錢 夢(mèng)，朱巳旲，史 拓，李文飛，謝 鳴

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

“脾主肌肉”是中醫(yī)脾臟重要的生理功能之一。脾虛肌無力是指脾虛無力運(yùn)化、肌肉失于充養(yǎng)導(dǎo)致四肢無力、肌肉功能與質(zhì)量出現(xiàn)明顯的降低與損傷。脾虛肌萎(肌無力)動(dòng)物模型的成功復(fù)制對(duì)于探查中醫(yī)脾主肌肉的現(xiàn)代內(nèi)涵及相關(guān)方藥的作用機(jī)制具有重要意義。

目前有關(guān)中醫(yī)脾虛涉及肌無力動(dòng)物模型的制作方法主要有苦寒瀉下法[1]、過勞+睡眠剝奪法[2]、過勞+飲食不節(jié)法[3，4]以及苦寒瀉下+過勞+飲食失節(jié)法[5]4種，其中小鼠模型的復(fù)制見有采用苦寒瀉下法[6]與過勞+睡眠剝奪法[2]的報(bào)道。2種方法誘導(dǎo)的模型小鼠均不同程度地表現(xiàn)出體質(zhì)量降低、大便失調(diào)等脾虛癥狀，并伴有比目魚肌收縮張力、濕重以及肌纖維橫截面面積降低。從中醫(yī)病因或發(fā)病學(xué)的角度來看，苦寒瀉下法雖可致苦寒傷脾，但過量苦寒方藥可以導(dǎo)致脾陽不足甚則引起毒性損傷；而過勞與睡眠剝奪法雖涉及過勞傷脾，也會(huì)傷及心神以致心脾兩虛。同時(shí)，由于對(duì)2種模型復(fù)制過程中動(dòng)物的系統(tǒng)變化未進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，其作為中醫(yī)脾虛肌萎證的動(dòng)物模型尚待評(píng)價(jià)。

本團(tuán)隊(duì)曾采用“飲食失節(jié)+過度疲勞”法成功復(fù)制出脾虛肌無力大鼠模型，并對(duì)該模型進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究[4,7]?？紤]到大鼠和小鼠的生物類近性和不同研究對(duì)模型動(dòng)物種類的差異需求。本次擬探索該法建立脾虛肌萎證小鼠模型的可行性，以豐富中醫(yī)脾虛肌萎證動(dòng)物模型的類型，為探討中醫(yī)脾主肌肉的病理生理學(xué)內(nèi)涵、評(píng)價(jià)相關(guān)方藥的治療效應(yīng)及其作用機(jī)制，提供更多可供選擇的模型工具。本研究通過北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，批號(hào)BUCM-4-2021030401-1018。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雄性SPF級(jí)昆明小鼠60只，體質(zhì)量(22±2)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2020-0033。所有動(dòng)物提前1周購入，于動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件光照節(jié)律12 L∶12 D(6∶00-18∶00)，室溫20 ℃～25 ℃，以相對(duì)濕度(50±5)%。

1.2 試劑、儀器及設(shè)備

小鼠胃動(dòng)素(motilin，MTL)、胃泌素(gastrin，GAS、)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒、D-木糖測(cè)定試劑盒(北京瑞格博生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為20210804.60243 M，20210804.60206 M，20210804.60416 M，20210804.60080 M，20210804.60013 M，20210804.60023 M，20210805.40029)；D-木糖(北京sigma公司，貨號(hào)x3877-25 g)；無水乙醇、二甲苯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)64-17-5、1330-20-7)；HE染色試劑盒、中性樹膠封片劑(北京索萊寶(Solarbio)科技有限公司，貨號(hào)G1121、G8590)。

塑料鋼化桶(桶口徑50 cm、桶高60 cm，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)Q/WHC02-2002)，溫嶺大溪宏程塑料制品廠；YLS-13A型握力儀(貨號(hào)008070020)，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司；TB-718c型生物組織包埋機(jī)，湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司；Leica RM2235組織切片機(jī)、Leica HI1220烤片機(jī)、Leica ST5020全自動(dòng)組織脫水機(jī)，徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司。

2 方法

2.1 分組、造模與取材

適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，全部動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行負(fù)重預(yù)游泳(分別負(fù)重體質(zhì)量的5%、6%、7%)，選擇合適的負(fù)重條件，將所有小鼠隨機(jī)分為正常組與模型組各30只。模型組小鼠采用“飲食失節(jié)+過度疲勞”法[7]建立脾虛肌萎證小鼠模型：隔日喂食(隔日禁食，隔日足量給食)；每日上午8∶30將小鼠尾部1/3～2/3處貼綁一定重量的鉛皮，緩慢將其置于盛有溫水(水溫25 ℃，水深22 cm)的塑料鋼化桶中進(jìn)行負(fù)重游泳至力竭，記錄其入水至力竭的時(shí)間。力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)[8]為：小鼠頭部沉入水底超過3 s不能回到水面和/或頭部連續(xù)沉入水面3次；迅速撈起小鼠，吹干毛發(fā)，連續(xù)28 d。分別于造模的第14天、第28天禁食不禁水16 h，第15天、第29天給各組小鼠灌服3%D-木糖溶液(1 mL/kg)，1 h后眼球取血、脫脊椎處死小鼠，于冰上迅速取出胸腺、脾臟與腓腸肌。

2.2 一般情況觀察

2.2.1 一般外觀行為學(xué) 于實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的每周三和周日觀測(cè)并記錄各組小鼠的一般外觀行為(活動(dòng)狀態(tài)、皮膚毛發(fā)與大便狀態(tài))變化，并給予評(píng)分。參考文獻(xiàn)[9]制定外觀行為的各項(xiàng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(見表1)。統(tǒng)計(jì)每周各組小鼠外觀行為各項(xiàng)變化的積分，取每周2次觀測(cè)的均值，并分別統(tǒng)計(jì)各指標(biāo)群的積分。

表1 大鼠外觀行為分項(xiàng)及其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.2.2 體質(zhì)量與飲食量觀察 實(shí)驗(yàn)期間每周六、日(8∶10～8∶30)各稱取小鼠體質(zhì)量1次，取2次的平均值。另每周2次于喂食日上午9∶00按20 g/只向小鼠投放基礎(chǔ)飼料，24 h后稱取剩余飼料質(zhì)量，日飲食量(g)=20(g)-剩余飼料質(zhì)量(g)，日均飲食量取2次測(cè)量的均值。

2.3 行為學(xué)檢測(cè)

2.3.1 負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn) 于第1、2、3、4周末進(jìn)行，參考文獻(xiàn)在小鼠尾部1/3～2/3處固定其體質(zhì)量6 %的鉛皮，將小鼠面朝桶壁，輕輕置于直徑50 cm、水溫25 ℃、水深22 cm 的塑料桶中，以小鼠頭部沉入水底超過3 s不能回到水面和/或頭部連續(xù)沉入水面3次為結(jié)束點(diǎn)，記錄各只小鼠力竭時(shí)間，即入水至結(jié)束點(diǎn)的經(jīng)時(shí)[10]。

2.3.2 抓握力檢測(cè) 各組小鼠分別于實(shí)驗(yàn)第1、2、3、4周末(17∶00)使用抓握力測(cè)定儀測(cè)定其抓握力。具體方法：抓握力儀進(jìn)行校準(zhǔn)后，左手抓住小鼠后頸、右手抓住小鼠尾部，使其雙前肢抓緊傳感器而后肢懸空，沿傳感器縱軸輕拉小鼠尾部直至其四肢全部離開傳感器，記錄屏幕上顯示的抓握力值，每只小鼠重復(fù)測(cè)量2次取其均值。

2.4 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 臟器指數(shù) 處死各組小鼠后，分別稱取小鼠胸腺與脾臟質(zhì)量，按照下列公式計(jì)算胸腺與脾臟指數(shù)：臟器指數(shù)(mg/g)=器官重量(mg)/體質(zhì)量(g)[11]。

2.4.2 血清指標(biāo)檢測(cè) 采用Elisa法測(cè)定各組小鼠血清D-木糖、GAS、MTL、VIP、IL-1β、IL-6、TNF-α含量，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4.3 腓腸肌濕重與濕重/體質(zhì)量比檢測(cè) 取材后直接稱量各組小鼠的腓腸肌濕重；濕重/體質(zhì)量比按照以下公式進(jìn)行計(jì)算：濕重/體質(zhì)量比(mg/g)=腓腸肌濕重(mg)/體質(zhì)量(g)。

2.5 腓腸肌病理檢測(cè)

腓腸肌組織經(jīng)過脫水、透明、石蠟包埋，形成長方形石蠟塊切片，厚度約為5 μm，后經(jīng)過HE染色與中性樹封膠片，采用K-Viewer圖像采集系統(tǒng)軟件對(duì)腓腸肌的病理形態(tài)進(jìn)行觀察與描述[12]。隨機(jī)選取HE切片5個(gè)不同視野，分別取其40根肌纖維和10個(gè)肌纖維，利用Image J軟件計(jì)算肌纖維直徑平均值和橫截面面積[13]。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察結(jié)果

3.1.1 一般外觀行為狀態(tài)的變化 實(shí)驗(yàn)期間，正常組小鼠的外觀行為未見明顯異常。造模2周后，模型組小鼠逐漸出現(xiàn)活動(dòng)減少甚至扎堆、毛發(fā)少澤甚則枯亂、大便稀溏等變化。圖1示，與正常組比較，模型組小鼠第2周至第4周活動(dòng)狀態(tài)、皮膚毛發(fā)及大便狀態(tài)積分均明顯升高(P<0.01)。

注：與正常組比較：**P<0.01

3.1.2 體質(zhì)量的變化 圖2示，與正常組比較，模型組小鼠第1周至第4周體質(zhì)量均明顯降低(P<0.01)。

注：與正常組比較：**P<0.01

3.1.3 日均飲食量的變化 圖3示，與正常組比較，模型組小鼠日均飲食量第1周明顯增加(P<0.01)，第3周至第4周均明顯降低(P<0.01)。

注：與正常組比較：**P<0.01

3.2 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

3.2.1 負(fù)重游泳力竭時(shí)間的變化 圖4示，與正常組比較，模型組小鼠第2周至第4周各點(diǎn)游泳力竭時(shí)間均明顯縮短(P<0.05，P<0.01)。

注：與正常組比較：**P<0.01，*P<0.05

3.2.2 抓握力的變化 圖5示，與正常組比較，模型組小鼠實(shí)驗(yàn)期間各時(shí)間點(diǎn)的抓握力均明顯降低(P<0.01)。

注：與正常組比較：**P<0.01

3.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

3.3.1 臟器指數(shù)的變化 圖6示，與正常組比較，模型組小鼠第2周和第4周的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均明顯降低(P<0.05，P<0.01)。

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01

3.3.2 血清指標(biāo)的變化 圖7示，與正常組比較，模型組小鼠第2周和第4周的血清D-木糖、GAS、MTL、IL-1β以及TNF-α含量均明顯降低(P<0.05，P<0.01)，第2周和第4周的血清VIP與IL-6含量明顯增高(P<0.05)。

注：與正常組比較：**P<0.01，*P<0.05

3.3.3 腓腸肌濕重與濕重/體質(zhì)量比的變化 圖8示，與正常組比較，模型組小鼠第2周和第4周腓腸肌濕重、濕重/體質(zhì)量比均明顯降低(P<0.05)。

注：與正常組比較：*P<0.05

3.4 腓腸肌病理形態(tài)的變化

圖9示，正常組小鼠腓腸肌肌纖維排列緊密整齊，形態(tài)飽滿，呈不規(guī)則多邊形且結(jié)構(gòu)清晰；模型組小鼠腓腸肌纖維排列松散，邊緣變鈍，肌纖維間隙與肌束間隙明顯變寬。圖10示，與正常組比較，模型組小鼠第4周腓腸肌纖維直徑明顯縮短、肌纖維橫截面面積明顯減少(P<0.05，P<0.01)。

圖9 各組小鼠第4周腓腸肌病理形態(tài)的改變(HE 10×10)

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01

4 討論

脾主肌肉是中醫(yī)脾臟重要的生理屬性之一，由于脾虛涉及范圍較廣，臨床脾虛不一定必然伴有肌肉無力表現(xiàn)，因此脾虛引起的肌萎是脾虛的一種特殊病證類型。建立脾虛肌萎證的動(dòng)物模型對(duì)于研究脾主肌肉的現(xiàn)代內(nèi)涵及評(píng)價(jià)臨床有效方藥具有重要意義。

目前學(xué)界并未有脾虛肌萎證模型標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)定。基于脾虛肌萎證的中醫(yī)內(nèi)涵，該證的判斷標(biāo)準(zhǔn)通常應(yīng)包括中醫(yī)脾虛與肌肉損傷2個(gè)方面。其中脾虛的評(píng)價(jià)涉及外觀表征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的異常。在符合中醫(yī)脾虛證標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)肌肉損傷應(yīng)該是評(píng)價(jià)脾虛肌萎證模型復(fù)制成功的必要證據(jù)[2,6]。

當(dāng)前脾虛肌萎證的模型復(fù)制方法主要有4種，其中苦寒瀉下法[1]模擬中醫(yī)苦寒傷脾導(dǎo)致脾氣受損，即采用苦寒瀉下類藥物給予動(dòng)物灌胃，結(jié)果顯示模型大鼠逐漸出現(xiàn)消瘦、便溏等癥狀，肌肉中肌糖原含量明顯降低，提示模型具有脾虛肌肉損傷。但此法涉及苦寒藥味的過用，多會(huì)涉及脾陽受損的病機(jī)。勞倦過度+睡眠剝奪法[2]主要是基于中醫(yī)勞倦傷脾的發(fā)病學(xué)認(rèn)識(shí)，采用剝奪動(dòng)物部分睡眠時(shí)間聯(lián)合力竭游泳方法，結(jié)果顯示模型小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、毛色枯槁等脾虛表現(xiàn)，同時(shí)小鼠的比目魚肌濕重與肌纖維面積均明顯降低。不過該法中的剝奪睡眠會(huì)損傷心神，以致模型具有心脾兩傷的病機(jī)特點(diǎn)。苦寒瀉下+勞倦過度+飲食失節(jié)法[5]采取中醫(yī)脾虛的多個(gè)病因復(fù)合使用，即給予大鼠大承氣湯灌胃，聯(lián)合負(fù)重游泳力竭及饑飽失常，結(jié)果觀察到模型大鼠逐漸出現(xiàn)進(jìn)食減少、體質(zhì)量降低以及大便不調(diào)等表現(xiàn)，同時(shí)伴有抓握力降低，骨骼肌線粒體呈空泡樣變，符合脾虛肌萎證模型的判斷。但本法操作較為繁瑣，且短時(shí)間內(nèi)多因素合用存在急性損傷的機(jī)制，對(duì)復(fù)制過程中模型動(dòng)物的動(dòng)態(tài)變化未行觀察，相關(guān)模型的明確成模時(shí)間尚不清楚。且上述3種方法在模型復(fù)制中僅對(duì)動(dòng)物外觀表征與肌肉損傷方面進(jìn)行了觀察，未涉及對(duì)脾虛證相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的評(píng)價(jià)，故在模型的判定上尚存在不足。

勞倦過度+飲食失節(jié)法是目前建立脾虛肌萎證模型應(yīng)用較多的方法。本團(tuán)隊(duì)[4,7]曾采用該法連續(xù)4周對(duì)復(fù)制中的大鼠脾虛證和肌肉的變化進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)制2周時(shí)的模型大鼠即表現(xiàn)出脾虛相關(guān)癥狀和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)異常及抓握力降低，之后隨著造模時(shí)間的延長癥情逐漸加重，并出現(xiàn)骨骼肌的萎縮性病變。多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)表明，該模型具有中醫(yī)脾虛肌萎證的證候特點(diǎn)。該法在方法學(xué)上穩(wěn)定且易于操作，適于推廣，但目前尚未被用于小鼠模型的復(fù)制。

本次實(shí)驗(yàn)觀察到，該法誘導(dǎo)的模型小鼠在實(shí)驗(yàn)2周即可見出現(xiàn)被毛無澤、活動(dòng)減少、大便溏泄等癥狀，且隨著造模時(shí)間的延長癥狀加重，體質(zhì)量下降，飲食量明顯減少，游泳力竭時(shí)間縮短，與大鼠模型觀察到的結(jié)果[4]一致。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的變化通常也是判斷脾虛動(dòng)物模型的重要參數(shù)。已知D-木糖口服可反映小腸吸收功能，外周血或尿中D-木糖含量的降低是脾虛證臨床病理表現(xiàn)之一[14]。GAS與MTL均屬于消化道激素，主要生理功能為促進(jìn)胃腸道的分泌和增加胃腸道對(duì)水、電解質(zhì)的運(yùn)輸[15]。VIP則是具有刺激小腸液分泌、促進(jìn)腸道水分和電解質(zhì)分泌作用的一種神經(jīng)遞質(zhì)[16]，這些指標(biāo)均與脾主運(yùn)化的功能相關(guān)。有研究觀察到，采用腹腔注射利血平14 d建立的脾虛模型小鼠血清D-木糖和GAS含量明顯降低[17]，大黃水煎劑灌胃7 d誘導(dǎo)的脾虛模型小鼠血清MTL水平明顯降低[18]，VIP含量明顯升高[19]，提示脾虛模型小鼠胃腸功能減退與其胃腸激素失調(diào)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)也觀察到，模型組小鼠第2周、第4周血清GAS、MTL和D-木糖含量均明顯降低，VIP含量明顯升高，表明該模型小鼠確實(shí)存在胃腸和小腸功能的減退，從而導(dǎo)致食量減少、大便稀溏及體質(zhì)量減輕等癥。

脾化生氣血而能充養(yǎng)臟腑和防御外邪。脾虛證常伴有免疫系統(tǒng)的異常，因此胸腺與脾臟指數(shù)的變化及相關(guān)免疫因子的改變常被作為脾虛證的佐證之一[20，21]。外周循環(huán)中IL-1β、TNF-α與IL-6通過誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的增殖與分化，提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力等參與免疫調(diào)節(jié)[22，23]。一些研究觀察到，大黃水煎液[24]與番瀉葉水煎液[25]灌胃8 d建立的脾虛小鼠模型胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)均明顯降低，利血平腹腔注射[26]14 d誘導(dǎo)的脾虛小鼠模型血清TNF-α含量明顯降低，但I(xiàn)L-6含量明顯升高。本次研究觀察到，脾虛模型小鼠第2周與第4周的胸腺和脾臟指數(shù)、血清IL-1β以及TNF-α含量均明顯降低，表明該法也可引起小鼠的脾虛證候。本次實(shí)驗(yàn)還觀察到，模型小鼠的血清IL-6含量明顯升高，提示脾虛模型小鼠存在免疫功能調(diào)節(jié)方面的異常，但血清IL-6含量升高的原因尚待探查。

脾虛證可出現(xiàn)倦怠乏力、四肢無力等表現(xiàn)，但目前尚未有關(guān)于“四肢無力”癥狀的定量描述[27]。本團(tuán)隊(duì)前期曾引入強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和抓握力測(cè)試以評(píng)價(jià)模型大鼠的整體耐力(氣虛)和骨骼肌的肌力強(qiáng)度(肌萎證)[4]。本次實(shí)驗(yàn)觀察到，模型小鼠從實(shí)驗(yàn)第2周時(shí)即出現(xiàn)抓握力降低，至4周時(shí)降低更為明顯，與游泳力竭時(shí)間的變化趨勢(shì)一致，表明隨造模時(shí)間的延長，小鼠的體力及肌力下降日趨加重。本次實(shí)驗(yàn)還觀察到，模型小鼠第2周和第4周的腓腸肌濕重以及濕重/體質(zhì)量比均明顯降低，第4周的鏡下腓腸肌纖維排列松散，邊緣變鈍，肌纖維間隙與肌束間隙明顯變寬，肌纖維的直徑與橫截面面積均明顯減少，表明模型小鼠骨骼肌不僅出現(xiàn)肌力減退，而且還伴有一定程度的萎縮性病變。

綜上，小鼠采用“飲食失節(jié)+疲勞過度”法誘導(dǎo)4周可以成功復(fù)制出中醫(yī)脾虛肌萎證模型。