曾祥標(biāo)，陳逸文，陳曉峰，劉仕軍，白志毅，2，李文娟，2

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306；3.上海牧高生物科技有限公司，上海 201306)

在大力發(fā)展優(yōu)質(zhì)、綠色、生態(tài)的水產(chǎn)養(yǎng)殖背景下，水產(chǎn)養(yǎng)殖的污染處理問題已經(jīng)成為限制其發(fā)展的重要因素[1]。目前急需開發(fā)更多安全、清潔、高效的功能性產(chǎn)品，來緩解養(yǎng)殖水環(huán)境的壓力，并同時增強水產(chǎn)動物機體免疫從而達到健康養(yǎng)殖的目的，這也是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖的研究熱點之一[2]。葫蘆巴作為一種藥用植物，其種子含有豐富的甾體皂苷和生物堿[3]，能夠有效增強機體的抗氧化能力[4]。用添加葫蘆巴籽提取物(fenugreek seed extract，F(xiàn)SE)的飼料喂養(yǎng)養(yǎng)殖動物能調(diào)節(jié)其腸道微生物菌群，通過增加有益菌總量從而減少動物糞便中氨氣、甲烷等有害氣體的排放[5]，而水體中有益菌的含量與水體中總磷的含量密切相關(guān)[6]，這為FSE在水體凈化的應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)，但尚未有相關(guān)報道。

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)俗稱河蚌、珍珠蚌等，屬雙殼綱(Bivalvia)蚌科(Unionidae)帆蚌屬(Hyriosis)，喜歡在水質(zhì)清新的湖泊河流中生活[7]。三角帆蚌是我國生產(chǎn)淡水珍珠的主要育珠蚌，其珍珠產(chǎn)量占我國淡水珍珠的80%，占據(jù)重要的國際戰(zhàn)略及經(jīng)濟地位[8]。目前我國養(yǎng)殖三角帆蚌培育淡水珍珠的方式多為施有機肥進行肥水養(yǎng)殖，這往往導(dǎo)致養(yǎng)殖水域水體的惡化，對三角帆蚌經(jīng)濟效益和機體健康產(chǎn)生了不利影響[9]。本實驗研究了在養(yǎng)殖水體中添加FSE對水質(zhì)的作用和對三角帆蚌抗氧化活性的影響，旨為FSE在凈化養(yǎng)殖水體水質(zhì)和三角帆蚌健康養(yǎng)殖兩方面的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

三角帆蚌采購于上海濱海生產(chǎn)基地，選取大小均一、噴水有力、體質(zhì)健康的1齡蚌[長寬高分別為：(5.96±0.24) cm；(1.31±0.03) cm；(3.19±0.19) cm，體重：(17.49±0.96) g]，飼養(yǎng)于實驗室玻璃缸內(nèi)，以豆?jié){投喂并24 h不斷充氧。養(yǎng)殖水體來源于實驗室鯽魚養(yǎng)殖水。養(yǎng)殖全程投喂鯽魚配合飼料(通威股份有限公司)，每日早晚各投喂1次。FSE由上海牧高科技有限公司提供，成分分析見表1。

表1 FSE成分分析表

1.2 實驗設(shè)計

采集1.1中的養(yǎng)殖水體，相同環(huán)境條件下，分別設(shè)5個FSE濃度處理組(0.02‰、0.04‰、0.06‰、0.08‰、0.10‰)和1個對照組(不添加FSE)，每組設(shè)3個平行。實驗在玻璃缸(30 cm×30 cm×30 cm)中進行，養(yǎng)殖水體為10 L，全過程保持充氧，不換水，后采集水體樣本分析其對養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響。

根據(jù)FSE對養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響，選擇添加0.06‰濃度FSE進行進一步養(yǎng)殖實驗。同樣采集1.1中的養(yǎng)殖水體，以僅在該水體中放置三角帆蚌為對照組，以放置三角帆蚌并添加0.06‰濃度FSE為處理組，采集樣品，分析水質(zhì)指標(biāo)和三角帆蚌血清的抗氧化活性。其中，每組設(shè)3個平行，每個平行放入10 L養(yǎng)殖水體和6只三角帆蚌。每個平行中取6個樣品作為生物學(xué)重復(fù)進行測定。實驗全程均在在玻璃缸(30 cm×30 cm×30 cm)中進行且保持充氧，不換水。

1.3 樣品采集

1.4 測定方法

1.4.1 水質(zhì)測定方法

1.4.2 三角帆蚌血清抗氧化活性測定方法

超氧化物歧化酶(SOD)和堿性磷酸酶(ALP)采用碧云天公司試劑盒進行測定，丙二醛(MDA)采用索萊寶公司試劑盒進行測定，測定方法均參照試劑盒說明書。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)軟件進行統(tǒng)計分析，使用單因素方差分析(One-way ANOVA)及Duncan法進行多重比較，P<0.05時表示差異顯著。采用Excel和GraphPad Prism 8.0軟件進行作圖處理。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度FSE對養(yǎng)殖水體的凈化效果

添加FSE對養(yǎng)殖水體pH的影響如圖1所示。在96 h時0.02‰濃度組pH顯著低于對照組，其它時間點無顯著性差異；而其它濃度組在24 h和48 h時pH顯著低于對照組，在72 h和96 h時無顯著性差異。

圖1 不同濃度FSE處理對養(yǎng)殖水體中pH的影響

圖2 不同濃度FSE處理對養(yǎng)殖水體中的影響

添加FSE對養(yǎng)殖水體中NO2-N含量的影響如圖3所示。在72 h和96 h時，各濃度組NO2-N含量均顯著低于對照組；在24 h時，0.08‰和0.10‰濃度組的NO2-N含量顯著低于其他各濃度組；在48 h時，除0.02‰濃度組外，其余各濃度組的NO2-N含量均顯著低于對照組。

圖3 不同濃度FSE處理對養(yǎng)殖水體中NO2-N的影響

添加FSE對養(yǎng)殖水體中TN含量的影響如圖4所示。在24 h時，0.08‰濃度組TN含量顯著高于其它各濃度組。

圖4 不同濃度FSE處理對養(yǎng)殖水體中TN的影響

添加FSE對養(yǎng)殖水體中TP含量的影響如圖5所示。除在72 h時0.04‰濃度組與對照組的TP含量無顯著性差異，其余時間點各濃度組TP含量與對照組相比均有顯著性差異；0.08‰和0.10‰濃度組的TP含量始終顯著高于對照組，而0.02‰濃度組TP含量始終顯著低于對照組；在72 h和96 h時，0.06‰濃度組的TP含量最低。

圖5 不同濃度FSE處理對養(yǎng)殖水體中TP的影響

添加FSE對養(yǎng)殖水體中PO4-P含量的影響如圖6所示。在24 h和72 h時，0.08‰和0.10‰濃度組的PO4-P含量顯著低于其它各濃度組。且隨著時間的推進，各組水體中PO4-P的含量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢。0.10‰濃度組在96 h時的PO4-P含量降至最低。

圖6 不同濃度FSE處理對養(yǎng)殖水體中PO4-P的影響

2.2 添加FSE對三角帆蚌養(yǎng)殖水體的凈化效果

在養(yǎng)殖三角帆蚌水體中添加0.06‰FSE時，對養(yǎng)殖水體中pH以及PO4-P含量有顯著影響，但對NO2-N含量無顯著影響。如圖7所示，在24 h時，處理組pH顯著低于對照組，其余時間均無顯著性差異。處理組PO4-P含量均低于對照組，且后者在48 h時的PO4-P含量較前者高出76.32%，差異顯著。對照組和處理組NO2-N含量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，但二者之間無顯著性差異。

圖7 三角帆蚌養(yǎng)殖添加FSE對養(yǎng)殖水體中pH、PO4-P、NO2-N的影響

圖8 三角帆蚌養(yǎng)殖添加FSE對養(yǎng)殖水體中的影響

2.3 養(yǎng)殖水體中添加FSE對三角帆蚌抗氧化酶活性的影響

養(yǎng)殖水體中添加FSE對三角帆蚌機體SOD活性以及MDA含量均有顯著影響，而對ALP活性無顯著影響。如圖9所示，對照組與處理組三角帆蚌SOD活性隨測定時間呈現(xiàn)不同的規(guī)律，對照組SOD活性呈現(xiàn)下降的趨勢，而處理組反之，且在48 h及96 h時，處理組SOD活性均顯著高于對照組；MDA含量測定結(jié)果表明，隨著時間的推移，處理組MDA含量呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢，且在96 h時處理組MDA含量顯著低于對照組；對照組和處理組各檢測時間點及組間ALP活性均無顯著性差異。

圖9 添加FSE對三角帆蚌SOD活性、MDA含量、ALP活性的影響

3 討論

3.1 FSE對養(yǎng)殖水體的凈化作用

葫蘆巴是一種在我國廣泛生長的植物，其種子提取物具有降血糖和血脂、抗氧化、抗菌、抗腫瘤及增強免疫力等多種功效[11-12]。目前葫蘆巴作為飼料添加劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)業(yè)，具有廣闊的前景，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的研究較少，在水質(zhì)凈化方面的研究尚未報道。

漁業(yè)養(yǎng)殖水質(zhì)pH值一般控制在6.5～8.5之間，pH值過高或過低均會抑制水中的微生物活動，導(dǎo)致水體中有機物不易分解、自凈能力減弱[13]。本研究結(jié)果表明，添加高濃度FSE在72 h之內(nèi)有降低養(yǎng)殖水體pH的作用，在72 h和96 h時與對照組相比無顯著性差異，初次添加FSE對養(yǎng)殖水體pH的作用時效為72 h左右。

氨氮作為水體最重要的環(huán)境污染因子之一，濃度過高時會對水生生物產(chǎn)生很強的毒害作用[14]。研究表明絲蘭提取物可以顯著降低水體中的氨氮含量[15]，而本研究結(jié)果顯示FSE僅在24 h時顯著降低了養(yǎng)殖水體中的氨氮含量。水體中氨氮含量與FSE添加濃度和取樣時間均有密切聯(lián)系，二者對氨氮作用的差異可能是其成分不同所導(dǎo)致。絲蘭提取物含甾體皂苷類天然的表面活化劑、具有捕氨能力的多糖物質(zhì)以及對氨基具有強烈結(jié)合能力的多酚物質(zhì)，因此其具有很強的吸附作用[16]；而FSE主要成分為甾體皂苷、黃酮、葫蘆巴堿等物質(zhì)[17]，故二者對水中氨氮的吸收凈化能力有所不同。

水體中的亞硝酸鹽濃度過高會對生物體產(chǎn)生明顯的毒害作用[18]。本研究結(jié)果表明，在72 h和96 h時各濃度組亞硝酸鹽含量均顯著低于對照組，其原因可能是FSE增加了水體中的有益菌數(shù)量，改變了水中微生物的穩(wěn)態(tài)，從而降低了水體中亞硝酸鹽的含量，但具體原因還有待進一步研究。磷是水生生物生長必需的營養(yǎng)元素，也是衡量水質(zhì)好壞的關(guān)鍵因子，水體中磷循環(huán)是一個相當(dāng)復(fù)雜的過程[19]。本研究結(jié)果表明添加高濃度的FSE能降低養(yǎng)殖水體中的磷酸鹽含量卻使總磷含量上升，但已有研究[19]發(fā)現(xiàn)水體中磷酸鹽與總磷的變化趨勢總是相似，這與本研究結(jié)果并不一致，其原因可能是高濃度的FSE能與水體中游離的磷酸根發(fā)生反應(yīng)從而降低水中磷酸鹽含量，而FSE本身含磷元素，加入水中導(dǎo)致總磷含量上升。

3.2 添加FSE對三角帆蚌養(yǎng)殖水體的凈化效果

研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖水體的水質(zhì)是影響三角帆蚌生長和機體健康的重要因素，養(yǎng)殖水體中磷含量過高時往往會導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化從而不利于三角帆蚌生長[20，21]。本研究結(jié)果表明向養(yǎng)殖三角帆蚌水體中添加FSE后總磷和磷酸鹽含量顯著下降，推測原因是FSE中的某些活性物質(zhì)能加強三角帆蚌對藻類的濾食作用，具體調(diào)控機理仍需進一步研究。水體中總磷和磷酸鹽的變化趨勢分別為先降后升和先升后降，這與之前的報道并不類似，這可能與本研究所采用的實驗動物有關(guān)。毛成責(zé)等[22]發(fā)現(xiàn)藻類總量的平均濃度與總磷呈顯著正相關(guān)，暗示總磷含量的升高可能與蚌自身附著的藻類生長有關(guān)。本研究結(jié)果表明向養(yǎng)殖三角帆蚌水體中添加0.06‰濃度FSE并不影響亞硝酸鹽、總氮、氨氮含量，不會對水環(huán)境產(chǎn)生不良影響，為今后FSE在三角帆蚌健康養(yǎng)殖中的推廣奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

3.3 養(yǎng)殖水體中添加FSE對三角帆蚌抗氧化酶活性的影響

SOD對機體抗氧化活性以及免疫功能有重要調(diào)節(jié)作用，其活性的變化反映了機體抵制自由基損傷的能力[23]；MDA能反映機體潛在抗氧化能力，也能間接反映生物體細胞和組織過氧化后機體的損傷程度[24]；三角帆蚌缺乏特異性免疫反應(yīng)，大多依靠體液免疫因子來清除異物，ALP是體液免疫因子中常被用做衡量蚌免疫活力高低的參照指標(biāo)[25]。本研究選取以上指標(biāo)來反映0.06‰濃度FSE對三角帆蚌抗氧化活性的影響。全碧波[26]發(fā)現(xiàn)葫蘆巴提取物能顯著提高大鼠腎組織過氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性，從而增強其抗氧化能力以及免疫力，PRADEEP等[27]也證實葫蘆巴種子具有增強老鼠免疫力的功能，GUARDIOLA等[28]證實向金頭鯛投喂添加葫蘆巴的飼料可增強其免疫應(yīng)答。本研究也同樣表明FSE能增強三角帆蚌SOD活性，提高三角帆蚌機體的相關(guān)免疫功能，這與前人的研究結(jié)果相同。血清MDA含量越低，表明機體細胞受損傷程度較小[24]。在96 h時，處理組MDA含量顯著低于對照組。夏鑫等[29]發(fā)現(xiàn)喂食FSE后，斷奶豬仔的MDA含量顯著降低，其機體的抗氧化功能得到有效改善，張代等[30]發(fā)現(xiàn)肉雞食用含葫蘆巴的飼料后，MDA含量顯著下降，均與本研究結(jié)果類似，說明添加FSE后三角帆蚌抗氧化能力有所增強。SUBRAMANIAN等[31]研究發(fā)現(xiàn)用添加葫蘆巴堿的飼料喂養(yǎng)大鼠后其ALP活性顯著降低，從而增強其抗炎及免疫能力，但本研究發(fā)現(xiàn)三角帆蚌養(yǎng)殖中添加FSE對蚌機體ALP活性并無顯著影響，可能是由于研究動物自身種屬差異性所致。三角帆蚌是無脊椎動物，為開放式循環(huán)系統(tǒng)，自身缺乏特異性免疫反應(yīng)，相比脊椎動物更依賴于細胞防御[32]，但具體原因需要進一步研究探討。