面定居的大型共生微生物群也可以被免疫球蛋白識別。