羅相忠，時(shí) 樂，沙 航，李曉暉，梁宏偉，鄒桂偉，崔 峰

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2.安徽科技學(xué)院生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽 233100)

微衛(wèi)星DNA是廣泛存在于真核生物和原核生物基因組中的1-6個(gè)簡單重復(fù)序列[1]。微衛(wèi)星標(biāo)記在基因組中不同區(qū)域分布差異較大，大多數(shù)富集在非編碼區(qū)[2]。由于微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記具有高度多態(tài)性、信息含量豐富、共顯性等優(yōu)勢，被廣泛用于生物物種數(shù)量性狀QTL定位、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和DNA指紋分析[3]。微衛(wèi)星標(biāo)記已經(jīng)發(fā)展成為水產(chǎn)動物育種領(lǐng)域中的常用分子標(biāo)記之一。

微衛(wèi)星標(biāo)記已經(jīng)在眾多水產(chǎn)動物中開展了與生長等性狀的關(guān)聯(lián)分析，取得了良好的結(jié)果。如李燕等[4]通過分析15個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記與96尾雜交鱖(Sinipercachuatsi×S.scherzeri)的體長、體質(zhì)量、體高性狀的相關(guān)性，獲得cD90、MDJ821、PY21、PY55和72217標(biāo)記分別與上述3種生長性狀顯著相關(guān)。余成晨等[5]研究選育草魚(Ctenopharyngodonidella)群體生長性狀與微衛(wèi)星標(biāo)記的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CID1512、CID973_1 和CID254_1 在雌性或雄性個(gè)體中與體質(zhì)量和體長等生長性狀顯著相關(guān)，而CID391_2 僅在雄性個(gè)體中顯著相關(guān)。劉士力等[6]對翹嘴鲌(Erythroculterilishaeformis)的2個(gè)生長激素受體GHR1 和GHR2基因的微衛(wèi)星序列進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)GHR2基因中的4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均與體長和體質(zhì)量等生長性狀相關(guān)。這些為開展鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳多樣性與生長性狀的相關(guān)分析提供了借鑒。

鰱屬于鯉形目鯉科鰱亞科鰱屬，是我國重要養(yǎng)殖魚類，為淡水養(yǎng)殖四大家魚之一，其營養(yǎng)豐富，為人類的動物蛋白來源之一[7]。同時(shí)其以水體中浮游植物為主要餌料，屬于淡水魚類中為數(shù)不多的不投餌的濾食性魚類，為典型的碳匯漁業(yè)對象，具有重要的生態(tài)價(jià)值[8]。鰱食物鏈短，易于養(yǎng)殖，深受養(yǎng)殖者和大眾消費(fèi)者青睞，在我國養(yǎng)殖產(chǎn)量僅次于草魚。長豐鰱(H.molitrix)是中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所利用綜合育種技術(shù)培育的鰱新品種，具有生長速度快、體型好和適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[9]?；谘芯况柕倪z傳多樣性以及篩選與其生長性狀相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記，本研究以湘江鰱(H.molitrix)和新品種長豐鰱作為研究對象，旨在篩選與鰱生長性狀相關(guān)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，為今后分子標(biāo)記輔助育種提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

實(shí)驗(yàn)用2齡長豐鰱和2齡湘江鰱均采自于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部鰱遺傳育種中心，其中長豐鰱60尾，湘江鰱120尾。采集其胸鰭組織，置于無水乙醇的離心管中，帶回實(shí)驗(yàn)室于-20 ℃冰箱中保存。

1.2 生長性狀測定

對長豐鰱和湘江鰱依次進(jìn)行框架數(shù)據(jù)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8的測量(圖1和表1)和全長(X9)、體長(X10)、頭長(X11)、體高(X12)、尾柄高(X13)、眼徑長(X14)、尾柄長(X15)、軀干長(X16)的測量，測量工具分別為直尺和游標(biāo)卡尺。體質(zhì)量(X17)使用電子天平測定。共計(jì)17個(gè)可量性狀。采用SPSS 22.0軟件(由美國SPSS公司開發(fā))進(jìn)行單個(gè)樣本的Kolmogorov-Smirnov(K-S)，檢驗(yàn)所取樣本的生長性狀是否符合正態(tài)分布(P>0.05)。

圖1 鰱框架結(jié)構(gòu)示意圖

表1 鰱形態(tài)測量表

1.3 基因組DNA的提取

鰭條經(jīng)超純水漂洗后，剪取少量鰭條組織，采用高鹽法提取樣本的基因組DNA。提取后，將DNA溶液經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測后，加入超純水稀釋至50 ng/μL，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 微衛(wèi)星引物的篩選

基于本實(shí)驗(yàn)室鰱基因組數(shù)據(jù)(未發(fā)表)，采用Primer5.0(加拿大Primer生物公司)設(shè)計(jì)96對微衛(wèi)星引物，其序列和退火溫度見表2，引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。選用湘江鰱和長豐鰱各3尾對所有引物進(jìn)行初步篩選，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測后毛細(xì)管電泳，進(jìn)而開發(fā)多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記。

表2 鰱13個(gè)微衛(wèi)星引物序列信息

1.5 PCR擴(kuò)增和條帶的檢測

對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體系為10 μL，其中2×Taq PCR Master Mix 5 μL，基因組DNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 3 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性，62℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，以后每個(gè)循環(huán)下降1 ℃，直至52 ℃，共10個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸20 min。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在ABI-3137XL基因分析儀(美國ABI生物公司)上利用毛細(xì)管電泳法(CE)檢測。每個(gè)CE樣品中含有1 μL PCR產(chǎn)物、0.4 μL Genescan-500分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品和20 μL去離子甲酰胺(美國ABI生物公司)。在毛細(xì)管電泳過程中,PCR產(chǎn)物與Genescan-500分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號均由基因分析儀自動保存。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

利用SPSS 22.0軟件對湘江鰱和長豐鰱兩個(gè)群體的生長性狀進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和正態(tài)分布的檢驗(yàn)。利用Cervus 3.0軟件(Cervus公司)統(tǒng)計(jì)兩群體不同位點(diǎn)的等位基因數(shù)(k)、期望雜合度(He)、觀測雜合度(Ho)和多態(tài)信息含量(PIC)。利用SPSS 22.0軟件的線性回歸對兩個(gè)鰱群體的不同微衛(wèi)星位點(diǎn)與生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，初步確定與生長性狀存在顯著差異的位點(diǎn)，再用一般線性模型(GLM)對初步確定的位點(diǎn)進(jìn)行單變量的觀測平均值的多重比較，確定同一微衛(wèi)星位點(diǎn)不同基因型間是否存在顯著差異，P<0.05為差異顯著。為了排除偶然性，在利用SPSS 22.0軟件分析時(shí)，每種基因型至少具有3次觀察值才被統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 長豐鰱和湘江鰱生長性狀的統(tǒng)計(jì)

長豐鰱中體質(zhì)量的變異系數(shù)最大為15.67%，湘江鰱中體質(zhì)量的變異系數(shù)最大為15.68%(表3)，體質(zhì)量在鰱群體中的變異系數(shù)均較大，相對于其他生長性狀，體質(zhì)量具有更大的選擇潛力。湘江鰱和長豐鰱的生長性狀均服從正態(tài)分布，測量的所有性狀都具有連續(xù)變異的特點(diǎn)，可進(jìn)行后續(xù)的關(guān)聯(lián)分析。

表3 長豐鰱和湘江鰱各生長性狀統(tǒng)計(jì)

2.2 微衛(wèi)星多態(tài)性標(biāo)記分析

96個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中有13個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)均能在長豐鰱和湘江鰱中穩(wěn)定擴(kuò)增，這13個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)具體分布為：位點(diǎn)P058位于染色體LG1上，P030、P036位于LG2上，P086位于LG5，P034位于LG9上，P021、P062位于LG12上，P056位于LG13上， P037、P043位于LG16上，P054位于LG17上，P041位于LG23上，P020位于LG24上。長豐鰱和湘江鰱兩個(gè)群體的遺傳多樣性信息見表4。長豐鰱共檢測到56個(gè)等位基因，平均k為4.31個(gè)，Ho為0.017～0.683，He為0.049～0.800，PIC范圍為0.048～0.768。湘江鰱群體共檢測到60個(gè)等位基因，平均k為4.62個(gè)，平均Ho為0.050～0.867，平均He為0.126～0.822，PIC為0.177～0.796。

表4 鰱生長性狀有關(guān)的SSR多態(tài)位點(diǎn)信息

2.3 微衛(wèi)星標(biāo)記與鰱生長性狀的相關(guān)性分析

13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)與生長性狀顯著相關(guān)，見表5。對具有關(guān)聯(lián)性的9個(gè)生長性狀進(jìn)行不同位點(diǎn)的均值或多重比較。其中，篩選出湘江鰱8個(gè)與生長性狀顯著相關(guān)的位點(diǎn)(表5)，長豐鰱2個(gè)顯著相關(guān)位點(diǎn)(表6)。

表5 湘江鰱8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)各生長性狀的多重比較

續(xù)表5

表6 長豐鰱2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)各生長性狀的多重比較

2.3.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)與湘江鰱生長性狀的相關(guān)性分析

湘江鰱群體中，位點(diǎn)P020、P056、P062均與框架數(shù)據(jù)X6顯著相關(guān)；位點(diǎn)P041、P062、P086均與框架數(shù)據(jù)X2顯著相關(guān)。位點(diǎn)P021與框架數(shù)據(jù)X8均值顯著相關(guān)。位點(diǎn)P058與軀干長顯著相關(guān)。

對不同基因型的不同性狀進(jìn)行多重比較。位點(diǎn)P020中，150/150基因型個(gè)體各生長性狀均值均高于其他基因型；個(gè)體150/150基因型的框架數(shù)據(jù)X6的均值顯著高于150/153、153/153基因型，而基因型150/153與153/153個(gè)體各生長性狀之間差異不顯著，由此得出150/150基因型是生長性狀的優(yōu)勢基因型。在位點(diǎn)P021中，基因型123/127個(gè)體各生長性狀均值均優(yōu)于其他兩種基因型，框架數(shù)據(jù)X8上123/127基因型個(gè)體顯著高于115/123、123/123基因型。位點(diǎn)P036，共檢測到4種基因型，基因型214/217各生長性狀均值均低于其他基因型，且框架數(shù)據(jù)X7顯著低于211/211、211/214、211/217和217/217基因型，由此證實(shí)214/217基因型是生長性狀的劣勢基因型。位點(diǎn)P041中，基因型219/219個(gè)體各生長性狀均值均低于其他基因型，且框架數(shù)據(jù)X2均值顯著低于其他基因型，該基因型也被證實(shí)為生長性狀的劣勢基因型。在位點(diǎn)P058中共檢測到6種基因型，基因型263/271、267/271個(gè)體的軀干長均值分別為14.189 cm和13.782 cm，顯著高于基因型271/271和271/275，但基因型263/271和基因型267/271的軀干長均值沒有明顯差異。位點(diǎn)P062，283/283基因型個(gè)體的框架數(shù)據(jù)X2、X5和X6顯著高于其他基因型，283/289框架數(shù)據(jù)X5顯著低于基因型277/283、280/289、283/283，X6顯著低于280/289、283/283基因型。位點(diǎn)P086中共檢測到8種基因型，個(gè)體327/327基因型的框架數(shù)據(jù)X1均值顯著高于基因型333/333、333/336/、333/342、336/339、351/351，高于基因型327/333和336/336但無顯著差異，327/327基因型為框架數(shù)據(jù)X1的優(yōu)勢基因型。

2.3.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)與長豐鰱生長性狀的相關(guān)分析

長豐鰱群體中，位點(diǎn)P041與尾柄高顯著相關(guān)，位點(diǎn)P041共檢測到7種基因型，基因型195/219、210/219個(gè)體的尾柄高均值分別為2.978 cm和2.928 cm，均低于基因型219/219、222/222、216/219的個(gè)體，差異顯著，但基因型195/219和210/219之間無明顯差異。個(gè)體222/222基因型的尾柄高均值為3.339 cm，顯著高于基因型219/222、216/216、210/219的個(gè)體，高于其他基因型但無顯著差異。說明基因型222/222為尾柄高的優(yōu)勢基因型，222 bp片段的等位基因與尾柄高呈正相關(guān)。

長豐鰱群體中，位點(diǎn)P086中，檢測到9種基因型，基因型351/351個(gè)體的框架數(shù)據(jù)X5均值為6.080 cm，顯著低于基因型333/339、333/342、336/336、327/327、318/339、333/339、333/336，低于339/339基因型但差異不明顯；基因型351/351為框架數(shù)據(jù)X5的劣勢基因型。

2.4 微衛(wèi)星標(biāo)記在鰱群體的適用性分析

2.4.1 微衛(wèi)星標(biāo)記P041與湘江鰱、長豐鰱生長性狀的相關(guān)分析

P041位點(diǎn)在兩群體中共檢測到8種基因型，湘江鰱和長豐鰱中均檢測到7種基因型，兩群體共有基因型6種，分別是基因型195/291、216/216、216/219、219/219、222/222、219/222。其中，基因型222/222個(gè)體在湘江鰱、長豐鰱中的軀干長均值分別為14.399 cm和13.789 cm，均高于其群體的其他基因型，但無顯著差異，說明222 bp片段的等位基因個(gè)體與軀干長呈正相關(guān)。

2.4.2 微衛(wèi)星標(biāo)記P086與湘江鰱、長豐鰱生長性狀的相關(guān)分析

P086位點(diǎn)在湘江鰱中檢測到8種基因型，在長豐鰱中檢測到9種基因型，其中6種基因型為兩群體共有：327/327、333/333、333/336、333/342、336/336、351/351。湘江鰱中333/333基因型個(gè)體的各生長性狀均值均低于333/342外的其他基因型個(gè)體但無顯著差異；長豐鰱中基因型333/333個(gè)體各生長性狀的均值低于其他基因型，除基因型339/339、351/351外，但無顯著差異，333 bp片段的等位基因與生長性狀呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

3.1 長豐鰱與湘江鰱的遺傳多樣性

遺傳多樣性是物種多樣性的基礎(chǔ)，也是生命適應(yīng)環(huán)境和進(jìn)化的基礎(chǔ)[10]。遺傳雜合度是衡量群體遺傳變異的參數(shù)之一，種群遺傳多樣性越豐富，該物種對環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)[11]。本實(shí)驗(yàn)中篩選得到的13個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，在湘江鰱、長豐鰱中的平均觀測雜合度分別為0.413、0.392;在湘江鰱、長豐鰱中的平均期望雜合度分別為0.467、0.484。兩群體的雜合度都處于中度水平，遺傳多樣性處于中等多態(tài)水平。用于基因變異程度高低的多態(tài)信息含量(PIC)>0.5，則該位點(diǎn)是高度多態(tài)的；0.25

3.2 分子標(biāo)記與性狀之間的關(guān)聯(lián)效果

分子標(biāo)記輔助育種，就是通過與基因連鎖的分子標(biāo)記，直接篩選目標(biāo)區(qū)域的DNA[13]。其可以避免環(huán)境的影響，提高選擇的準(zhǔn)確性，因而廣泛運(yùn)用于許多水產(chǎn)生物的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、性狀關(guān)聯(lián)分析和改良品種的輔助育種等研究。湘江鰱群體中，位點(diǎn)P020、P056、P062均與框架數(shù)據(jù)X6顯著相關(guān)(P<0.05)；位點(diǎn)P041、P062、P086均與框架數(shù)據(jù)X2顯著相關(guān)，這些位點(diǎn)中存在著“多因一效”的現(xiàn)象。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，一個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)也可能與多個(gè)性狀密切相關(guān)，位點(diǎn)P062與湘江鰱的框架數(shù)據(jù)X2、X5、X6顯著相關(guān)；位點(diǎn)P086與湘江鰱的框架數(shù)據(jù)X1、X2和體質(zhì)量顯著相關(guān)，位點(diǎn)中存在著“一因多效”的現(xiàn)象，在對其他一些水產(chǎn)動物群體的遺傳多樣性研究也發(fā)現(xiàn)有類似的現(xiàn)象[14-15]。

近年來，分子標(biāo)記與性狀間的關(guān)聯(lián)分析已經(jīng)成為當(dāng)前水產(chǎn)動物遺傳育種的研究熱點(diǎn)之一。不同位點(diǎn)的基因型與性狀的關(guān)聯(lián)分析，可直接通過對基因型和表型變異程度的差異分析，確定標(biāo)記與數(shù)量性狀之間的相關(guān)性，得到數(shù)量性狀與一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的遺傳相關(guān)，從而篩選出控制數(shù)量性狀的基因型[16]。但是,目前國內(nèi)外文獻(xiàn)有關(guān)鰱群體的研究主要集中在人工繁育和遺傳多樣性[9,17-18],有限的研究報(bào)道了有關(guān)鰱基因組上的QTL分析[19-20]。WANG等[21]對鰱的生長性狀與微衛(wèi)星標(biāo)記的研究，鑒定了20個(gè)生長性狀QTL相關(guān)標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)標(biāo)記ref-16553和ref-46998_8均與體重體長等多個(gè)生長性狀顯著相關(guān)。本研究中標(biāo)記P041在湘江鰱和長豐鰱兩個(gè)群體中均存在222 bp片段的等位基因，且該位點(diǎn)在湘江鰱、長豐鰱中分別與框架數(shù)據(jù)X2、尾柄高有顯著相關(guān)性。同一標(biāo)記在長豐鰱和湘江鰱上關(guān)聯(lián)的生長性狀不同，可能是由于長豐鰱和普通鰱的形態(tài)略有不同[22]，顯著相關(guān)的位點(diǎn)在兩群體中所表現(xiàn)的性狀有所差異。兩群體在標(biāo)記P086上的333/333基因型個(gè)體各生長性狀均值相對于其他基因型普遍偏低，該基因型在鰱群體中可能對生長性狀有負(fù)面影響。由于樣品量有限，本研究得到的結(jié)果尚需大群體樣本的進(jìn)一步驗(yàn)證。這些位點(diǎn)的某些基因型具有顯著的生長優(yōu)勢，這些基因型可在未來的選育工作中有意識的富集[23]，從而用于后續(xù)的分子標(biāo)記輔助育種工作。

在水產(chǎn)生物育種研究中，關(guān)于鰱群體的生長性狀與標(biāo)記輔助育種的基因的連鎖分析報(bào)道很少，本研究獲得的與生長性狀相關(guān)的標(biāo)記能否在湘江鰱和長豐鰱的標(biāo)記輔助選擇實(shí)踐中得到應(yīng)用，仍需進(jìn)一步深入研究與驗(yàn)證，以便達(dá)到其能合理地應(yīng)用該標(biāo)記指導(dǎo)育種實(shí)踐，篩選具有優(yōu)勢生長性狀的良種，提高育種速度，改良物種重要經(jīng)濟(jì)性狀的目標(biāo)。