王玲姝,張宇,李冠男,李孟

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,哈爾濱 150040)

坐骨神經(jīng)損傷是指坐骨神經(jīng)或其分支在外力作用下出現(xiàn)損傷,是一種常見的周圍神經(jīng)損傷(peripheral nerve injury, PNI)病變[1]。因其分布表淺,缺乏骨性結(jié)構(gòu)的保護(hù),在外傷、手術(shù)等因素的影響下容易導(dǎo)致神經(jīng)纖維或軸突擠壓、斷裂,引起運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)或自主神經(jīng)功能障礙,甚至出現(xiàn)神經(jīng)支配的相應(yīng)肌肉發(fā)生萎縮,嚴(yán)重影響患者的日常生活質(zhì)量[2]。與中樞神經(jīng)損傷不同的是,PNI在一定條件下具有較強(qiáng)的再生能力。但是這種再生能力受到內(nèi)在或外周各種因素的制約,其功能恢復(fù)不盡如人意[3]?；疳樧鳛獒樉木裴樦?對(duì)PNI后功能恢復(fù)效果確切[4-5]。有研究[6]表明脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FASN)可參與PNI修復(fù)過(guò)程。近年隨著表觀遺傳研究的不斷深入,越來(lái)越多的研究證實(shí)組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDAC)與帶負(fù)電荷的DNA緊密結(jié)合,可抑制基因的轉(zhuǎn)錄[7]。表觀遺傳修飾在 PNI修復(fù)過(guò)程中起到了重要作用[8]。本實(shí)驗(yàn)選用坐骨神經(jīng)壓榨損傷大鼠模型,深入研究火針對(duì)組蛋白乙酰化修飾的影響,以期為火針治療坐骨神經(jīng)損傷提供有效的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)成年雄性SD大鼠72只,6～8周齡,體質(zhì)量(200±20)g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置均符合 2006年國(guó)家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)規(guī)定。動(dòng)物飼養(yǎng)的環(huán)境溫度為(22±3)℃,濕度為(50±10)%,自然光照,自由進(jìn)食及進(jìn)水(實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必要的禁食禁水要求除外),于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 主要儀器及試劑

賀氏鎢鋼火針(0.35 mm×40 mm),精密電子秤(亞津公司,T410I型),電子天平(上海橫平公司),臺(tái)式冷凍離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司),小型Western電泳儀系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司),凝膠掃描成像系統(tǒng)(Thermo Fisher公司),細(xì)胞超聲破碎機(jī)(新芝生物),Donatello型脫水機(jī)(DIAPATH),JB-P5型包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司),RM2016型組織攤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司),TSY-B型脫色搖床(Servicebio公司);免疫組化試劑盒、DAB顯色劑(Servicebio公司),抗FASN抗體(bsm-51155M)、抗HDAC1抗體(bs-24447R)、抗H3K27ac抗體(bs-7451R)(北京博奧森生物科技有限公司),DNA純化試劑盒、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),微量RNA提取試劑盒(Thermo Fisher公司)。

1.3 動(dòng)物分組及造模

采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和火針組,每組24只。造模前24 h對(duì)大鼠進(jìn)行禁食處理。大鼠稱重后腹腔注射麻醉,右側(cè)后肢備皮,碘伏消毒,沿臀股交界至膝關(guān)節(jié)連線處剪開1.5 cm皮膚,眼科直剪鈍性分離股二頭肌后暴露坐骨神經(jīng),采用止血鉗(20 cm)進(jìn)行鉗夾損傷,鉗夾時(shí)止血鉗卡在第3個(gè)卡扣上造成2～3 mm損傷。每次鉗夾10 s,休息10 s后再次進(jìn)行鉗夾操作,重復(fù)進(jìn)行3次。鉗夾完成后肉眼可見損傷處神經(jīng)呈透明狀,僅有神經(jīng)外膜連接。4-0縫合線逐層縫合肌肉、皮膚,并肌肉注射青霉素鈉以抗感染,術(shù)后24 h禁食。模型組與火針組采取相同方法造模,假手術(shù)組僅暴露坐骨神經(jīng),不作鉗夾處理。形態(tài)學(xué)以大鼠損傷側(cè)下肢出現(xiàn)無(wú)力、拖拽、足趾攣縮、重心轉(zhuǎn)移等為造模成功標(biāo)志[9]。全部模型均由同一人制備,采用同樣制備方法,保持損傷程度一致。

1.4 干預(yù)方法

造模成功24 h后開始進(jìn)行火針治療。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[10]中對(duì)大鼠的穴位定位,穴位取右側(cè)患肢環(huán)跳和委中。環(huán)跳定位于后肢髖關(guān)節(jié)后上緣,委中定位于后肢腘橫紋中線。大鼠采取俯臥位,用鼠套固定四肢及頭部。剪去穴位處被毛,充分暴露患側(cè)后肢以便取穴,同時(shí)在穴位上涂一層薄層萬(wàn)花油。采用0.35 mm×40 mm鎢鋼火針進(jìn)行針刺,手持針柄在乙醇燈內(nèi)火焰將針尖燒至變紅,稍離退火,然后將針尖至外火焰再次加熱后立即刺入大鼠右側(cè)患肢環(huán)跳、委中,刺入深度4～6 mm,留針 30 s后拔針,拔除火針即刻用干棉球按壓針孔2～3 s,間隔60 s后再重復(fù)針刺1次,隔日1次,2周為1個(gè)療程,共治療7次,共14 d。假手術(shù)組、模型組于相同時(shí)間內(nèi)給予抓取固定,但不進(jìn)行火針干預(yù)。

1.5 樣本處理

3組分別于治療前、治療后取材,各取材12只大鼠,取坐骨神經(jīng)損傷處上下各約0.5 cm,共1 cm的損傷段坐骨神經(jīng)進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic functional index, SFI)檢測(cè)[11]

治療后進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。自制大鼠足印行走箱(長(zhǎng)寬高為50 cm×10 cm×15 cm),一側(cè)為鼠籠,另一側(cè)封閉,在箱底部鋪放白紙。將大鼠后足蘸滿墨水后,由封閉端走向鼠籠,每側(cè)足跡以7～8個(gè)為宜。標(biāo)記大鼠右側(cè)患側(cè)足為 E,左側(cè)正常側(cè)足為 N。計(jì)算足印長(zhǎng)度(print length, PL)、足趾寬度(toe spread, TS)、中間足趾距離(inter-toes distance, IT),反復(fù)測(cè)量3次,取平均值。使用Bain公式將以上3個(gè)實(shí)驗(yàn)變量進(jìn)行計(jì)算,計(jì)算出SFI值。坐骨神經(jīng)指數(shù)以SFI＝0為正常,SFI＝-100為神經(jīng)完全損傷。Bain公式為SFI＝-38.3(PLE-PLN)/PLN＋109.5(TSE-TSN)/TSN＋13.3(ITE-ITN)/ITN-8.8。

1.6.2 免疫組化檢測(cè)FASN蛋白表達(dá)

取材后制備石蠟切片,放入二甲苯、梯度乙醇溶液脫蠟至水,PBS溶液洗3次,每次5 min,枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù),血清封閉后,按1:500比例加入一抗、1:10 000加入二抗,DAB顯色、蘇木素復(fù)染細(xì)胞核后脫水封片,顯微鏡下觀察。成像完成后使用 Image-Pro Plus 6.0分析軟件,分別測(cè)量每張切片中3個(gè)視野陽(yáng)性累積光密度值(IOD)及對(duì)應(yīng)組織面積(Area);并計(jì)算出平均光密度＝IOD/Area。

1.6.3 Western blot法檢測(cè)HDAC1蛋白表達(dá)

取材后細(xì)胞裂解法提取細(xì)胞蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,以β-actin作為內(nèi)參,配置SDS-PAGE后進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉后按 1:1 000比例加一抗在 TBST中 3次清洗膜10 min,孵育一抗過(guò)夜,在室內(nèi)下按1:10 000比例二抗孵育,然后顯影。膠片晾干后進(jìn)行掃描,以Image J圖像分析軟件進(jìn)行光密度分析。

1.6.4 染色質(zhì)免疫共沉淀法檢測(cè) FASN啟動(dòng)子區(qū)H3K27乙?；?/p>

組織室溫狀態(tài)下用1%的多聚甲醛固定10 min,冰上進(jìn)行超聲裂解和染色質(zhì)提取,時(shí)間設(shè)置為20 min,將交聯(lián)的 DNA片段剪切為 200～1 000 bp長(zhǎng)度。利用H3K27ac特異性抗體與該蛋白結(jié)合并免疫沉淀該蛋白及DNA復(fù)合物,加入30 μL ProteinA/G Sepharose回收復(fù)合物,加入不含DNase的RNase和蛋白酶K,65 ℃保溫6 h以上,使交聯(lián)逆轉(zhuǎn)。交聯(lián)逆轉(zhuǎn)后用QIAquick DNA純化回收DNA,利用PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)沉淀的DNA樣本。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,比較采用單因素方差分析,不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn),運(yùn)用Kruskal-Wallis法進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)SFI評(píng)分比較

造模成功后,與假手術(shù)組比較,模型組、火針組SFI評(píng)分明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),提示造模成功;治療后,與治療前比較,模型組 SFI評(píng)分升高(P＜0.01),說(shuō)明坐骨神經(jīng)損傷后,周圍神經(jīng)存在一定的自我修復(fù)的能力;與模型組比較,火針組SFI評(píng)分明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),說(shuō)明火針能明顯改善損傷大鼠的神經(jīng)功能指數(shù),促進(jìn)其運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。詳見表1。

表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)SFI評(píng)分比較 (±s,分)

表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)SFI評(píng)分比較 (±s,分)

注:與假手術(shù)組比較 1)P＜0.01;與模型組比較 2)P＜0.01;與同組治療前較3)P＜0.01。

組別 n 治療前 治療后假手術(shù)組 12 -5.75±3.05 -4.25±2.51模型組 12 -88.56±3.121) -66.78±3.201)3)火針組 12 -87.65±3.911) -35.77±4.721)2)3)

2.2 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)FASN蛋白表達(dá)比較

治療前,與假手術(shù)組比較,模型組、火針組 FASN蛋白表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);治療后,與模型組比較,火針組FASN蛋白表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),提示火針能明顯上調(diào)大鼠坐骨神經(jīng)損傷處FASN蛋白表達(dá)。詳見表2和圖1。

表2 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)FASN蛋白表達(dá)比較 (±s)

表2 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)FASN蛋白表達(dá)比較 (±s)

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01。

組別 n 治療前 治療后假手術(shù)組 8 0.0142±0.0017 0.0138±0.0019模型組 8 0.0047±0.00111) 0.0035±0.00081)火針組 8 0.0041±0.00211) 0.0091±0.00131)2)

圖1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)FASN蛋白的表達(dá)比較

2.3 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)HDAC1蛋白表達(dá)比較

治療前,與假手術(shù)組比較,模型組、火針組 HDAC1蛋白表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);治療后,與模型組比較,火針組HDAC1蛋白表達(dá)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),說(shuō)明火針能抑制大鼠坐骨神經(jīng)損傷處HDAC1蛋白表達(dá)。詳見表3和圖2。

表3 3組坐骨神經(jīng)損傷點(diǎn)HDAC1的蛋白表達(dá) (±s)

表3 3組坐骨神經(jīng)損傷點(diǎn)HDAC1的蛋白表達(dá) (±s)

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01。

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圖2 治療后各組坐骨神經(jīng)組織中HDAC1蛋白條帶圖

2.4 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)FASN基因啟動(dòng)子區(qū)H3K27乙酰化水平比較

治療前,與假手術(shù)組比較,模型組、火針組 FASN基因啟動(dòng)子區(qū) H3K27ac豐度值升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);治療后,與模型組比較,火針組 FASN基因啟動(dòng)子區(qū) H3K27ac豐度值明顯上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),說(shuō)明火針能提高大鼠坐骨神經(jīng)損傷處FASN基因啟動(dòng)子區(qū)H3K27ac水平。詳見表4。

表4 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)FASN基因啟動(dòng)子區(qū)H3K27ac水平(±s)

表4 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)FASN基因啟動(dòng)子區(qū)H3K27ac水平(±s)

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01。

組別 n 治療前 治療后假手術(shù)組 4 201.6±36.7 203.5±35.2模型組 4 260.6±27.51) 217.6±33.11)火針組 4 246.1±26.31) 253.6±23.71)2)

3 討論

坐骨神經(jīng)損傷(SNI)后其受損神經(jīng)所支配區(qū)域會(huì)出現(xiàn)肢體疼痛、肌肉萎縮、感覺(jué)消失等癥狀。中醫(yī)學(xué)將此類病癥稱為“冷痹”“風(fēng)濕痹痛”,因此,SNI以疏通經(jīng)絡(luò)、散寒祛濕、調(diào)和陰陽(yáng)為主要治療原則[12]。火針結(jié)合了傳統(tǒng)的針灸和溫?zé)岑煼?兼具“針”和“灸”之力,既有針刺的刺激作用,又具備火的溫?zé)嶙饔?其能“以火之力、焠通經(jīng)絡(luò)、爆動(dòng)氣血”,從而達(dá)到溫?zé)嵬ń?jīng)、暢通氣血、散寒止痛、平衡陰陽(yáng)的作用[13]。本課題組的臨床應(yīng)用及對(duì)已有文獻(xiàn)的回顧均發(fā)現(xiàn)火針對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)有顯著作用[14-15]。在各種穴位的選擇中,環(huán)跳和委中是臨床常用的穴位[16-17]。環(huán)跳位于足少陽(yáng)膽經(jīng),是足少陽(yáng)經(jīng)與足太陽(yáng)經(jīng)交會(huì)穴,古人認(rèn)為環(huán)跳陽(yáng)氣旺盛,針刺可激發(fā)穴位之經(jīng)氣,驅(qū)散寒濕之陰邪;委中為足太陽(yáng)膀胱經(jīng)之合穴,足太陽(yáng)經(jīng)少氣多血,又有“血郄”之稱,久病必瘀,瘀血不去則新血不生,針刺之則疏調(diào)經(jīng)氣,去瘀生新,通而不痛[18-19]。二者均位于坐骨神經(jīng)走行區(qū)域,根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論,既是局部取穴又是循經(jīng)取穴,達(dá)到活血行氣、疏通經(jīng)絡(luò)的作用。本研究結(jié)果顯示,火針干預(yù)14 d后可以明顯改善坐骨神經(jīng)功能指數(shù),且與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明火針能促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

在 PNI后神經(jīng)再生的修復(fù)過(guò)程中,髓鞘和雪旺細(xì)胞(schwann cells, SCs)均起到了重要的作用[20-23]。大量SCs包裹形成髓鞘,組成周圍神經(jīng)軸突。髓鞘具有保護(hù)神經(jīng)元、維護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)功能穩(wěn)定、增強(qiáng)軸突傳導(dǎo)的作用[24-25]。PNI后,損傷部位再生的軸突被SCs重新包裹形成新的髓鞘,髓鞘的形成及其維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性需要大量的脂肪酸[26-27],脂肪酸合成途徑中的關(guān)鍵酶即為FASN,因此FASN是脂肪酸形成髓鞘的一個(gè)潛在的關(guān)鍵過(guò)程,也是維持 SCs內(nèi)在活性必不可少的關(guān)鍵酶[26]。組蛋白乙?；揎椩赟Cs的生長(zhǎng)發(fā)育、維持神經(jīng)系統(tǒng)的完整性以及損傷后的髓鞘再形成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[28-29],HDAC1屬于去乙?；D(zhuǎn)移酶家族中的I類去乙?；D(zhuǎn)移酶,主要作用之一是使組蛋白去乙?；?同時(shí)組蛋白 H3K27為組蛋白乙酰化中最著名的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記之一,其富集在活化基因啟動(dòng)子區(qū)域,與基因表達(dá)具有強(qiáng)烈相關(guān)性[30-32],二者均在組蛋白乙?；揎椀倪^(guò)程中發(fā)生變化。

本研究結(jié)果證實(shí)坐骨神經(jīng)損傷大鼠火針治療后FASN蛋白表達(dá)升高,而HDAC1蛋白表達(dá)降低使FASN基因啟動(dòng)子區(qū)H3K27ac水平升高,說(shuō)明在火針的干預(yù)下,坐骨神經(jīng)損傷大鼠 HDAC1蛋白表達(dá)下降,促進(jìn)了坐骨神經(jīng)損傷大鼠FASN基因啟動(dòng)子區(qū)H3K27乙?；揎?使FASN基因處于轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài),相應(yīng)FASN蛋白表達(dá)水平升高;因此,可以認(rèn)為火針抑制了坐骨神經(jīng)損傷大鼠HDAC1的表達(dá),乙酰化作用于 FASN基因啟動(dòng)子區(qū)的H3K27,進(jìn)而促進(jìn)了組蛋白的乙?；潭?增加了 FASN的轉(zhuǎn)錄,從而影響神經(jīng)功能重塑。