馬麗美，蔡慧敏，梁曉敏，游 富，江愛霞，楊國坤，張新黨，常緒路，張艷敏，孟曉林

(河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/河南省水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，河南新鄉(xiāng)，453007)

魚類腸道內(nèi)存在種類繁多、數(shù)量龐大的正常菌群[1]。這些菌群被稱為宿主的“第二基因組”[2]，在宿主的營養(yǎng)、消化、免疫方面發(fā)揮重要作用[3；4]。已有研究表明，腸道菌群的平衡與穩(wěn)定保證了腸道健康，腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，特別是關(guān)鍵功能菌的變化，與宿主的健康密切相關(guān)[5]。然而，人們對于魚類腸道菌群的研究主要在微生物的群落組成，以及某一種微生物對腸道微生態(tài)的功能或調(diào)節(jié)作用方面，對具有特定功能的微生物功能群尚缺乏深入的研究。硫酸鹽還原菌(sulfate-reduction bacteria，SRB)是一類廣泛存在于自然沉積環(huán)境、人和動(dòng)物腸道中的厭氧或兼性厭氧微生物[6]，該類群微生物可在氧化有機(jī)質(zhì)(如乙酸、醋酸)或氫氣(H2)時(shí)，通過異化作用將硫酸鹽或亞硫酸鹽還原為硫化氫(H2S)或其它含硫化合物，對生態(tài)環(huán)境、人和動(dòng)物腸道微環(huán)境的硫(S)元素循環(huán)具有重要意義[7]。在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上，大部分SRB隸屬于變形菌門(Proteobacteria)。在人和動(dòng)物腸道或糞便中，檢測到的SRB類群主要為脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、脫硫桿菌屬(Desulfobacter)、脫硫球莖菌屬(Desulfobulbus)和脫硫腸狀菌屬(Desulfotomaculum)，定植部位大多在結(jié)腸黏液層[8]?，F(xiàn)有的研究證明，SRB在人和動(dòng)物腸道內(nèi)普遍存在[9,10]。與腸道中的其它微生物存在著復(fù)雜的關(guān)系，在腸道微生態(tài)平衡的調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用[11]。當(dāng)腸道穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)(如免疫力低下、腸道菌群失調(diào))，某些條件致病的SRB可能會(huì)大量繁殖產(chǎn)生過量H2S，破壞腸道屏障，造成腸道損傷，引起腸道疾病[12-15]。

SRB的群落結(jié)構(gòu)多通過編碼異化亞硫酸鹽還原酶關(guān)鍵基因(dsrAB)的檢測來完成，該功能基因主要包括dsrA和dsrB兩個(gè)亞基[16]，其中dsrB基因的擴(kuò)增是檢測SRB群落分布的有效方法[17]。近年來，功能基因高通量測序技術(shù)被廣泛用于不同環(huán)境中SRB群落結(jié)構(gòu)的檢測[6]。目前，有關(guān)SRB的研究主要集中在自然沉積環(huán)境、人類和哺乳動(dòng)物腸道中，魚類作為數(shù)量最多、分布最廣的水生脊椎動(dòng)物，人們對于其腸道中SRB的群落組成和功能還知之甚少[18]。黃河鯉(CyprinuscarpioL.)屬于雜食性底棲魚類，是中國養(yǎng)殖最廣泛的淡水魚[19]，主要養(yǎng)殖模式是集約化池塘養(yǎng)殖。黃河鯉腸道內(nèi)的優(yōu)勢種群主要為變形菌門、梭桿菌門、擬桿菌門、厚壁菌門等[20-23]，但人們對于黃河鯉腸道內(nèi)某一功能群的結(jié)構(gòu)和功能還了解甚少[2]。因此，本研究以黃河鯉為研究對象，采用dsrB基因高通量測序技術(shù)解析養(yǎng)殖池塘黃河鯉前、中、后腸SRB群落特征，并對該功能群進(jìn)行FAPROTAX數(shù)據(jù)庫代謝功能預(yù)測，探討?zhàn)B殖池塘黃河鯉腸道SRB群落結(jié)構(gòu)和代謝特征，以期為探究SRB在魚類腸道微生態(tài)平衡方面發(fā)揮的作用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 黃河鯉樣品采集

實(shí)驗(yàn)黃河鯉采自河南省鄭州市滎陽黃河灘養(yǎng)殖池塘。選擇養(yǎng)殖面積相似和水環(huán)境特征、黃河鯉大小規(guī)格相近的3個(gè)黃河鯉養(yǎng)殖池塘(A組、B組、C組)作為野外采樣池塘。采樣時(shí)間為2019年8月份。分別從每個(gè)養(yǎng)殖池塘中選取規(guī)格、遺傳背景一致的黃河鯉6尾，以10%的MS-222進(jìn)行麻醉，魚體表面以70%酒精進(jìn)行消毒，無菌環(huán)境中分別取前(F)、中(M)、后(H)腸道內(nèi)容物，其中每2尾魚的腸道內(nèi)容物置于1.5 mL無菌離心管中旋渦震蕩混勻、分裝后立即置于干冰中保存，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后保存至-80 ℃冰箱至進(jìn)一步分析。

1.2 黃河鯉腸道內(nèi)容物總DNA的提取和dsrB功能基因高通量測序

黃河鯉腸道內(nèi)容物樣品總DNA采用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒進(jìn)行提取(Qiagen，Germany)。將合格的DNA樣品(>20 ng/μL)送至上海美吉 Illumina HiSeq2500測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。即以總DNA為模板，采用dsrB功能基因引物為DSRp2060F(5′-CAACATCGTYCAYACCCAGGG-3′)和DSR4R(5′-GTGTAGCAGTTACCGCA-3′)。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

1.3 生物信息學(xué)與統(tǒng)計(jì)分析

使用QIIME(Version1.17)對高通量測序所得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去雜、優(yōu)化，α多樣性分析。在97%相似度下，利用UPARSE(7.0.1090)軟件進(jìn)行OTU聚類；通過RDP classifer(Version 11.5)軟件將OTU代表序列與細(xì)菌UNITE數(shù)據(jù)庫比對，進(jìn)行物種注釋并統(tǒng)計(jì)各樣本在各分類水平下的相對豐度和群落組成；利用Mothur(Version 1.30.2)軟件進(jìn)行α多樣性分析；利用OriginPro 2018C進(jìn)行韋恩圖制作。最后基于FAPROTAX數(shù)據(jù)庫(FAPROTAX 1.1)預(yù)測不同樣本中SRB的代謝功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃河鯉腸道dsrB基因序列分析

對黃河鯉前、中、后腸內(nèi)容物SRB功能群進(jìn)行dsrB基因擴(kuò)增和高通量測序，前腸沒有擴(kuò)增出SRB功能群，只有A組后腸，B組中腸、后腸和C組后腸SRB功能群PCR擴(kuò)增成功，共獲得73 613條序列，覆蓋率均大于 99.9%，序列長度203～441 bp(平均長度為330 bp)(表1)。

表1 養(yǎng)殖池塘黃河鯉腸道內(nèi)容物dsrB基因高通量測序序列結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 黃河鯉腸道SRB群落α多樣性分析

根據(jù)黃河鯉腸道內(nèi)容物測序結(jié)果，以97%相似性水平為標(biāo)準(zhǔn)劃分OTU，所有序列被分為173個(gè)OTUs，對不同的OTUs進(jìn)行α多樣性分析(ACE、Chao l、Shannon、Simpson指數(shù))結(jié)果見表2。從表2中可以看出，在B組中腸樣本的Chao 1和ACE指數(shù)遠(yuǎn)大于后腸樣本，而中腸樣本中的Shannon指數(shù)高于各個(gè)后腸樣本，Simpson指數(shù)則與之相反。表明黃河鯉中腸SRB群落豐富度和多樣性均高于后腸。

表2 不同組黃河鯉腸道SRB群落α多樣性指數(shù)分析

黃河鯉中腸、后腸SRB OTU Venn圖分析結(jié)果顯示(圖1)，中腸和后腸共有81個(gè)OTUs，中腸和后腸特有的OTUs數(shù)分別為93和80，表明中、后腸SRB功能群的分布具有一定的空間特異性。

圖1 黃河鯉中腸(M)和后腸(H)中SRB OTUs分布Venn圖

2.3 黃河鯉腸道SRB群落結(jié)構(gòu)分析

系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果顯示，在門水平上，黃河鯉中、后腸SRB大部分為未知分類單元(相對豐度分別為82.44%和84.1%)，表明黃河鯉腸道中SRB群落大多數(shù)分類單元還未確定。在已知的分類單元中，中、后腸SRB優(yōu)勢類群均為變形菌門(相對豐度分別為16.52%和15.9%)。其中，中腸SRB優(yōu)勢類群還包括厚壁菌門(相對豐度0.5%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(相對豐度0.48%)和綠彎菌門(Chloroflexi)(相對豐度0.05%)(圖2A)。后腸SRB主要包括變形菌門(相對豐度為15.9%)(圖2B)。

在屬水平上，中腸SRB主要屬類是變形菌門的脫硫球莖菌屬(相對豐度為15.6%)、脫硫弧菌屬(相對豐度為0.53%)、互營桿菌屬(Syntrophobacter屬)(相對豐度為0.40%)，厚壁菌門的脫亞硫酸菌屬(Desulfitobacterium)(0.50%)和綠彎菌門的暖繩菌屬(Caldilinea)(相對豐度0.05%)(圖2C)。后腸SRB主要類群是變形菌門的脫硫球莖菌屬(相對豐度為12.59%)、脫硫弧菌屬(相對豐度為1.67%)、脫硫菌屬(Desulfotalea)(相對豐度為0.71%)、互營桿菌屬(相對豐度為0.51%)、脫硫念珠菌屬(Desulfomonile)(相對豐度為0.38%)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)(相對豐度為0.04%)(圖2D)。

圖2 養(yǎng)殖池塘黃河鯉腸道SRB在門(A，B)和屬(C，D)水平的群落結(jié)構(gòu)特征

2.4 黃河鯉腸道中、后腸SRB群落功能預(yù)測

對黃河鯉腸道SRB群落FAPROTAX功能預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)測到的代謝途徑主要包括硫化合物的呼吸作用、硫酸鹽呼吸作用和化能異養(yǎng)，表明黃河鯉腸道SRB群落主要參與腸道內(nèi)的硫元素循環(huán)和化能異養(yǎng)等代謝途徑(圖3)。

圖3 黃河鯉中、后腸SRB群落FAPROTAX功能預(yù)測熱圖

其中，在A組黃河鯉后腸(A-H)、B組黃河鯉中腸(B-M)、B組黃河鯉后腸(B-H)和C組黃河鯉后腸(C-H)SRB代謝途徑中，硫化合物的呼吸作用、硫酸鹽呼吸作用和化能異養(yǎng)的相對豐度比較高，好氧化能異養(yǎng)的相對豐度較低。其中，B組黃河鯉后腸的好氧化能異養(yǎng)的相對豐度與其他相比略高。從整體上來看，與后腸相比，黃河鯉中腸被檢測出來的SRB代謝途徑的豐度較低。

3 討論

3.1 黃河鯉腸道SRB功能群的分布特征

本研究采用dsrB基因高通量測序技術(shù)分析了黃河鯉腸道中的SRB群落結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SRB在黃河鯉腸道中主要分布在中、后腸，且中腸SRB多樣性明顯高于后腸(α多樣性分析)。同時(shí)，α多樣性分析結(jié)果顯示黃河鯉中、后腸的SRB群落分布存在一定的空間異質(zhì)性，即黃河鯉中、后腸SRB群落共有OTU有81個(gè)，特有的OTU分別有93、80個(gè)。這與已有研究中，魚類腸道微生物的總體分布具有空間異質(zhì)性的結(jié)果一致[24]。同樣的，在人和哺乳動(dòng)物腸道中，也發(fā)現(xiàn)有SRB群落。RAN等[6]發(fā)現(xiàn)仔豬腸道SRB主要分布在其盲腸。人類腸道的SRB群落主要分布在結(jié)腸[15]。SRB在魚類和其它物種腸道內(nèi)的分布存在空間異質(zhì)性的可能原因是中、后腸的微氧和厭氧環(huán)境更有利于SRB的生長。并且，有研究發(fā)現(xiàn)，豬腸道SRB的群落組成與豬年齡等有關(guān)，但腸道脫硫弧菌是仔豬腸道中的主要的SRB[6]。在本研究中，僅在B組黃河鯉中腸，A、B、C組后腸檢測到SRB，這種差異是否與魚類個(gè)體間差異、養(yǎng)殖池塘的水體環(huán)境差異等影響因素有關(guān)，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

進(jìn)一步的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析表明，黃河鯉腸道中SRB功能群中豐度最高的是變形菌門，也是黃河鯉腸道菌群中的優(yōu)勢類群[25，26]。在屬水平上，黃河鯉中、后腸中的已知優(yōu)勢屬為脫硫球莖菌屬。RAN等[6]在豬腸道中檢測的SRB菌群在門水平上主要分布在變形菌門，但是在屬水平上，脫硫弧菌屬為優(yōu)勢種群，并指出該類群在豬腸道中正常發(fā)揮硫循環(huán)功能，可以及時(shí)清除腸道中的氫氣(H2)，保持腸道健康。本研究發(fā)現(xiàn)，在健康黃河鯉腸道中發(fā)現(xiàn)SRB功能群中豐度最高的是脫硫球莖菌屬，這可能是物種或環(huán)境差異造成的。KUSHKEVYCH等[27]在人類腸道中，發(fā)現(xiàn)脫硫弧菌屬和脫硫腸狀菌屬(Desulfotomaculum)，并且脫硫弧菌屬是炎癥性腸病患者糞便中最常見的SRB。在人類腸道中，SRB群落的脫硫弧菌屬含量最多，已有研究發(fā)現(xiàn)，這類SRB的增殖可以使硫化氫積累，導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎[15]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，脫硫弧菌屬在表現(xiàn)糖耐量異常的小鼠腸道中含量增加。殷曉晨等[28]發(fā)現(xiàn)在肥胖癥患者膳食干預(yù)減肥過程中，隨著患者體重的減輕，其腸道內(nèi)脫硫弧菌減少。這表明硫酸鹽還原菌可能與代謝綜合征相關(guān)。在本研究中，健康黃河鯉腸道中也發(fā)現(xiàn)了SRB群落的脫硫弧菌屬，但是關(guān)于脫硫弧菌屬的過量繁殖是否會(huì)導(dǎo)致魚類腸炎，對魚類代謝是否有影響，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

目前，在動(dòng)物和人類的胃腸道中檢測到的SRB，除了脫硫弧菌屬最為豐富外，同時(shí)也存在脫硫桿菌屬、脫硫球莖菌屬和脫硫腸狀菌屬等分類單元，這些類群也是黃河鯉腸道中豐度較高的類群[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，在健康黃河鯉腸道SRB群落中還存在脫亞硫酸菌屬、脫硫菌屬、脫硫念珠菌屬、互營桿菌屬等特有類群。另外，在人類腸道中也存在黃河鯉腸道內(nèi)沒有檢測出來的SRB群落，例如，脫亞硫酸菌屬、脫硫桿菌屬和脫硫單胞菌屬(Desulfomonas)等[30]。然而，有關(guān)魚類與哺乳動(dòng)物腸道中SRB群落結(jié)構(gòu)和功能差異的原因還有待進(jìn)一步的探討。

3.2 黃河鯉腸道SRB的主要代謝功能

基于FAPROTAX數(shù)據(jù)庫功能注釋結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)，黃河鯉腸道SRB參與的代謝過程主要包括硫化合物的呼吸作用、硫酸鹽呼吸作用和化能異養(yǎng)，說明黃河鯉腸道SRB細(xì)菌群落相對豐度主要集中在硫化物代謝和化能異養(yǎng)功能上。

PITCHER等[31]表示人類腸道中的SRB(脫硫弧菌屬)主要與硫化物毒性有關(guān)，參與人體腸道硫代謝，可以通過硫酸鹽還原和含硫氨基酸的代謝引起潰瘍性結(jié)腸炎。腸道中的SRB代謝與仔豬腸道中的其它菌群有著交叉喂養(yǎng)關(guān)系，共同影響著仔豬腸道中的硫代謝[6]。HOPKINS等[32]推測含有大量雙歧桿菌(Bifidobacterium)的嬰兒微生物群中存在脫硫弧菌屬，這可能是因?yàn)榇罅咳樗崤c氫氣(H2)是腸道中SRB的重要電子供體，即人類腸道中SRB(脫硫弧菌屬)參與了諸多的化能異養(yǎng)或自養(yǎng)過程，即該結(jié)果與本研究中黃河鯉腸道SRB功能預(yù)測的結(jié)果相似，SRB不僅主要參與黃河鯉腸道中S元素的循環(huán)過程，還與其它類群的微生物存在復(fù)雜的交叉喂養(yǎng)關(guān)系，參與化能異養(yǎng)過程。

4 結(jié)論

通過SRB功能基因(dsrB)高通量測序技術(shù)，對黃河鯉前、中和后腸SRB功能群進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)SRB功能群在黃河鯉腸道中主要分布在中腸和后腸，中腸的SRB主要包括變形菌門的脫硫球莖菌屬、脫硫弧菌屬、互營桿菌屬，厚壁菌門的脫亞硫酸菌屬和綠彎菌門的暖繩菌屬；后腸的SRB主要分布在變形菌門的脫硫球莖菌屬、脫硫弧菌屬、脫硫菌屬、互營桿菌屬、脫硫念珠菌屬和鞘氨醇單胞菌屬。且變形菌門的脫硫球莖菌屬是黃河鯉腸道中SRB功能菌群中的優(yōu)勢菌群。對黃河鯉腸道SRB群落FAPROTAX數(shù)據(jù)庫功能預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃河鯉腸道SRB參與的代謝過程主要包括硫化合物的呼吸作用、硫酸鹽呼吸作用和化能異養(yǎng)。