吳建軍，張蕉南，宋雪榮，周 櫻，劉 偉

(1.武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司，武漢430074；2.福建省特種水產(chǎn)配合飼料重點實驗室(福建天馬科技集團(tuán)股份有限公司)，福州350308；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢430223)

大口黑鱸(Micropterussalmoides)，俗稱加州鱸，因肉質(zhì)鮮美和營養(yǎng)價值高，已成為我國主要養(yǎng)殖的名優(yōu)水產(chǎn)魚類之一[1]。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和環(huán)保要求的提升，大口黑鱸的飼養(yǎng)方式由投喂冰鮮魚逐步轉(zhuǎn)換到使用配合飼料[2]。蛋白質(zhì)是水產(chǎn)動物飼料中最重要[3]且成本最高的成分[4]，其中，魚粉是魚類飼料中最主要的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源[5]。為確保大口黑鱸的生長速度并保障其健康水平，配合飼料中蛋白質(zhì)含量應(yīng)接近50%，甚至更高[6]，而且魚粉的添加比例也高達(dá)50%以上[7]。但隨著全球養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，作為特種水產(chǎn)動物最優(yōu)質(zhì)蛋白原料的魚粉的需要量不斷增加，因資源受限導(dǎo)致其價格持續(xù)高位運(yùn)行[8]；另一方面，魚類對飼料原料的蛋白質(zhì)并不能完全消化吸收[9]。因此，為改善魚粉利用率，增加蛋白質(zhì)消化，有必要研究提高大口黑鱸飼料中蛋白質(zhì)的利用技術(shù)。

利用外源酶是現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)提高飼料養(yǎng)分利用、降低飼料成本最廣泛的策略之一[10]。其中，蛋白酶在飼料中的應(yīng)用研究得到了較多的關(guān)注。不同飼料原料組成各異，即使同種原料也會因產(chǎn)地、生產(chǎn)季節(jié)、批次等不同，導(dǎo)致產(chǎn)品組成有所差別，而蛋白酶的應(yīng)用可提高機(jī)體對飼料原料蛋白質(zhì)的利用，降低動物因攝食飼料原料組成不同所導(dǎo)致的影響[11]。對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)飼料原料的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶可以顯著改善魚體對魚粉、羽毛粉等原料的消化吸收，尤其對豆粕的作用最為顯著[12]；對鯡(Seriolaquinqueradiata)的研究也發(fā)現(xiàn)，低溫養(yǎng)殖期間，原料用蛋白酶處理后，魚體可以顯著提高魚粉等的利用[13]。

然而，大多水產(chǎn)動物配合飼料中蛋白酶的應(yīng)用研究報道集中在魚粉替代后，蛋白酶可以提高低魚粉飼料的整體營養(yǎng)價值[14]，如在低魚粉飼料中添加蛋白酶可以改善鯽(Carassiusauratusgibelio)生長[15]；棉粕替代魚粉后使用蛋白酶可以改善尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)的生長和健康[16]；在大口黑鱸中，棉籽濃縮蛋白替代40%魚粉并加入適量蛋白酶后，雖未改善生長，但可以減少魚體和肝臟脂質(zhì)積累[17]。目前，飼料中直接添加蛋白酶對魚類影響的研究較少。因此，本研究以大口黑鱸為研究對象，在實用配方中直接添加不同水平的蛋白酶配制飼料，飼養(yǎng)大口黑鱸，探討外源蛋白酶水平對其生長性能、飼料利用、體成分、肝臟和腸道組織結(jié)構(gòu)以及部分生理生化指標(biāo)的影響，以期為蛋白酶在魚類飼料中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

以魚粉、雞肉粉、豆粕等為原料，設(shè)計適合大口黑鱸生長的粗蛋白質(zhì)水平為55%，粗脂肪水平為12%[18]的5組等氮等能配合飼料。其中，蛋白酶的水平分別為0(P0)、10(P10)、20(P20)、40(P40)和80 U/g(P80)，試驗配方見表1。飼料配制前先將各種固體原料粉碎，過60目篩，稱重后充分混勻。其中，以米糠為稀釋劑將蛋白酶預(yù)混料逐級混勻。固體原料混合均勻后，加入混合充分的魚油和大豆油，攪拌均勻后，加入總重30%的自來水，再次攪拌均勻，隨后利用小型飼料制粒機(jī)(洋工TSE65型雙螺桿干法膨化機(jī)，北京現(xiàn)代洋工機(jī)械公司)，溫度小于70 ℃制粒，制成直徑為2 mm的成品飼料，自然風(fēng)干后置于-20 ℃冰箱中儲藏備用。

表1 試驗飼料配方與營養(yǎng)成分

1.2 試驗魚

試驗魚為大口黑鱸(優(yōu)鱸3號)，來源于湖北荊州某大口黑鱸專業(yè)培苗場。試驗魚運(yùn)回后，暫養(yǎng)于養(yǎng)殖缸中，暫養(yǎng)期間投喂P0組飼料，使試驗魚適應(yīng)試驗飼料和養(yǎng)殖系統(tǒng)。每天于8:30和16:30投喂2次，表觀飽食投喂。

1.3 試驗設(shè)計和飼養(yǎng)管理

暫養(yǎng)2周后，挑選大小均勻的試驗魚225尾，平均體重(32.93±0.18)g，隨機(jī)放入15個直徑0.9 m，高0.7 m的圓柱形玻璃鋼桶內(nèi)(有效體積為285L)，每桶15尾。每組飼料隨機(jī)投喂3個養(yǎng)殖桶，每天投喂2次(8:30和16:30)，表觀飽食投喂，投喂完畢后立即記錄殘餌數(shù)，隨后清除桶內(nèi)殘餌和糞便，并補(bǔ)充養(yǎng)殖水。養(yǎng)殖試驗共進(jìn)行8周。使用循環(huán)水養(yǎng)殖，水源為充分曝氣的城市自來水，養(yǎng)殖期間不間斷氣泵充氧。飼養(yǎng)期間的水質(zhì)條件為：水溫28～31℃，溶解氧>4.0 mg/L，pH約7.0，氨氮<0.5 mg/L，亞硝酸鹽<0.1 mg/L。

1.4 樣品采集

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，試驗魚饑餓24 h，每桶隨機(jī)撈取3尾，麻醉(丁香酚，20 mg/L)后，測量體重和體長后，用1 mL注射器于尾部靜脈取血，放于1.5 mL聚丙烯離心管中，存于4 ℃冰箱內(nèi)靜置2 h后以1 000g的轉(zhuǎn)速離心10 min，提取上層血清并等量混合，保存于-80 ℃冰箱中；然后，取內(nèi)臟、肝臟并稱重；最后，取相同部位的肝臟和前腸，用生理鹽水(0.9%氯化鈉溶液)清洗后置于4%多聚甲醛溶液中，剩下的肝臟和腸道經(jīng)生理鹽水清洗，用液氮速凍后，放于-80℃冰箱中。待取樣完畢后，稱重和計數(shù)每桶剩下的魚，另每桶再隨機(jī)撈魚3尾，放于密封袋中，于-20 ℃冰箱中保存。

1.5 樣品檢測和指標(biāo)計算公式

采用105 ℃直接干燥法測定樣品中的水分含量(GB/T 5009.3-2003)；凱氏定氮法測定樣品中的粗蛋白含量(GB/T5009.5 -2003)；索氏抽提法測定樣品中的粗脂肪含量( GB/T 5009.6- 2003)；550 ℃灼燒稱重法測定樣品中的灰分含量( GB/T 5009.4- 2003)。

血清生化指標(biāo)使用全自動生化分析儀(邁瑞B(yǎng)S-460，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)檢測，分析儀的試劑采購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司。共計檢測10種指標(biāo)，分別為血糖(GLU)、總蛋白(TP)、球蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)和總膽固醇(TC)的含量，以及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和堿性磷酸酶(ALP)的活性。

肝臟、幽門盲囊和腸道用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水(0.9%氯化鈉溶液)清洗后，用濾紙吸干。稱重后放入10 mL離心管中，按1∶9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，經(jīng)勻漿機(jī)勻漿并離心(1 500 g，10 min)取上清液后，待測。除稱重外，所有操作均在冰上進(jìn)行。蛋白酶的測定方法參考LIU等[20]。蛋白酶的活力單位定義為：1 mg組織蛋白在pH 7.2下水解酪蛋白，每分鐘產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為1個酶活力單位(U/mg protein)。

肝和腸道組織標(biāo)本固定24 h后，經(jīng)過水洗、脫水、透明、石蠟包埋等步驟后，6 μm連續(xù)切片，HE染色。采用OLYMPUS CX41顯微鏡，OLYMPUS DP73數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行圖像采集。運(yùn)用圖像分析軟件Image J 1.43 對HE染色結(jié)果進(jìn)行分析、處理。每塊組織隨機(jī)選擇4張照片，進(jìn)行分析，測量方法參考LIU等[20]。

其余各指標(biāo)參考劉偉等[21]，成活率(SR)、增重率(WGR)、特定生長率(SGR)、飼料效率(FE)、蛋白質(zhì)效(PER)、蛋白質(zhì)沉積率(PNR)、肥滿度(CF)、肝體比(HSI)、臟體比(VSI)的計算公式如下：

SR=(Nf/Ni)×100%；

WGR=[(FW-IW)/IW]×100%；

SGR=[(lnFW-lnIW)/t]×100%；

FE=(Wf-Wi+Wd)/WA；

PER=[(Wf-Wi+Wd)/(WA×Wp)]×100%;

PNR={[WA×Wp-(Wf-Wi+Wd)×Fp]/(WA×Wp)]}×100%;

CF=(W/L3)×100;

HSI=(WH/W)×100%;

VSI=(WV/W)×100%。

其中，Ni和Nf分別為結(jié)束后和開始時魚的尾數(shù)， FW和IW分別為試驗魚的初、末均體重(g)，t為試驗天數(shù)(d)，Wi、Wf和Wd分別為試驗魚的初、末總體重和死亡魚體重(g)，WA、Wp和Fp分別為投喂飼料總重(g)、飼料粗蛋白含量(%)和全魚粗蛋白含量(%)，W為魚體重(g)，L為魚體長(cm)，WH和WV分別為肝臟重(g)、內(nèi)臟團(tuán)重(g)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 22.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用Tukey多重比較來檢驗試驗處理均值間的差異顯著性。取P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 生長性能和飼料利用

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，各組間成活率無顯著差異，飼料蛋白酶水平對試驗魚的生長性能和飼料利用均有顯著影響，而對肥滿度、臟體比和肝體比無顯著影響(表2)。各組間初均體重?zé)o顯著差異，但隨蛋白酶添加水平的增加，末均體重、增重率、特定生長率、飼料效率、蛋白質(zhì)效率和蛋白質(zhì)保留率均表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，其中P20和P40組試驗魚的末體重、增重率和特定生長率顯著高于P0組。在飼料利用指標(biāo)方面，P20組的飼料效率、蛋白質(zhì)效率和蛋白質(zhì)保留率最高，顯著高于P0組。以飼料蛋白酶添加水平和魚體特定生長率做折線回歸分析發(fā)現(xiàn)，飼料中蛋白酶水平為16 U/g時(圖1)，試驗魚的生長速度達(dá)到最大。

圖1 大口黑鱸飼料中蛋白酶水平和特定生長率的折線回歸分析

表2 飼料蛋白酶水平對大口黑鱸生長和飼料利用的影響

2.2 全魚體成分

由表3可見，飼料中添加蛋白酶對試驗魚全魚的水分、粗脂肪和灰分含量無顯著影響，但對試驗魚全魚粗蛋白質(zhì)含量影響顯著。隨飼料中蛋白酶添加水平的增加，粗蛋白質(zhì)含量有降低趨勢， P0和P10組試驗魚的粗蛋白質(zhì)含量顯著高于P80組的，而與其它組差異不顯著。

表3 飼料蛋白酶水平對大口黑鱸全魚體成分的影響

2.3 血清生化指標(biāo)

由表4可見，飼料中蛋白酶水平對試驗魚的血糖(GLU)水平和堿性磷酸酶(ALP)活性有顯著影響，而對其它指標(biāo)無顯著影響。其中，P20組試驗魚的GLU水平顯著高于其它組；而飼料中添加蛋白酶后，試驗魚的血清ALP活性顯著降低。

表4 飼料蛋白酶水平對大口黑鱸血清生化指標(biāo)的影響

2.4 蛋白酶活性

由表5可見，在肝臟和幽門盲囊中，隨飼料中添加蛋白酶水平的增加，蛋白酶活性有降低的趨勢。其中，P0組試驗魚的肝臟和幽門盲囊中蛋白酶活性最高，顯著高于P20、P40和P80組的。在腸道中，P80組蛋白酶活性與P0組差異不顯著，但顯著高于其它組。

表5 飼料蛋白酶水平對大口黑鱸肝臟、幽門盲囊和腸道的蛋白酶活性的影響

2.5 腸道組織結(jié)構(gòu)

從圖2可以看出，各組試驗魚的前腸褶皺整齊度較好，未發(fā)現(xiàn)損傷，各組間可見腸道上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞增生。從表6可以看出，飼料中添加蛋白酶增加了前腸的褶皺長度，尤其是P20和P40組，褶皺長度顯著高于P0組。蛋白酶水平未影響肌肉層厚度和褶皺寬度。

圖2 飼料蛋白酶水平對大口黑鱸前腸組織結(jié)構(gòu)的影響(40×)

表6 飼料蛋白酶水平對大口黑鱸前腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.7 肝臟組織結(jié)構(gòu)

由圖3可以看出，所有組的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，細(xì)胞膜、細(xì)胞核清晰可見，未見炎癥細(xì)胞浸潤，未見肝細(xì)胞損傷。但是，所有組的肝細(xì)胞均可見細(xì)胞膨大、核偏移的現(xiàn)象。

圖3 飼料蛋白酶水平對大口黑鱸肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響(400×)

3 討論

3.1 飼料蛋白酶水平對大口黑鱸生長性能和體成分的影響

飼料中添加適宜水平的外源蛋白酶可通過改善動物對飼料蛋白質(zhì)利用率，促進(jìn)動物生長[20,22]。

在本試驗中，飼料中添加10、20、40 U/g蛋白酶可改善大口黑鱸的生長性能和飼料利效率，添加20 U/g組的作用最顯著，但也發(fā)現(xiàn)80 U/g蛋白酶添加組，大口黑鱸的生長性能稍有下降，這在高水平蛋白酶添加對鯽[20]、鯉(Cyprinuscarpio)[23]，以及外源復(fù)合酶對歐洲鰉(Husohuso)[24]、莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)[25]的研究中有類似的發(fā)現(xiàn)，造成魚類生長下降的原因應(yīng)該與過高的外源酶干擾了魚體正常的生理代謝有關(guān)[26]，如過高的外源蛋白酶造成營養(yǎng)物質(zhì)的分解、吸收產(chǎn)生變化[22]，導(dǎo)致試驗魚生長速度降低。

在本試驗中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加蛋白酶后有降低體粗蛋白含量的趨勢，尤其是添加80 U/g蛋白酶組的魚體粗蛋白含量顯著降低，這與關(guān)瑩等[17]研究利用棉籽替代魚粉飼料后加入4.5～7.5 U/g中性蛋白酶，大口黑鱸體成分的變化結(jié)果一致，類似的研究結(jié)果在對歐洲鰉[24]、吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)[26]研究中也有所發(fā)現(xiàn)。在凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[27]的研究中發(fā)現(xiàn)，在低魚粉(10%)飼料中添加復(fù)合蛋白酶，隨添加水平的增加，體粗蛋白含量增加；而在對中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[22]、鯽[15,20]等的研究中，并未發(fā)現(xiàn)蛋白酶水平會影響魚體粗蛋白含量。不同蛋白酶水平影響水產(chǎn)動物粗蛋白含量的原因，可能與試驗對象、飼料配方、酶來源及添加水平有關(guān)，但仍需進(jìn)一步研究。

3.2 飼料蛋白酶水平對大口黑鱸血清生化指標(biāo)的影響

血液學(xué)指標(biāo)可反映出魚類的健康狀況[28]。在本試驗中，僅發(fā)現(xiàn)攝食飼料中添加20 U/g蛋白酶的試驗魚血糖水平顯著高于其它組。關(guān)瑩等[17]也報道了投喂添加4.5 U/g中性蛋白酶的飼料后，大口黑鱸血糖顯著升高，達(dá)到了約10 mmol/L，推測這可能與其糖異生作用增加有關(guān)，因為快速生長的魚類生長激素水平升高，而生長激素有促進(jìn)肝糖原分解，提高血糖的作用[29]。

AST存在于肝細(xì)胞線粒體中，ALT分布于肝細(xì)胞和膽管周圍[30]，血清中AST和ALT活性的升高表示酶通過損傷的質(zhì)膜泄漏或組織合成酶的增加[31]。而血清總蛋白、白蛋白、甘油三酯、膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的含量是監(jiān)測機(jī)體營養(yǎng)狀態(tài)和診斷疾病的指標(biāo)。而在本試驗中上述指標(biāo)各組間均未表現(xiàn)出顯著差異。堿性磷酸酶(ALP)是一組在堿性環(huán)境中能水解磷酸酯產(chǎn)生磷酸的酶。病理狀態(tài)下，ALP主要用于肝病、骨病等的診斷和鑒別[32]。在本試驗中，飼料中添加蛋白酶后ALP活性顯著降低，結(jié)合肝臟的組織切片(圖3)來看，表明飼料中添加蛋白酶后肝臟的功能應(yīng)該有所改善。

3.3 飼料蛋白酶水平對大口黑鱸體內(nèi)蛋白酶活性的影響

在本試驗中發(fā)現(xiàn)，除80 U/g蛋白酶組的試驗魚 腸道蛋白酶活性有所升高外，飼料中添加蛋白酶后試驗魚的肝臟、幽門盲囊蛋白酶活性有降低趨勢，這表明添加外源酶可能引起了肝臟、幽門盲囊內(nèi)源酶的“負(fù)反饋”反應(yīng)。在青魚(Mylopharyngodonpiceus)[33]、鯽[20]、吉富羅非魚[26]中發(fā)現(xiàn)低魚粉(<15%)飼料添加中性蛋白酶有提高肝臟或腸道蛋白酶活性的趨勢，在對鯉的研究中也發(fā)現(xiàn)低魚粉(6%)飼料中添加蛋白酶會增加腸道組織的蛋白酶活性[34,35]，而在高魚粉(15%～20%)飼料中，添加蛋白酶卻沒有發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象[35]，這表明魚粉水平或是易消化蛋白原料的水平會影響肝臟或腸道蛋白酶活性，但是造成這種差異的具體原因需要進(jìn)一步研究。

3.4 飼料蛋白酶水平對大口黑鱸腸道結(jié)構(gòu)的影響

研究認(rèn)為，飼料中補(bǔ)充蛋白酶可通過增加動物胃腸道氨基酸的代謝來減輕腸黏膜損傷，改善腸道完整性[36]。而在高劑量下，如果沒有足夠的底物或飼料蛋白質(zhì)水解，過量的蛋白酶可能會誘導(dǎo)黏膜蛋白水解，導(dǎo)致試驗動物腸道健康受損[27]。在本試驗中發(fā)現(xiàn)腸道表觀組織結(jié)構(gòu)在各組間均比較完整，未發(fā)現(xiàn)有明顯的變化，表明本試驗添加的蛋白酶水平并未影響大口黑鱸腸道健康。在尼羅羅非魚[28]、歐洲鱸(Dicentrarchuslabrax)[29]飼料中添加蛋白酶可以提高其前腸褶皺長度，這在本試驗也有類似的發(fā)現(xiàn)，表明飼料中添加20～40 U/g蛋白酶改善了腸道結(jié)構(gòu)，增加對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[37]。

4 結(jié)論

在本試驗條件下，以飼料蛋白酶添加水平和魚體特定生長率做折線回歸分析發(fā)現(xiàn)，飼料中添加16 U/g的蛋白酶即可使大口黑鱸的生長速度達(dá)到最大。飼料中添加適量蛋白酶可以改善大口黑鱸的生長性能和飼料利用，增加前腸褶皺長度，不會影響肝臟和腸道的表觀健康狀況。但添加80 U/g可導(dǎo)致體粗蛋白含量降低，不利于其營養(yǎng)價值。