劉 鑫，溫 彬,3，馬騰飛，繆 琳，高建忠,3，陳再忠,3

(1.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306)

七彩神仙魚(yú)(Symphysodonaequifasciatus)隸屬于鱸形目(Perciformes)慈鯛科(Cichlidae)盤(pán)麗魚(yú)屬(Symphysodon)，原產(chǎn)于亞馬遜河流域，因其體色艷麗，條紋多樣等特征，被譽(yù)為“觀賞魚(yú)之王”[1]。該物種具有獨(dú)特的親代撫育行為，即仔魚(yú)孵化后的四周內(nèi)以親本體表分泌的粘液為營(yíng)養(yǎng)和免疫來(lái)源[2-3]。BUCKLEY等[4]發(fā)現(xiàn)七彩神仙魚(yú)粘液中含有大量營(yíng)養(yǎng)和非營(yíng)養(yǎng)因子，包括免疫球蛋白、激素和必需離子。免疫球蛋白M(IgM)在親魚(yú)產(chǎn)卵后逐漸增加，在幼魚(yú)達(dá)到自由游泳階段時(shí)達(dá)到峰值，然后下降到最初的水平，這種變化類(lèi)似于哺乳動(dòng)物在母乳喂養(yǎng)期間為子代提供的被動(dòng)免疫[5-6]。

免疫球蛋白超家族(IgSF)由至少編碼一個(gè)免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域的基因組成，其成員具多種細(xì)胞功能，如細(xì)胞表面抗原受體、細(xì)胞粘附分子和細(xì)胞因子受體等[7]。連接黏附分子(JAMs)是IgSF成員，其中，JAM-A分子參與細(xì)胞旁通透性、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和血小板活化等生物過(guò)程[8-9]。DU等[10]克隆了草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)Gcjam-a，發(fā)現(xiàn)Gcjam-a可能是呼腸孤病毒的受體，在病原體免疫防御中發(fā)揮作用。cd22屬唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素(Siglecs)，也是IgSF成員，主要表達(dá)于B細(xì)胞，調(diào)節(jié)其存活、增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及抗體的產(chǎn)生[11]。本實(shí)驗(yàn)組前期對(duì)七彩神仙魚(yú)育幼期皮膚轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),jam-a和cd22基因表達(dá)分別在育幼期間和育幼結(jié)束后顯著上調(diào)，暗示著二者可能參與了親子的免疫防御，且扮演不同的角色。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，是淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)常見(jiàn)的病原菌[12-13]，氣單胞菌屬會(huì)導(dǎo)致七彩神仙魚(yú)患腸炎病[14]。本實(shí)驗(yàn)選取嗜水氣單胞菌[15]為感染模型，從七彩神仙魚(yú)皮膚中克隆獲得了jam-a和cd22，并通過(guò)熒光定量PCR法分析了其在組織中的表達(dá)量，以及細(xì)菌刺激后各組織中的表達(dá)模式，以期初步了解jam-a和cd22在七彩神仙魚(yú)免疫系統(tǒng)中可能的作用，為豐富IgSF分子在硬骨魚(yú)類(lèi)中的免疫功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康的七彩神仙魚(yú)(體長(zhǎng)10～13 cm，體質(zhì)量80～100 g)取自上海海洋大學(xué)濱海養(yǎng)殖基地，暫養(yǎng)1周[(28±0.5) ℃，pH 7.8±0.5，充氧]。嗜水氣單胞菌菌株來(lái)自上海海洋大學(xué)病原庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 七彩神仙魚(yú)總RNA提取與cDNA的合成

七彩神仙魚(yú)暫養(yǎng)后，選6尾健康的七彩神仙魚(yú)，解剖收集肝臟、心臟、脾臟、頭腎、皮膚、腸道、肌肉、鰓、腦和性腺，共10個(gè)組織，使用TRIzol(Invitrogen)提取各組織中的總RNA，1%瓊脂凝膠電泳測(cè)定RNA完整性，其濃度和純度用分光光度計(jì)測(cè)定。根據(jù)PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)合成cDNA。

1.2.2sajam-a和sacd22基因克隆

根據(jù)前期七彩神仙魚(yú)皮膚轉(zhuǎn)錄組獲得jam-a和cd22 cDNA部分序列，利用Primer 5設(shè)計(jì)開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)特異性引物(表1)，分別用于克隆驗(yàn)證上述基因的ORF序列。以七彩神仙魚(yú)皮膚中的cDNA為模板，利用PCR方法及上述引物對(duì)sajam-a和sacd22進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系25 μL：cDNA 1 μL，正反向引物各1 μL，金牌 Mix green(TsingKe)22 μL。反應(yīng)條件：98 ℃，2 min；98 ℃，10 s，56 ℃，10 s，72 ℃，10 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃，1 min。PCR產(chǎn)物以1%的瓊脂凝膠電泳測(cè)定并切膠回收，送至上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3sajam-a和sacd22基因生物信息學(xué)分析

使用NCBI上的ORF Finder查找sajam-a和sacd22的ORF區(qū)，并獲得相應(yīng)的氨基酸序列；應(yīng)用ExPASy工具(http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測(cè)等電點(diǎn)(pI)及分子質(zhì)量(Mw)； SignalP 4.1和TMHMM 2.0分別預(yù)測(cè)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域；SMART分析蛋白結(jié)構(gòu)域；Blast程序搜索與其他物種的jam-a和cd22基因同源性分析；使用Clustal-X和MEGA 5.0軟件構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4sajam-a和sacd22基因的組織表達(dá)分析

根據(jù)sajam-a和sacd22的ORF區(qū)設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異性引物(表1)。以七彩神仙魚(yú)各組織的cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參基因，利用熒光定量RT-PCR的方法測(cè)定各組織中sajam-a和sacd22的表達(dá)模式。反應(yīng)體系20 μL：2×T5 Fast qPCR Mix(TsingKe) 10 μL，cDNA 模板1.6 μL，正反向引物各0.8 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，1 min；95 ℃，10 s，56 ℃，5 s，72 ℃,10 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃，5 s；65 ℃，5 s；95 ℃，15 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算sajam-a和sacd22在組織中的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物信息

1.2.5sajam-a和sacd22基因免疫刺激后的表達(dá)變化

將健康的七彩神仙魚(yú)分為2組，每組36尾魚(yú)，分別飼養(yǎng)于已曝氣的水中。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射1x107cfu/mL的菌液(2 mL/尾)，對(duì)照組注射等量的PBS緩沖液。在注射后的0、6、12、24、48、72 h后，分別從兩組隨機(jī)各取6尾魚(yú)，對(duì)其進(jìn)行解剖取樣，主要取樣組織為皮膚、腸道、頭腎和脾臟。提取各組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用qRT-PCR測(cè)定免疫刺激后各組織不同時(shí)間點(diǎn)sajam-a和sacd22的表達(dá)模式。反應(yīng)體系、程序及表達(dá)量計(jì)算方法同上述組織表達(dá)。采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 sajam-a和sacd22的克隆及序列分析

七彩神仙魚(yú)sajam-a和sacd22的ORF序列長(zhǎng)度分別為903 bp和1 032 bp(圖1)，分別編碼300和343個(gè)氨基酸(aa)。sajam-a預(yù)測(cè)蛋白理論Mw為32.51 kDa，PI為8.84，其N(xiāo)基端存在1個(gè)信號(hào)肽(aa 1～20)，隨后是1個(gè)Ig(aa 26～126)和1個(gè)Ig C2結(jié)構(gòu)域(aa 128～213)，羥基末端是1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(aa 236～257)(圖1A)。sacd22蛋白理論Mw為38.12 kDa，PI為8.82，其氨基酸序列存在1個(gè)信號(hào)肽(aa 1～18)，2個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域(aa 26～128 134～202)，1個(gè)Ig C2結(jié)構(gòu)域(aa 219～278)和1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(aa 297～319)(圖1B)。

圖1 七彩神仙魚(yú)sajam-a(A)和sacd22(B)的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 sajam-a和sacd22氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類(lèi)中jam-a氨基酸序列有較高的相似度(51.83% ～ 93.00%)，sajam-a的氨基酸序列與尼加拉瓜湖始麗魚(yú)(Archocentruscentrarchus)的相似度最高，為93.00%；尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)次之，為71.76%(圖2A)。cd22氨基酸序列在魚(yú)類(lèi)中也有較高的相似度(71.72%～92.71%)，sacd22的氨基酸序列與尼加拉瓜湖始麗魚(yú)的相似度最高，為92.71%(圖2B)。各物種jam-a和cd22氨基酸序列構(gòu)成的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，哺乳類(lèi)和魚(yú)類(lèi)分別單獨(dú)成簇，七彩神仙魚(yú)jam-a和cd22均與尼加拉瓜湖始麗魚(yú)的進(jìn)化距離最近(圖3)。

圖2 jam-a(A)和cd22(B)氨基酸的多重序列比對(duì)

圖3 基于NJ法構(gòu)建的jam-a(A)和cd22(B)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 sajam-a和sacd22的組織表達(dá)模式

如圖4所示，sajam-a和sacd22在健康七彩神仙魚(yú)的10個(gè)組織中都有表達(dá)，并存在顯著的組織差異性。sajam-a在鰓中表達(dá)量最高，其次是肝臟、頭腎、腸道和皮膚，在肌肉中表達(dá)量最低(圖4A)。sacd22在脾臟和頭腎表達(dá)量較高，同樣在肌肉中幾乎不表達(dá)(圖4B)。

圖4 sajam-a(A)和sacd22(B)在七彩神仙魚(yú)不同組織中的表達(dá)特征

2.4 sajam-a和sacd22基因免疫刺激的表達(dá)變化

嗜水氣單胞菌感染七彩神仙魚(yú)后，定量分析測(cè)定七彩神仙魚(yú)腸道、頭腎、皮膚和脾臟組織中jam-a和cd22的時(shí)序表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腸道、頭腎、皮膚和脾臟中，sajam-a的表達(dá)量均在6 h時(shí)顯著上升，且在腸道和頭腎中6 h達(dá)到峰值，分別為對(duì)照組的5.30倍和5.60倍，12 h開(kāi)始降低(圖5A和B)；在皮膚和脾臟中12 h達(dá)到峰值，分別為對(duì)照組的7.05倍和8.57倍，在24 h降低，48 h達(dá)到最低值，72 h恢復(fù)正常水平(圖5C和D)。腸道和頭腎中，sacd22的表達(dá)量在6 h顯著上升，在頭腎中72 h達(dá)到峰值(圖6A和B)；脾臟組織sacd22的表達(dá)水平在48 h顯著上調(diào)，72 h達(dá)到峰值(圖6D)；皮膚組織sacd22的表達(dá)水平在12 h顯著上調(diào)，48 h達(dá)到峰值(圖6C)。

圖5 嗜水氣單胞菌感染后sajam-a在七彩神仙魚(yú)不同組織中(A-D)的表達(dá)分析

圖6 嗜水氣單胞菌感染后sacd22在七彩神仙魚(yú)不同組織中(A-D)的表達(dá)分析

3 討論

IgSF成員通過(guò)突變和選擇進(jìn)化出大量的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)參與了細(xì)胞識(shí)別、粘附、發(fā)育和形態(tài)發(fā)生的過(guò)程，在特異性和非特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[16-17]。本研究根據(jù)七彩神仙魚(yú)皮膚轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，克隆獲得sajam-a和sacd22。其推導(dǎo)的氨基酸序列均包含1個(gè)信號(hào)肽，表明其蛋白質(zhì)可能分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中，作為細(xì)胞間信使行使功能[16]。另外，兩個(gè)基因均至少包含一個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域，這也是證明其為IgSF成員的重要依據(jù)。序列比對(duì)顯示，sajam-a和sacd22的氨基酸序列均與同為慈鯛科的尼加拉瓜湖始麗魚(yú)同源性最高，這一結(jié)果證明了克隆得到的sajam-a和sacd22基因序列的準(zhǔn)確性。進(jìn)化樹(shù)分為魚(yú)類(lèi)和哺乳動(dòng)物兩大支，jam-a和cd22氨基酸序列進(jìn)化關(guān)系與動(dòng)物本身的進(jìn)化分類(lèi)吻合，揭示jam-a和cd22在進(jìn)化過(guò)程中的保守性。

組織測(cè)定表明sajam-a和sacd22在各組織中都有不同的表達(dá)模式，并存在顯著的組織差異性。其中，sajam-a在鰓中表達(dá)量最高，其次是肝臟、頭腎、腸道和皮膚。鰓是重要的免疫組織，可以與水生環(huán)境中的各種病原體相互作用，其免疫功能和結(jié)構(gòu)完整性是魚(yú)類(lèi)正常生長(zhǎng)和抗病能力所必需的[18]。腸道和皮膚存在著淋巴組織，包含著淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，是魚(yú)類(lèi)重要的黏膜免疫組織，能抵御病原體的入侵[19]。頭腎和脾臟是硬骨魚(yú)中最大的淋巴組織和免疫活性組織，巨噬細(xì)胞較多，具有吞噬及捕獲抗原的功能[20]。草魚(yú)的Gcjam-a主要在鰓和腸道中表達(dá)，其次為腎和肝等免疫組織，結(jié)果與本研究相似[10]。在七彩神仙魚(yú)中，sacd22也在10個(gè)組織中廣泛表達(dá)，在脾臟和頭腎等免疫組織中表達(dá)量較高。sajam-a和sacd22在七彩神仙魚(yú)這些免疫相關(guān)組織中的高表達(dá)，表明其在機(jī)體免疫機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。

嗜水氣單胞菌感染魚(yú)體后，sajam-a和sacd22的表達(dá)量在腸道、頭腎、脾臟和皮膚中均呈現(xiàn)顯著上調(diào)，但二者具有不同的表達(dá)模式。皮膚是機(jī)體免疫防御的第一道屏障，在皮膚中sajam-a迅速響應(yīng)，表達(dá)量6 h開(kāi)始顯著上調(diào)，12 h達(dá)到峰值。同樣，sajam-a的表達(dá)量在另外3個(gè)組織中6 h均顯著上調(diào)，然后表達(dá)量逐漸下降，恢復(fù)到正常水平。而sacd22的表達(dá)量在皮膚中12 h開(kāi)始上調(diào)，脾臟中48 h開(kāi)始上調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)sacd22在72 h內(nèi)維持較高的表達(dá)量。JAMs在細(xì)胞間接觸部位觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)的能力調(diào)節(jié)多種生物過(guò)程，包括白細(xì)胞滲出、緊密連接形成和維持、細(xì)胞旁通透性、細(xì)胞極化、屏障功能調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移和血小板活化的調(diào)節(jié)[9]。在哺乳動(dòng)物中，已經(jīng)證實(shí)jam-a為輪狀病毒(Rotaviruses)[21]、貓杯狀病毒(Felinecalicivirus)[22]、呼腸孤病毒(Mammalianreovirus)[23]的受體。大量研究表明，病原刺激會(huì)影響jam-a基因的表達(dá)[24-25]。Siglecs是一類(lèi)包含Ig結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞表面受體，主要存在于脊椎動(dòng)物的各種免疫細(xì)胞中，可以與含唾液酸的聚糖特異性結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞粘附和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)[11]。CD22作為Siglecs家族的一員，可以調(diào)控B細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)閾值，對(duì)B細(xì)胞的早期發(fā)育發(fā)揮重要的作用，且在小鼠中驗(yàn)證了這一功能[26]。據(jù)報(bào)道，JAM-A可以通過(guò)細(xì)胞介導(dǎo)的防御反應(yīng)促進(jìn)先天免疫[10]，而CD22通過(guò)調(diào)控B細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，活化B細(xì)胞促進(jìn)體液免疫[11]，這可能是sajam-a和sacd22在七彩神仙魚(yú)感染病原菌后組織中表達(dá)模式不同的原因。七彩神仙魚(yú)免疫組織中sajam-a和sacd22的變化，表明了sajam-a和sacd22均參與了抗菌免疫反應(yīng)，推測(cè)在七彩神仙魚(yú)親代撫育階段，sajam-a和sacd22分別對(duì)親魚(yú)先天免疫和體液免疫反應(yīng)發(fā)揮了重要的作用，具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。