于瑤瑤，王 丹，徐 進，徐 濱，馬寶珊，朱祥云

(1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，農業(yè)農村部淡水生物多樣性保護重點實驗室，武漢 430223)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)隸屬于十足目螯蝦科原螯蝦屬，俗稱淡水龍蝦、小龍蝦。原產(chǎn)于北美洲，于1929年經(jīng)日本引入我國，是我國主要經(jīng)濟蝦類之一[1]。低氧應激是養(yǎng)殖過程中最常見的應激因子，在人工養(yǎng)殖條件下，溫度、天氣、浮游動植物以及投入餌料多少等因素都會影響水中溶解氧濃度，使養(yǎng)殖品種受到低氧應激[2]。已有研究證明，在蝦類養(yǎng)殖中低溶氧狀態(tài)下的存活率顯著低于高溶氧下存活率[3]。養(yǎng)殖動物在低氧應激狀態(tài)下，生理生化水平以及基因表達方面會發(fā)生改變[4]，導致諸多不良影響如食欲、活力和抵抗力下降等，甚至死亡。

肝胰腺是甲殼動物消化、吸收、儲存和代謝功能的重要器官[5]。低氧應激會破壞肝胰腺的滲透調節(jié)機制，使肝胰腺消化細胞的溶酶體產(chǎn)生自噬[6]，從而對組織細胞結構造成損傷，并引起肝胰腺中抗氧化酶活力以及其它代謝相關的酶活力發(fā)生顯著變化，從而影響代謝和免疫反應[7-9]。有研究表明，低氧應激可上調凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)肝胰腺中Lvglut2轉錄本的表達，影響缺氧時糖代謝[10]。肝胰腺在蝦類防御反應的啟動中也起著重要作用，低氧應激會通過影響凡納濱對蝦(L.vannamei)肝胰腺細胞中的凋亡調節(jié)因子(TIGAR)參與低氧應激[11]。肝胰腺是蝦類生理代謝調控的主要器官，研究克氏原螯蝦肝胰腺的轉錄組變化，將有助于揭示機體應對低氧應激的分子機制。本研究利用轉錄組測序技術構建了低氧應激下克氏原螯蝦肝胰腺的轉錄組文庫，分析低氧應激下克氏原螯蝦肝胰腺中基因的表達變化以及相關信號通路，以期為進一步研究克氏原螯蝦低氧應激機制奠定基礎，為研究抗應激技術提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗蝦及低氧應激實驗

實驗用克氏原螯蝦取自長江水產(chǎn)研究所梁子湖實驗基地。隨機挑選規(guī)格一致的蝦，平均體重25 g，在持續(xù)充氣的水中暫養(yǎng)兩周，溶氧(DO)濃度(7.8±0.5)mg/L，水溫18～22 ℃。暫養(yǎng)期間，每24 h換一半的水，投喂適量的商品飼料(湖北蒲陽飼料股份有限公司，湖北)，實驗前一天停止喂食。低氧應激實驗：將克氏原螯蝦分為兩組，一組進行低氧應激，一組為對照組在正常DO條件下飼養(yǎng)。實驗組采用氮氣排除水體中氧氣的方法降低DO，將水體中DO降至(2.5±0.2) mg/L[12]，并保持穩(wěn)定10 min。對照組用增氧泵向水中持續(xù)充氧以保持充足DO(DO≥7.5 mg/L)。將實驗蝦投入缺氧水體后，立即將容器用塑料膜封住，3 h后，實驗組和對照組分別取3尾蝦，迅速解剖獲得肝胰腺組織，并立即放入RNA保存液中，在4 ℃冰箱放置過夜后轉移至-80 ℃冰箱中保存。

1.2 轉錄組測序及分析

轉錄組測序由上海元莘生物醫(yī)藥科技有限公司完成。對Illumina Hiseq/Miseq雙末端測序得到的原始數(shù)據(jù)進行處理，得到高質量的測序數(shù)據(jù)，同時對質量修剪前后的序列進行數(shù)據(jù)量統(tǒng)計。然后通過Trinity[13]軟件進行從頭組裝，并使用該軟件對組裝得到的所有轉錄本序列進行基因預測。基于非冗余蛋白庫(Non-Redundant Protein Sequence Database，NR)、蛋白質家族的集合數(shù)據(jù)庫(Protein Families database，Pfam)、基因本體(Gene Ontology，GO)和生物學通路分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)、蛋白直系同源簇數(shù)據(jù)庫(Clusters of Orthologous Groups of proteins，COG)、蛋白質序列數(shù)據(jù)庫(Swiss-Prot Protein Sequence Database，Swiss-prot)等數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得特異基因(Unigene)和轉錄本的功能注釋信息。

1.3 差異表達基因(DEGseq)分析

結合RSEM[14]與各樣品測序得到的reads與Unigene庫的比對結果進行表達量水平估計。對獲得的數(shù)據(jù)進行FPKM(fragments per kilobase per million)值[15]轉換，取閾值為錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05且差異倍數(shù)(Fold Change)≥1的基因作為差異表達基因。獲得差異表達基因以后，對其進行KEGG通路富集分析，GO功能及Pfam結構域分析，獲得各種注釋信息。

1.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證

從測序結果中隨機挑選出10個差異基因，以18S核糖體RNA(18S rRNA)為內參，用Primer premier 5軟件設計引物(表1)，進行qRT-PCR驗證。按2-△△CT法計算基因相對表達量，與測序結果進行比對。反應程序為：95 ℃預變性1 min后開始40個循環(huán)，95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，然后收集熒光信號，進行溶解曲線分析。

表1 實驗所用的引物

2 結果與分析

2.1 測序結果及功能注釋

轉錄組測序分別獲得149 905 186、135 461 974條原始序列。經(jīng)過處理后，得到149 687 062條、135 229 834條的clean reads。對堿基質量及組成進行分析，每組GC含量區(qū)間為 43.98%～47.21%。轉錄本與Unigene的N50(按照長度將組裝轉錄本從小到大排序，累加轉錄本的長度到總長度的一半時，對應轉錄本的長度)分別為2 814 bp 和 1 540 bp，平均長度分別為1 130.17 bp和 760.08 bp

將轉錄本和Unigene與NR、Pfam、Swiss-Prot、GO和KEGG等數(shù)據(jù)庫進行比對，Unigene得到注釋的基因數(shù)總共為39 342個。拼接所得的Unigene與Nr蛋白數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，相似序列所占比例最高的前6種物種分別是美洲鉤蝦(Hyalellaazteca，26%)、內華達古白蟻(Zootermopsisnevadensis，6%)、水螅(Hydravulgaris，3%)、美洲鱟(Limuluspolyphemus，2%)、刺參(Apostichopusjaponicas，2%)和克氏原螯蝦(Procambarusclarkii，2%)(圖1)。

圖1 NR同源物種分類圖

2.2 差異基因表達分析

利用DEGseq分析在低氧應激下和正常狀態(tài)下克氏原螯蝦的肝胰腺中的差異基因表達。顯示251個基因在低氧應激下的肝胰腺中特異表達，其中上調DEGs140個(55.77%)，下調DEG111個(44.22%)(如圖2)。為了進一步篩選得到與克氏原螯蝦耐低氧性狀相關的基因，從差異表達的251個基因中，篩選到差異表達最顯著的前10個基因(表2)。

圖2 差異表達基因MA圖

表2 低氧脅迫下克氏原螯蝦差異表達最顯著的前 10 個基因

2.3 差異表達基因GO功能分析

低氧應激狀態(tài)下，克氏原螯蝦肝胰腺產(chǎn)生251個差異表達基因，將其進行了GO功能富集。圖3展示了克氏原螯蝦DEG在GO各二級功能中的注釋情況。在生物學過程中DEG注釋的主要功能有細胞、代謝和調控；在細胞組分中DEG注釋的功能大多數(shù)與細胞結構和機體的構建有關，如細胞、細胞成分和細胞膜；而在分子功能中，DEG注釋的主要功能為催化活性、結合以及轉運活性。DEG經(jīng)過GO功能富集分析分別富集到生物學過程2 797個、細胞組分399個、分子功能560個GO條目。GO功能富集程度前十的條目如表3。

圖3 差異表達基因GO二級節(jié)點注釋統(tǒng)計圖

表3 GO功能富集前十的條目

2.4 差異表達基因KEGG分析

低氧應激下和常氧狀態(tài)下克氏原螯蝦的肝胰腺中共有5 893個基因注釋到5大類特定的KEGG通路中，分別為細胞過程(9.23%)、環(huán)境信息處理(18.48%)、遺傳信息處理(8.16%)、代謝機制(44.78%)和組織系統(tǒng)(19.26%)。其中，在代謝機制中基因被注釋到的數(shù)目最多(圖4)。KEGG通路富集分析結果顯示：差異表達基因主要富集在代謝途徑(ko00281)，不同環(huán)境下的微生物代謝(ko00280)、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解(ko01100)和原核生物的碳固定途徑(ko00650)等信號通路(圖5)。

圖5 差異表達基因KEGG功能富集柱狀圖

3 討論

3.1 低氧應激反應對克氏原螯蝦體內離子濃度的影響

本研究結果顯示，低氧應激下鉀通道亞家族K成員1亞型X2基因表達量顯著增加。KEGG顯示，低氧應激下差異表達基因在鈣信號通路和磷脂酰肌醇信號通路富集。鉀通道家族蛋白跨越細胞膜形成傳導通路或孔，鉀、鈉和鈣等選擇性離子通過該通路或孔跨細胞膜轉運，維持細胞離子平衡。鉀通道亞家族K成員1屬于內向整流K+通道家族的成員[16]，受胞內ATP的調控，ATP敏感通道只有在受到ATP濃度降低或者缺氧時開放率才會增加[17]。磷脂酰肌醇信號通路中會產(chǎn)生兩個第二信使，與內質網(wǎng)上的配體相結合，開啟鈣通道，使胞內金屬離子濃度升高。低氧應激會影響體內的離子濃度[18]，這與本實驗結果相似。可以推測低氧應激下，鉀通道蛋白活躍，導致胞內金屬離子濃度升高，維持細胞正常興奮，同時通過鈣信號通路和磷脂酰肌醇信號通路，激活下游相關蛋白活性，調節(jié)機體應對低氧所造成的影響。

3.2 低氧應激對克氏原螯蝦物質能量代謝的影響

外界環(huán)境發(fā)生改變影響生物體內整個調控網(wǎng)絡，包括相關基因的表達調控、物質能量代謝進而影響細胞增殖和存亡[10，11，19]。例如組蛋白H3-K36甲基化參與基因的轉錄激活和DNA損傷修復[20]。蝦類可調節(jié)呼吸代謝方式，從有氧代謝轉變?yōu)闊o氧代謝，以糖酵解方式獲得部分能量[21]；蛤蜊(Mactra)在應對急性缺氧時，各種游離氨基酸不僅可以作為滲透調節(jié)的潛在滲透劑，而且在急性缺氧暴露期間通過代謝產(chǎn)生能量[22]。凡納濱對蝦的研究表明，當機體處于低氧脅迫時，脂肪酸可作為一種補充物，可有效修復缺氧應激造成的損傷[23]。這與本實驗的結果相似：纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解，賴氨酸代謝、脂肪酸代謝以及糖代謝、組蛋白H3-K36甲基化負調控條目等通路顯著富集，說明能量代謝在抵抗低氧應激下發(fā)揮了重要作用，推測H3-K36甲基化修復細胞所受到的損傷，脂肪酸代謝和氨基酸代謝為調節(jié)體內離子平衡，抵抗低氧應激提供了能量。在低氧應激狀態(tài)下，機體無氧代謝增強，促進了糖、氨基酸和脂肪酸的無氧代謝。

3.3 克氏原螯蝦在低氧應激反應下的相關信號通路

已有研究證明環(huán)磷酸腺苷(cAMP)通路、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT或PKB)信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路這三條信號通路在低氧應激過程中發(fā)揮重要作用[24-29]。這與本實驗結果相似，在上述通路(圖4)上差異表達基因注釋較多，說明這三個信號通路在低氧應激期間比較活躍。在cAMP信號通路中，低氧應激誘導腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)的轉錄上調，腺苷酸環(huán)化酶(AC)是產(chǎn)生cAMP的酶，部分是由低氧誘導因子-1(HIF-1)轉錄因子介導的[28]，在低氧應激過程中，低氧誘導的其它系統(tǒng)中酶的磷酸化狀態(tài)的變化經(jīng)常與cAMP依賴蛋白激酶(PKA)聯(lián)系在一起[25]，從而影響克氏原螯蝦的抗低氧能力。PI3K-AKT是細胞中一個經(jīng)典的信號通路，涉及多個先天免疫功能相關的生理功能，在無脊椎動物應對環(huán)境刺激過程中起著關鍵作用[30]。已有研究發(fā)現(xiàn)低氧應激下PI-3K通路主要通過影響HIF-1α的穩(wěn)定和(或)合成來發(fā)揮抗低氧作用[26]。HIF-1α是低氧誘導因子-1(HIF-1)的一個亞單位。HIF-1是一種不穩(wěn)定的異二聚體，可以調控多種途徑使機體適應低氧環(huán)境[31]；MAPK通路有三級信號傳遞過程的功能，MAPK，MAPK激酶(MEK或MKK)以及MAPK激酶的激酶(MEKK或MKKK)，這三種酶依次激活共同調節(jié)細胞的多種反應。MAPK信號通路主要有四種分別是ERK-MAPK、JNK-MAPK、p38-MAPK和ERK5-MAPK。Ras-MAPK信號通路在對DNA損傷的應答中，表現(xiàn)出一種自我保護應答，使DNA修復系統(tǒng)對損傷進行糾正[32]。MAPK信號通路參與了羅非魚(Oreochromisniloticus)以及花鱸(Lateolabraxmaculatus)缺氧環(huán)境下的生長階段[27，29]，且HIF-1α是ERK的下游調控成員之一[24]?？梢酝茰y，這三個信號通路可能是通過協(xié)同作用刺激產(chǎn)生HIF-1α(圖6)應對低氧應激。

圖6 cAMP、PI3K-Akt、MAPK信號通路示意圖

此外，在差異表達基因GO功能富集中顯示，黃體溶解功能顯著富集。黃體是生物的一個內分泌腺，它的主要功能之一就是合成孕酮與雌二醇等一系列的類固醇激素以維持生物正常發(fā)育及繁殖功能[33]。黃體異常溶解會導致激素減少從而會對克氏原螯蝦的性腺發(fā)育造成一定影響。已有研究證明低氧應激是通過促進黃體細胞凋亡來誘導黃體溶解[34，35]。本研究結果表明低氧應激對克氏原螯蝦的性腺發(fā)育可能會帶來不良影響。

4 結論

低氧應激下克氏原螯蝦肝胰腺的鉀通道蛋白活躍，導致胞內金屬離子濃度升高，維持細胞正常興奮，消耗大量營養(yǎng)物質進行能量代謝，為機體應對低氧應激提供能量；并產(chǎn)生各種轉錄因子通過鈣信號通路和磷脂酰肌醇信號通路，激活下游相關蛋白活性，通過cAMP、PI3K-Akt、MAPK這三個信號通路從酶活性、機體免疫、DNA損傷修復等方面調節(jié)機體應對低氧所造成的不良影響；同時發(fā)現(xiàn)低氧應激導致黃體溶解，對性腺發(fā)育產(chǎn)生不良影響。