白美玲，劉星亮，焦 宏△

(1.河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075000)

芹菜有水芹、旱芹兩種，功能相近。中醫(yī)認(rèn)為藥用以旱芹為佳，又稱藥芹。旱芹得青陽之氣而生，氣味辛竄，能理胃中濕濁。旱芹氣味甘寒，能除心下煩熱?；蛴械糜陉枤庵?，故味苦而多濕；得于陽氣之濃，故味多辛而燥[1]。芹菜中分離純化的活性成分以芹菜素為高[2]。芹菜素(Apigenin)又名芹黃素，是一種可以從多種中草藥和食物中提取的黃酮類化合物。有研究表明，芹菜素在抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥等方面療效顯著[3]。近年來，芹菜素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)功效受到學(xué)者們的關(guān)注[4]。

一氧化碳(carbon monoxide, CO)中毒是較為常見的中毒事件，由于CO占據(jù)氧氣與血紅蛋白結(jié)合位點(diǎn)，間接引起人體缺氧而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多器官受損，出現(xiàn)嗜睡、昏迷、神經(jīng)官能癥等神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀和體征[5，6]，而CO中毒引發(fā)的缺血缺氧又可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族蛋白與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過建立體外CO中毒的神經(jīng)元模型，以實(shí)驗(yàn)常用的神經(jīng)元模型[7]，即大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞為靶點(diǎn)，通過外源性一氧化碳釋放分子(carbon monoxide releasing molecules, CORM-2)對(duì)PC12細(xì)胞作用，檢測(cè)芹菜素對(duì)CO中毒后神經(jīng)元凋亡情況及相關(guān)凋亡蛋白Caspase-3、BCL2-Associated X的蛋白質(zhì)(BCL2-Associated X, Bax)和Bcl-2含量，探討芹菜素對(duì)CO引起的細(xì)胞凋亡的影響，為臨床CO中毒患者的治療和預(yù)后康復(fù)提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞(高分化型)由我校藥學(xué)系老師惠贈(zèng)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫(kù)。CORM-2(美國(guó)Sigma公司288144-500 MG)；芹菜素(陜西慧科植物開發(fā)有限公司，CAS：520-36-5)；兔抗鼠Caspase-3單克隆抗體(sc-56051)、Bax單克隆抗體(sc-7480)和Bcl-2單克隆抗體(sc-7382)，美國(guó)Santa Cruz公司；細(xì)胞早期凋亡檢測(cè)試劑盒(559763)，美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與模型建立

PC12細(xì)胞中加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2孵育箱進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞覆蓋率達(dá)90%左右時(shí)，常規(guī)胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

收集PC12細(xì)胞后計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度，以2.5×104個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔100 μL，每組設(shè)平行復(fù)孔6個(gè)。分別以50 μM、100 μM和200 μM的CORM-2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞2 h和4 h，建立外源性CO中毒神經(jīng)元模型。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率和細(xì)胞分組

選擇490 nm波長(zhǎng)，在全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔的吸光度(optical density, OD)值。通過下列公式計(jì)算各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：生長(zhǎng)抑制率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-對(duì)照組OD值)/對(duì)照組OD值×100﹪。MTT實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞活性和半數(shù)致死量來確定CORM-2最佳誘導(dǎo)濃度并確定分組。本次實(shí)驗(yàn)分為Control組(常規(guī)培養(yǎng)PC12細(xì)胞)、CORM-2組(最佳誘導(dǎo)濃度)、低劑量芹菜素干預(yù)組(CORM-2+5 μM芹菜素)和高劑量芹菜素干預(yù)組(CORM-2+20 μM高濃度芹菜素)4組。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集4 h作用的各組細(xì)胞1×106個(gè)，離心后棄去培養(yǎng)基，采用1 mL PBS緩沖液洗滌2遍，按照試劑盒說明依次向每組細(xì)胞中分別加入185 μL緩沖液，5 μL Annexin V及10 μL 碘化丙啶(propidium iodide, PI)，混勻避光20 min。離心并棄去上清液，再加入1 mL PBS洗滌1次。1 mL PBS緩沖液懸起細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡情況。

1.5 Western blot檢測(cè)凋亡蛋白含量

各組加入蛋白裂解液提取總蛋白，用Bio-Rad蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉分別加入兔抗鼠Caspase-3單克隆抗體(稀釋度為1∶1000)、Bax單克隆抗體(稀釋度為1∶1000)和Bcl-2單克隆抗體(稀釋度為1∶1000)，4 ℃過夜。清洗后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，加 3,3-N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride(DAB)顯色。顯影后照相，圖像分析軟件Image J進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組資料統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外PC12細(xì)胞CO中毒模型的建立與最佳作用濃度篩選

PC12細(xì)胞分別于2 h和4 h經(jīng)50、100和200 μM濃度的CORM-2誘導(dǎo)后，利用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性。圖1示，相同誘導(dǎo)時(shí)間下細(xì)胞活力隨CORM-2濃度的增高而逐漸下降，確定100 μM CORM-2誘導(dǎo)4 h為CO中毒細(xì)胞模型最佳作用濃度和最佳作用時(shí)間，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)CORM-2組。

圖1 MTT法檢測(cè)CORM-2誘導(dǎo)下PC12的細(xì)胞活性率

2.2 各組PC12細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC和PI雙染檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率。Control組細(xì)胞凋亡率為2.21%，CORM-2誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡率急劇上升至29.49%；加入5 μM芹菜素干預(yù)后，細(xì)胞凋亡率下降至8.28%，與CORM-2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，以上結(jié)果說明，芹菜素能有效抑制CORM-2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

2.3 各組PC12細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)

圖3示，CORM-2組Caspase-3表達(dá)明顯高于Control組(P<0.05)，低劑量芹菜素干預(yù)組和高劑量芹菜素干預(yù)組Caspase-3表達(dá)均明顯低于CORM-2組(P<0.05)。Control組Bax表達(dá)水平顯著低于CORM-2組(P<0.05)，低劑量芹菜素干預(yù)組的Bax表達(dá)明顯低于CORM-2組(P<0.05)。CORM-2組Bcl-2表達(dá)明顯高于Control組(P<0.05)，低劑量芹菜素干預(yù)組和高劑量芹菜素干預(yù)組Bcl-2表達(dá)水平均顯著高于CORM-2組(P<0.05)。結(jié)果表明，芹菜素可以通過下調(diào)Caspase-3及Bax，上調(diào)Bcl的表達(dá)，減緩PC12的細(xì)胞凋亡過程。

注：L-Api為低濃度芹菜素干預(yù)組, H-Api為高濃度芹菜素干預(yù)組

注：C表示Control組，L-Api為低濃度芹菜素干預(yù)組，H-Api組為高濃度芹菜素干預(yù)

3 討論

腦組織尤其神經(jīng)元對(duì)缺血缺氧最不耐受[8]，其次是膠質(zhì)細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞耐受力最佳[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，CO中毒死亡者尸檢結(jié)果中，大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元有不同程度凋亡[10]，表明CO中毒所致的嗜睡、昏迷等臨床表現(xiàn)與神經(jīng)元的凋亡可能有很大的相關(guān)性。而CO中毒所引發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷表現(xiàn)出的臨床癥狀屬于中醫(yī)學(xué)“頭痛”“健忘”“癡呆”等范疇。有學(xué)者根據(jù)中醫(yī)辨病辨證方法，將CO中毒的機(jī)理病因病機(jī)和相應(yīng)臨床癥狀解釋為CO穢濁毒氣由肺而入，毒邪入內(nèi)耗散正氣，毒邪生熱化痰，痰瘀互結(jié)，上蒙清竅，氣滯血瘀，痰濁阻滯，竅絡(luò)閉阻[11]。

臨床對(duì)于CO中毒患者以高壓氧治療為主，但起效較慢[12]。學(xué)者們正在探究用安全高效的中草藥或某些植物的活性成分進(jìn)行輔助治療，以減緩神經(jīng)元凋亡，增強(qiáng)高壓氧療效，減輕患者中毒癥狀，提升患者的生活質(zhì)量。

芹菜作為一種藥食同源的原料，性涼、味甘辛且無毒，入肺、胃、肝經(jīng)，可清熱利濕、平肝健胃、除煩消腫、涼血止血、解毒宣肺、健腦鎮(zhèn)靜?！侗静菥V目》云：“旱芹，其性滑利?！薄缎l(wèi)生通訊》載芹菜“清胃滌熱，通利血脈，利口齒潤(rùn)喉，明目通鼻，醒腦健胃，潤(rùn)肺止咳”?！侗静萃脐悺份d芹菜“治肝陽頭痛，面紅目赤，頭重腳輕，步行飄搖等癥”[13]。芹菜中以活性成分芹菜素含量為高，芹菜素分子式為C15H10O6，相對(duì)分子量270屬于4’,5,7-三羥基黃酮，是一種藥食同源的活性化合物，廣泛存在于芹菜、毛葉藜蘆等植物以及日常多種豆類、茶葉等食物中[14]。有研究顯示，芹菜素具有降血壓、抗癌、降血脂、保護(hù)神經(jīng)元等活性作用，其用藥安全性高[15]。

近年來學(xué)者們通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)，芹菜素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病、失眠及抑郁等神經(jīng)官能癥均有一定的治療效果[16，17]。有報(bào)道，芹菜素可通過血腦屏障進(jìn)入腦組織中，發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡作用，通過減緩氧化應(yīng)激反應(yīng)，在一定程度上恢復(fù)或改善大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能的缺失，減輕神經(jīng)元凋亡，有效保護(hù)神經(jīng)元活力[18]。在一項(xiàng)阿爾茨海默病的臨床研究中[19]，通過對(duì)患者進(jìn)行兩年的觀察和隨訪后發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期服用芹菜素復(fù)方制劑的患者認(rèn)知評(píng)分明顯高于未服用者，說明芹菜素在一定程度上能有效改善阿爾茨海默病患者的臨床癥狀，促進(jìn)患者康復(fù)。此外也有臨床報(bào)道證實(shí)，芹菜素在改善失眠、調(diào)節(jié)人體生物節(jié)律等方面有重要功效[20]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，芹菜素對(duì)神經(jīng)元損傷有治療效果，其機(jī)制與芹菜素調(diào)控氧化應(yīng)激和促凋亡方面有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，服用芹菜素在抗抑郁及改善小鼠認(rèn)知能力等方面有顯著作用[21]。此外，芹菜素在帕金森病轉(zhuǎn)基因果蠅模型中，也表現(xiàn)出抑制氧化應(yīng)激、減緩細(xì)胞凋亡的作用[22]。通過阻斷Ca2+的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，減少促凋亡蛋白caspase-3和caspase-7的釋放，可抑制神經(jīng)元凋亡，保護(hù)神經(jīng)元的活性和穩(wěn)定性[23]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，芹菜素能有效降低CORM-2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡率,提示芹菜素可通過對(duì)減緩抗神經(jīng)元凋亡來降低CO對(duì)神經(jīng)元造成的損傷。細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡的過程，是由一些病理因素刺激細(xì)胞引發(fā)凋亡通路的激活、表達(dá)和調(diào)控的一系列生化反應(yīng)。大多數(shù)凋亡的啟動(dòng)、激活與調(diào)控都與Bcl-2家族和Caspase家族有關(guān)[24]。Caspase家族可以通過細(xì)胞內(nèi)通路(線粒體途徑)、細(xì)胞外通路(細(xì)胞膜途徑)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路等激活細(xì)胞凋亡[25]。有研究顯示，Caspase的激活是包括一系列生化反應(yīng)，凋亡的啟動(dòng)因子與信號(hào)蛋白結(jié)合后激活引起線粒體功能障礙，導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體釋放入細(xì)胞胞漿并與胞漿中的凋亡蛋白酶激活因子1聚合成為復(fù)合體，這種多聚復(fù)合物激活Caspase-9引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而激活Caspase-3引起染色體斷裂，引起細(xì)胞凋亡[26]。Bcl-2家族中包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩部分?？沟蛲龅鞍兹鏐cl-2通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位阻斷細(xì)胞色素C的釋放，并阻止凋亡誘導(dǎo)因子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。而Bax蛋白發(fā)揮促凋亡活性，可促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，故認(rèn)為Bcl-2通過抑制細(xì)胞色素C的釋放，以阻止Caspase-3的激活[27]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與CORM-2組比較，芹菜素能夠降低CORM-2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，其作用效果與芹菜素的濃度呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，芹菜素可以通過有效抑制促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，以減輕CO中毒導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡，具有潛在的保護(hù)神經(jīng)元作用。