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益氣溫陽(yáng)湯治療慢性免疫性血小板減少癥免疫細(xì)胞調(diào)控機(jī)制及GATA-3通路對(duì)血小板計(jì)數(shù)預(yù)測(cè)價(jià)值研究?

2022-11-22 10:48全日城王子卿許勇鋼楊曉紅胡曉梅張姍姍
關(guān)鍵詞:溫陽(yáng)益氣淋巴細(xì)胞

全日城,王子卿,許勇鋼,楊曉紅,胡曉梅,麻 柔,張姍姍

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院,北京 100091)

轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA-3)發(fā)現(xiàn)于1993年,被認(rèn)為是輔助性T細(xì)胞(helper T cell, Th)2特異性的轉(zhuǎn)錄因子,在Th2淋巴細(xì)胞的分化以及Th2類(lèi)細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮著十分重要的作用。有研究表明,通過(guò)降低GATA-3的表達(dá),可以抑制Th2細(xì)胞因子生成[1]。T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor T-bet, T-bet)作為T(mén)-box家族的一員,可以在一定程度上提高γ干擾素的分泌,作用于CD4+T細(xì)胞向Th1型細(xì)胞分化的過(guò)程[2]。Th2型細(xì)胞的分化也可以被T-bet所抑制,有研究將Th2型細(xì)胞中導(dǎo)入T-bet基因,發(fā)現(xiàn)即使是Th2型的培養(yǎng)環(huán)境中,其仍可逆轉(zhuǎn)為T(mén)h1型細(xì)胞[3]。Olsson B等[4]在活動(dòng)期免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP)患者中發(fā)現(xiàn),某些T細(xì)胞表達(dá)水平上調(diào),其中與Th1優(yōu)勢(shì)有關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)顯著升高,提示活動(dòng)期ITP可存在Th1細(xì)胞因子活化,在疾病緩解時(shí),細(xì)胞因子更傾向于Th2優(yōu)勢(shì)模式。

叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子Foxp3(forkhead/winged helix transcription factor Foxp3)可調(diào)控CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell, Treg)的分化發(fā)育[5]。自身反應(yīng)性T細(xì)胞、B細(xì)胞的活化與增殖以及免疫球蛋白的生成均可被該類(lèi)細(xì)胞所抑制[6,7]。因此Foxp3在自身免疫性疾病的調(diào)控方面有重要作用。Foxp3基因可以提高慢性免疫性血小板減少癥(chronic ITP, CITP)患者外周血中CD4+CD25+Treg細(xì)胞的數(shù)量,維持患者機(jī)體平衡的免疫狀態(tài)。前期研究證實(shí),益氣溫陽(yáng)法可降低總T細(xì)胞、CD3DR+活化T細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞(natural killer T cell, NKT)比值,升高CD19+CD5+/CD19+比值、CD4+CD25+Treg細(xì)胞和Th2細(xì)胞,參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受,在改善外周血小板水平方面起到一定的作用[8]。本研究以此為基礎(chǔ),利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)GATA-3、Foxp3、T-bet表達(dá)水平,進(jìn)一步探討益氣溫陽(yáng)湯基于轉(zhuǎn)錄因子通路的效應(yīng)機(jī)制及CITP可能的治療靶點(diǎn)。本研究通過(guò)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)2015XLA108-2)。

1 資料

1.1 一般資料

選擇2014年6月至2017年10月間中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院門(mén)診符合入組條件的28例病例作為治療組,其中男性12例,女性16例,平均年齡(35.82±17.70)歲,年齡區(qū)間15~75歲。另選擇20名健康醫(yī)務(wù)工作者作為健康對(duì)照組,其中男:女=1∶1,年齡分布25~70歲,平均年齡(34.45±15.42)歲。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)(2016年版)》[9]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合CITP的診斷標(biāo)準(zhǔn)且病程>12個(gè)月;間隔1周左右連續(xù)2次平均血小板計(jì)數(shù)<50×109/L,且潑尼松服用量≤10 mg;符合中醫(yī)脾腎兩虛證辨證分型;年齡在10~75歲之間;未參加其他臨床研究,患者知情同意。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

繼發(fā)性血小板減少性紫癜,如骨髓增生異常綜合征,藥物性、各種自身免疫性疾病及脾亢等所致血小板減少;合并心、腦、肝、腎嚴(yán)重性疾病或精神病患者;妊娠及哺乳期婦女。

2 方法

2.1 治療方法

治療組給予益氣溫陽(yáng)湯。益氣溫陽(yáng)湯組成:太子參30 g,炒白術(shù)10 g,茯苓20 g,炙甘草10 g,白芍10 g,桂枝10 g,淫羊藿15 g,鎖陽(yáng)20 g,川萆薢20 g,補(bǔ)骨脂15 g,巴戟天15 g,生姜10 g,大棗30 g,具有健脾益氣、溫腎助陽(yáng)功效。治療組每日1劑,早晚2次分服,連續(xù)服用4個(gè)月。健康對(duì)照組不給予藥物治療。

2.2 觀(guān)察項(xiàng)目及方法

2.2.1 臨床療效觀(guān)察 治療組第1、2、4個(gè)月分別記錄血小板計(jì)數(shù)。后期跟蹤觀(guān)察6個(gè)月監(jiān)測(cè)病情,評(píng)價(jià)藥物長(zhǎng)期效果療效。依據(jù)《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)(2016年版)》[9]制定ITP的療效標(biāo)準(zhǔn)。完全反應(yīng):治療后血小板≥100×109/L且未出血;有效:治療后血小板≥30×109/L并且至少比基礎(chǔ)血小板計(jì)數(shù)增加2倍且未出血;無(wú)效:治療后血小板<30×109/L或者血小板計(jì)數(shù)增加不到基礎(chǔ)值的2倍或者有出血;復(fù)發(fā):治療有效后血小板計(jì)數(shù)降至30×109/L以下或者不到基礎(chǔ)值的2倍或者出現(xiàn)出血癥狀[7]。

2.2.2 外周血T、B淋巴細(xì)胞亞群及Th1、Th2檢測(cè) 清晨空腹?fàn)顟B(tài)下,用EDTA-K2/K3真空采血管采集靜脈血2 mL,新鮮樣本6 h內(nèi)進(jìn)行處理,分別加入相應(yīng)的單克隆抗體10 μL和抗凝血100 μL,加入Optilyse溶血素,低速渦流混勻,離心棄上清,殘留在管底的液體約50 μL;取200 μl樣本,加入CD4+單抗3uL,離心、固定、透膜,加入10 μl Anti-Hu-IFN-γ-FITC/Anti-Hu-IL-4-PE/CD4-PC5,室溫暗處孵育30 min,采用美國(guó)BECKMAN COULTER公司EPICS ELITE型流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)指標(biāo)為CD3+總T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)、自然殺傷T細(xì)胞(natural killer T cell, NKT)、CD3+DR+活化T細(xì)胞、CD5+B淋巴細(xì)胞比值、Treg細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞。

2.2.3 外周血T-bet、GATA-3、Foxp3 mRNA表達(dá) 使用Rotor-Gene3000熒光定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)治療組及對(duì)照組治療前后GATA-3、T-bet和Foxp3 mRNA的表達(dá)水平,評(píng)價(jià)3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子間相關(guān)性及與外周血PLT之間的關(guān)系。引物及探針設(shè)計(jì):所檢測(cè)基因的序列均獲取于美國(guó)生物技術(shù)信息中心(網(wǎng)址:http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù),引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。GATA-3上游引物:5′-AGGGAGTGTGTG-AACTGTGGG-3′,下游引物:5′-CTTCGCTTGGG-CTTAATGAGG-3′,137 bp;T-bet上游引物:5′-GCTGGAGAAAAGAAGACAAGAAAG-3′,下游引物:5′-AAGAAAAAACACACACCCACACAC-3′,249 bp;Foxp3 上游引物:5′-TCCCAGAGTTCCTCCACAAC-3′,下游引物:5′-ATTGACTGTCCGCTGCTTCT-3′;β-actin上游引物:5′-GAACGGTGAAGGTGACAGCAGT-3′,下游引物: 5′-TCTCAAGTTGGGGGACAAAAAG-3′,262 bp。擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物采用溶解曲線(xiàn)和Relative Quantification Software 1.0軟件進(jìn)行分析,相對(duì)表達(dá)量由轉(zhuǎn)錄因子和β-actin的基因拷貝數(shù)比值來(lái)表示。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),組間差異先用Levene’s test行方差齊性檢驗(yàn),再行獨(dú)立樣本或配對(duì)樣本t檢驗(yàn);雙變量相關(guān)分析對(duì)轉(zhuǎn)錄因子間相關(guān)性進(jìn)行分析,Logistic多元逐步回歸分析法對(duì)血小板相關(guān)預(yù)測(cè)因素進(jìn)行分析。脫落病例不計(jì)入統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 臨床療效

臨床療效的觀(guān)察共納入32例患者,其中3例中途停用中藥,1例因妊娠停用中藥,脫落病例共4例,實(shí)際完成28例。脫落患者因資料不全未計(jì)入統(tǒng)計(jì)分析。治療組患者服用益氣溫陽(yáng)方,療程為4個(gè)月,后期跟蹤隨訪(fǎng)6個(gè)月。治療組總28例中,完全反應(yīng)者有4例(14.29%),有效8例(28.57%),無(wú)效16例(57.14%),總有效率42.86%。與治療前平均血小板計(jì)數(shù)(23.02±13.69)比較,治療組治療后平均血小板計(jì)數(shù)(46.18±50.47)明顯升高(t=-2.585,P=0.015)。后期觀(guān)察6個(gè)月,完全反應(yīng)病例中有1例在4個(gè)月后血小板降至80×109/L,余病例病情穩(wěn)定。全部病例在觀(guān)察期間未出現(xiàn)明顯不適及不良反應(yīng)。

3.2 2組外周血T、B淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平

對(duì)28例入組患者進(jìn)行T、B細(xì)胞亞群檢測(cè),其中3例治療后數(shù)據(jù)脫落,數(shù)據(jù)完整可供分析病例25例。與健康對(duì)照組比較,治療組治療前CD3+總T細(xì)胞、CTL細(xì)胞、NKT細(xì)胞、CD3+DR+活化T細(xì)胞顯著增高,但CD5+B淋巴細(xì)胞比值、Treg細(xì)胞顯著降低(P<0.05,P<0.01)。治療組與治療前比較,治療后CD3+總T細(xì)胞、CTL細(xì)胞、NKT細(xì)胞顯著性下降(P<0.05),CD5+淋巴細(xì)胞比值、Treg、Th2細(xì)胞水平升高(P<0.05,P<0.01),CD3+DR+活化T細(xì)胞、Th1細(xì)胞水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1圖1、2)。

注:A.治療前,CD5+B淋巴細(xì)胞:E2+E4;B.治療后,CD5+B淋巴細(xì)胞:B2+B4

注:A.治療前,Treg細(xì)胞:E4;B.治療后,Treg細(xì)胞:D4

3.3 2組外周血T-bet、GATA-3、Foxp3 mRNA表達(dá)水平比較

與健康對(duì)照組比較,治療組治療前GATA-3 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),T-bet及Foxp3mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療組與治療前比較,治療后GATA-3 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。治療組治療后Foxp3 mRNA表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照組(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 2組外周血T-bet、GATA-3、Foxp3 mRNA表達(dá)水平比較

3.4 CITP患者T-bet、GATA-3、Foxp3水平相關(guān)性分析

治療組治療前T-bet與GATA-3呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),但相關(guān)性不甚密切(相關(guān)系數(shù)<0.5),與Foxp3呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.01,相關(guān)系數(shù)>0.5),治療后Foxp3與GATA-3之間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),相關(guān)系數(shù)為0.427(見(jiàn)表3)。

表3 慢性免疫性血小板減少癥患者T-bet、GATA-3、Foxp3水平相關(guān)性比較

3.5 血小板計(jì)數(shù)預(yù)測(cè)因素的Logistic分析

將CITP患者治療前后各項(xiàng)T、B淋巴細(xì)胞亞群數(shù)值與T-bet、GATA-3、Foxp3表達(dá)水平納入血小板計(jì)數(shù)的Logistic回歸模型,結(jié)果顯示僅治療后GATA-3的表達(dá)量與血小板水平呈負(fù)相關(guān)(P=0.032),得出方程式:血小板=90.299-64.086×(GATA-3)(見(jiàn)表4圖3)。

表4 血小板計(jì)數(shù)預(yù)測(cè)因素的Logistic回歸模型

圖3 治療后GATA-3與血小板水平方程式圖

4 討論

多種免疫分子參與Th0向Th1/Th2分化以及白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-4/γ-干擾素(interferon γ, IFN-γ)的分泌,其中,GATA-3和T-bet可以促進(jìn)Th2和Th1型細(xì)胞因子的分泌,分別誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th2和Th1細(xì)胞分化,是這一過(guò)程的關(guān)鍵分子。GATA-3能夠誘導(dǎo)不成熟的CD4+T細(xì)胞向Th2類(lèi)分化,其機(jī)制主要為IL-5啟動(dòng)子對(duì)GATA-3較敏感,可以被GATA-3強(qiáng)烈刺激而激活,但GATA-3對(duì)IL-4啟動(dòng)子的刺激較弱,將這一啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染Th1類(lèi)細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞后,能夠直接上調(diào)Th2類(lèi)細(xì)胞因子的表達(dá);Th2型基因位點(diǎn)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)可以被GATA-3更改,異位表達(dá)GATA-3可以誘導(dǎo)IL-4及IL-5的表達(dá),并能以信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription, STAT)6、IL-4非依賴(lài)性的形式誘導(dǎo)內(nèi)源性GATA-3的生成,以此成為T(mén)h2定向分化的正反饋途徑;GATA-3可以激活I(lǐng)L-4周?chē)鷰讉€(gè)區(qū)域的增強(qiáng)子[10]。

前期研究證明,益氣溫陽(yáng)方治療CITP臨床療效確切,顯著提升患者外周血小板計(jì)數(shù),遠(yuǎn)期療效穩(wěn)定可靠,明顯提高患者生活質(zhì)量[11]。筆者認(rèn)為,ITP急性期以“火盛”為特點(diǎn),慢性期以“氣傷”為特點(diǎn)[12]。慢性期所謂氣傷即氣虛之意,氣虛則氣血生化不足、統(tǒng)攝無(wú)權(quán),致使血溢脈外。脾、腎分別為先后天之本,后天氣血、元陰、元陽(yáng)均由此化生。麻柔[8]認(rèn)為,CITP“氣傷”具體表現(xiàn)為脾腎兩虛和肺脾氣虛。益氣溫陽(yáng)湯方中有太子參、茯苓、炒白術(shù)、炙甘草、白芍、桂枝、淫羊藿、鎖陽(yáng)、川萆薢、生姜、大棗,具有健脾益氣、益火補(bǔ)土功效。方中太子參、茯苓、炒白術(shù)、炙甘草取自四君子湯,意在健脾益氣、固氣虛之本;鎖陽(yáng)、淫羊藿益火補(bǔ)土,益腎助陽(yáng);桂枝湯既調(diào)和營(yíng)衛(wèi)又顧護(hù)肺衛(wèi),有助于抵御外感邪熱。

此次淋巴細(xì)胞亞群研究提示,CITP患者機(jī)體中存在免疫紊亂,表現(xiàn)為T(mén)reg細(xì)胞和CD19+CD5+B淋巴細(xì)胞比例下調(diào)及功能缺陷,以及總T細(xì)胞、CTL細(xì)胞、NKT細(xì)胞、CD3+DR+活化T細(xì)胞功能亢進(jìn)是其致病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。研究提示,益氣溫陽(yáng)湯通過(guò)顯著降低總T細(xì)胞、CTL細(xì)胞、NKT細(xì)胞水平,升高CD5+淋巴細(xì)胞比值、Treg細(xì)胞和Th2細(xì)胞水平,起到免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受作用,有助于改善外周血小板水平。

治療前T-bet與Foxp3呈明顯負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.577;治療后Foxp3與GATA-3之間呈正相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.427,提示在CITP慢性期,F(xiàn)oxp3的高水平轉(zhuǎn)錄抑制T-bet的表達(dá),GATA-3反饋性高表達(dá)也會(huì)使T-bet轉(zhuǎn)錄受抑,這一結(jié)果符合CITP中各轉(zhuǎn)錄因子的功能。經(jīng)過(guò)益氣溫陽(yáng)湯治療后有效的患者,緩解期Foxp3和GATA-3表達(dá)均降低,表明Treg細(xì)胞功能得到恢復(fù)和增強(qiáng),可以通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制降低Foxp3和GATA-3表達(dá)水平。

本研究治療前GATA-3 mRNA表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組,說(shuō)明GATA-3高表達(dá)是ITP致病機(jī)制中的重要一環(huán)。經(jīng)過(guò)益氣溫陽(yáng)湯治療后的GATA-3 mRNA顯著下降也證明這一點(diǎn)。其理論依據(jù)筆者假設(shè),隨著PLT上升及Treg調(diào)節(jié)細(xì)胞功能增強(qiáng),機(jī)體通過(guò)Th2優(yōu)勢(shì)來(lái)調(diào)整免疫耐受的需求下降,GATA-3 mRNA表達(dá)量也隨之下降。此次通過(guò)益氣溫陽(yáng)湯治療CITP研究,證明益氣溫陽(yáng)湯通過(guò)GATA-3和Foxp3通路的調(diào)控發(fā)揮了提升血小板的作用。

綜上所述,復(fù)雜的ITP免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中GATA-3通路具有重要作用。以往研究表明,活化的Treg調(diào)節(jié)細(xì)胞可以抑制Th1和Th2細(xì)胞的活化與增殖,提示Treg處于Th1/Th2網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的上游[13]。本研究提出假說(shuō),ITP疾病進(jìn)展期機(jī)體處于免疫過(guò)激狀態(tài),此時(shí)Foxp3轉(zhuǎn)錄未能有效啟動(dòng)或未能及時(shí)上調(diào)是ITP發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著血小板數(shù)量持續(xù)低水平,機(jī)體設(shè)法通過(guò)另外的免疫耐受通路,即通過(guò)高表達(dá)GATA-3表達(dá)水平,能夠使Th平衡向Th2優(yōu)勢(shì)漂移,從而實(shí)現(xiàn)免疫耐受,促進(jìn)病情緩解。

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