張哲昱 皮若錚 劉 吉 方惠民 楊 丹 孫寶飛

（貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，貴陽 550000）

砷及其化合物廣泛存在于自然界中，是目前危害人群健康的主要環(huán)境污染物之一。國際癌癥研究機構(gòu)已確認無機砷為人類致癌物［1］。世界衛(wèi)生組織估計，70個國家的2億多人的飲用水中無機砷（As）水平超過世衛(wèi)組織指南和美國環(huán)境保護局（EPA）給出的最高污染物水平10 μg/L［2］。長期暴露于有砷的環(huán)境下，使砷通過呼吸道、消化道和皮膚接觸等途徑進入機體，并在體內(nèi)蓄積，引起砷中毒。長時間的砷暴露會引起嚴重的疾病，如糖尿病、高血壓、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥。流行病學(xué)研究表明，長期接觸無機砷可損害記憶、學(xué)習(xí)能力、智力和認知功能，并誘發(fā)神經(jīng)炎癥［3］。在發(fā)育時期接觸無機砷可導(dǎo)致智力功能下降［4］。已有嚙齒類動物實驗表明，飲用含50 mg/L亞砷酸鈉（NaAsO2）水可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙［5］，并且這些化合物能夠通過血腦屏障［6］。到目前為止，已有證據(jù)表明無機砷暴露可誘導(dǎo)部分神經(jīng)元死亡、腦內(nèi)膠質(zhì)細胞凋亡、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)變性［7］。其中，神經(jīng)炎癥是目前神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機制中公認的因素之一，并與記憶功能下降和認知功能減退有關(guān)［8］。在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生與發(fā)展中，觀察到腦內(nèi)存在激活的膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，其中高反應(yīng)性的小膠質(zhì)細胞（microglia）可能導(dǎo)致神經(jīng)元功能異常和認知缺失。由過度活化的膠質(zhì)細胞分泌的多種炎癥因子積聚于腦內(nèi)環(huán)境中，引發(fā)神經(jīng)元焦亡。有研究表明，結(jié)晶體和顆粒狀物質(zhì)被細胞吞噬入胞內(nèi)后，可致胞內(nèi)溶酶體破壞，進而其中的組織蛋白酶釋放入胞漿［9］。組織蛋白酶B（CTSB）對NLRP3的激活過程有促進作用，激活的NLRP3炎癥小體使Caspase-1自身水解活化，活化的Caspase-1切割低活性的pro-IL-1β和pro-IL-18形成性質(zhì)活躍的IL-18和IL-1β［10］。本實驗旨在研究NaAsO2通過提高胞內(nèi)CTSB的水平，從而激活NLRP3炎癥小體，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)作用。為進一步探索砷致神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗細胞

本研究采用的BV-2小鼠小膠質(zhì)細胞系購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫（KCB）。

1.1.2主要試劑

NaAsO2（美國Sigma公司）；RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清（美國Gibco公司，8122013）；BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（中國索萊寶公司，PC0020）；Lyso-Tracker Green（中國碧云天公司，C1047S）；CTSB（12216-1-AP，1∶200），Caspase-1（22915-1-AP，1∶500），NLRP3（19771-1-AP，1∶300）多克隆抗體（美國Proteintech公司）；IL-1β（YT5201，1∶500）、IL-18（YN1926，1∶500）多克隆抗體，山羊抗兔IgG（S0002，1∶5 000）抗體（美國Immunoway公司）；anti-β-actin（81115-1-RR，1∶5 000）抗體（美國Proteintech公司），辣根過氧化物酶（美國Millipore公司，WBKLS0100）。

1.1.3主要儀器

5% CO2培養(yǎng)箱，高速離心機購自Thermo公司；96孔板，細胞培養(yǎng)皿購自中國NEST公司；電泳儀購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)

BV-2細胞培養(yǎng)于培養(yǎng)基（20%胎牛血清、1%100 mmol/L青霉素和100 mmol/L鏈霉素、79%RPMI 1640）中，置37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天進行換液，2～3 d傳代1次。融合培養(yǎng)采用胰酶消化傳代。取處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2CCK-8實驗

取生長狀態(tài)良好的BV-2小膠質(zhì)細胞接種于96孔板內(nèi)，調(diào)整細胞密度為5 000個/孔。設(shè)置空白對照組（無任何干預(yù)處理），4個實驗組，每個組包括6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，分別更換含0、2、4、8、16 μmol/L NaAsO2的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h后棄上清，每孔避光加入100 μl（不含血清的RPMI1640∶CCK-8=9∶1）CCK-8工作液。避光孵育2 h后放入酶標(biāo)儀中，測定450 nm處每孔A值。

1.2.3溶酶體探針實驗

取少量Lyso-Tracker Green按照1∶13 333~1∶20 000的比例加入到細胞培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)娜芤褐?，配制成工作液并置?7℃溫育。取出細胞培養(yǎng)皿，加入胰酶消化到EP管中，棄上清。加入PBS緩沖液，1 200 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)2次。加入工作液，與細胞37℃共孵育15 min。孵育結(jié)束，1 200 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS緩沖液，1 200 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)兩次。加入PBS與管內(nèi)剩余細胞充分混勻，使用流式細胞儀檢測。

1.2.4蛋白質(zhì)免疫印跡實驗

取出細胞培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的PBS清洗，并棄去清洗液，再用移液槍吸取200 μl裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）加入到培養(yǎng)皿中。10 min后用細胞刮刮取皿底的貼壁細胞，吸取皿中的混液到EP管中，離心。完成后，吸取上清液到新的EP管中，取部分用于定量，其余加入5×Loading Buffer緩沖液，加入量為EP管中蛋白質(zhì)體積的1/4，放入沸水中加熱5~10 min取出，冷卻，可用于蛋白質(zhì)免疫印跡實驗。進行BCA蛋白質(zhì)定量，根據(jù)蛋白質(zhì)定量數(shù)據(jù)，上樣，電泳。完成后，200 mA、2 h條件進行轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂奶粉封閉過夜，孵育一抗，洗膜，孵育二抗，洗膜，曝光顯影，凝膠成像儀上進行蛋白質(zhì)條帶檢測和灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.4.3軟件進行統(tǒng)計分析，正態(tài)性檢驗采用Shapiro-Wilk檢驗。正態(tài)分布資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩間多重比較采用LSD-t檢驗。多組比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Mann-Whiteny U檢驗。實驗至少重復(fù)3次，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度NaAsO2對BV-2小膠質(zhì)細胞細胞活力的影響

不同濃度（0、2、4、8、16 μmol/L）NaAsO2作用BV-2小膠質(zhì)細胞24 h，細胞活力總體差異有統(tǒng)計學(xué)差異（F=72.71，P<0.01）（圖1）。組內(nèi)兩兩多重比較顯示，與對照組（0 μmol/L）比較，2、4、8、16 μmol/L組 均 有 統(tǒng) 計 學(xué) 差 異（P2μmol/L=0.034，P4μmol/L<0.01，P8μmol/L<0.01，P16μmol/L<0.01）。表明2、4、8、16 μmol/L濃度的NaAsO2可以導(dǎo)致細胞活力下降，16 μmol/L濃度的NaAsO2導(dǎo)致細胞活力顯著下降，對細胞毒作用較強。參考CCK-8結(jié)果及其他文獻，后續(xù)研究采用2，4，8 μmol/L作為NaAsO2的實驗濃度。

Fig.1 Effects of different concentrations of NaAsO2onBV-2 cell viability

2.2 不同濃度NaAsO2對BV-2胞內(nèi)溶酶體水平的影響

不同濃度（0、2、4、8 μmol/L）NaAsO2作用BV-2小膠質(zhì)細胞24 h，對照組（0 μmol/L）與2 μmol/L、4 μmol/L和8 μmol/L NaAsO2組的細胞內(nèi)溶酶體水平總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.385，P<0.01），實驗重復(fù)3次（圖2）。組內(nèi)兩兩多重比較顯示，與對照組（0 μmol/L）比較，2 μmol/L、4 μmol/L和8 μmol/L組的細胞內(nèi)溶酶體減少，差異有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（P2μmol/L=0.030，P4μmol/L=0.025，P8μmol/L<0.01）。

2.3 不同濃度NaAsO2對小膠質(zhì)細胞胞內(nèi)CTSB水平的影響

對照組（0 μmol/L）和2 μmol/L、4 μmol/L和8 μmol/L NaAsO2組細胞內(nèi)CTSB水平總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=11.84，P<0.01），實驗重復(fù)3次（圖3）。組內(nèi)兩兩多重比較顯示，與對照組（0 μmol/L）比較，2 μmol/L、4 μmol/L和8 μmol/L組 細 胞 內(nèi)CTSB的 水 平 均 升 高（P2μmol/L=0.031，P4μmol/L<0.01，P8μmol/L<0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Fig.2 Effects of different concentrations of NaAsO2 on the level of intracellular lysosomes in BV-2

Fig.3 Effects of different concentrations of NaAsO2 on the level of intracellular CTSB in BV-2

2.4 不同濃度NaAsO2對小膠質(zhì)細胞胞內(nèi)NLRP3炎癥小體和Caspase-1水平的影響

對照組（0 μmol/L）和2 μmol/L、4 μmol/L和8 μmol/L NaAsO2組細胞內(nèi)NLRP3和Caspase-1水平總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（FNLRP3=20.75，PNLRP3<0.01；FCaspase-1=41.13，PCaspase-1<0.01），實驗重復(fù)3次（圖4）。與對照組（0 μmol/L）比較，4 μmol/L和8 μmol/L組細胞內(nèi)NLRP3和Caspase-1的水平均升高（P<0.01）差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Fig.4 Effects of different concentrations of NaAsO2 on the level of intracellular NLRP3,Caspase-1 in BV-2

2.5 不同濃度NaAsO2對小膠質(zhì)細胞胞內(nèi)IL-1β和IL-18水平的影響

對照組（0 μmol/L）和2 μmol/L、4 μmol/L和8 μmol/L NaAsO2組細胞內(nèi)IL-1β和IL-18水平總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義，（FIL-1β=31.19，PIL-1β<0.01；FIL-18=76.86，PIL-18<0.01），實驗重復(fù)3次（圖5）。與對照組（0 μmol/L）比較，4 μmol/L和8 μmol/L組 細 胞 內(nèi) 的IL-18水 平 均 升 高（P4μmol/L=0.018，P8μmol/L<0.01）差 異 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義，與 對 照 組（0 μmol/L）比較，2 μmol/L、4 μmol/L和8 μmol/L組 細 胞 內(nèi) 的IL-1β水 平 均 升 高（P2μmol/L=0.036、P4μmol/L<0.01，P8μmol/L<0.01）。

2.6 CA074-Me干預(yù)小膠質(zhì)細胞對胞內(nèi)CTSB水平的影響

根據(jù)上述實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組（0 μmol/L）比較，8 μmol/L組的小膠質(zhì)細胞胞內(nèi)CTSB水平上升較顯著，所以選擇在8 μmol/L NaAsO2培養(yǎng)細胞的基礎(chǔ)上加入5 μmol/L或10 μmol/L CTSB抑制劑CA-074Me干 預(yù)。對 照 組（8 μmol/L NaAsO2）、5 μmol/L CA074-Me干預(yù)組、10 μmol/L CA074-Me干預(yù)組，CTSB蛋白表達（F=53.66，P<0.01）差異有統(tǒng)計學(xué)意義，實驗重復(fù)3次（圖6）。組內(nèi)兩兩多重比較顯示，與對照組（8 μmol/L NaAsO2）相比，5 μmol/L CA074-Me組和10 μmol/L CA074-Me組細胞內(nèi)CTSB的表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P5μmol/L=0.018，P10μmol/L<0.01）。

Fig.5 Effects of different concentrations of NaAsO2 on the level of intracellular IL-1β，IL-18 in BV-2

Fig.6 Effects of co-culture with 8 μmol/L NaAsO2 and different concentrations of CA074-Me on the level of CTSB in microglia

2.7 抑制劑干預(yù)小膠質(zhì)細胞對胞內(nèi)NLRP3炎癥小體水平的影響

對照組（8 μmol/L NaAsO2）、5 μmol/L CA074-Me干 預(yù) 組、10 μmol/LCA074-Me干 預(yù) 組，胞 內(nèi)NLRP3和Caspase-1濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（FNLRP3=20.16，PNLRP3<0.01；FCaspase-1=41.75，PCaspase-1<0.01），實驗重復(fù)3次（圖7）。組內(nèi)兩兩多重比較，與對照組（8 μmol/L NaAsO2）比較，加入CA074-Me的組NLRP3表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P5μmol/L=0.0253，P10μmol/L<0.01）。與 對 照 組（8 μmol/L NaAsO2）比較，加入CA074-Me的組Caspase-1表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P5μmol/L<0.01，P10μmol/L<0.01）。

2.8 抑制劑干預(yù)小膠質(zhì)細胞對胞內(nèi)IL-1β和IL-18水平的影響

對照 組（8 μmol/L NaAsO2）、5 μmol/L CA074-Me干預(yù)組、10 μmol/L CA074-Me干預(yù)組，IL-18和IL-1β差 異 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（FIL-1β=45.11，PIL-1β<0.01；FIL-18=23.99，PIL-18<0.01），實驗重復(fù)3次（圖8）。組內(nèi)兩兩多重比較，與對照組（8 μmol/L NaAsO2）比 較，5 μmol/L CA074-Me干 預(yù) 組 和10 μmol/L CA074-Me干預(yù)組細胞內(nèi)的IL-1β表達量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P5μmol/L<0.01，P10μmol/L<0.01）。與 對 照 組（8 μmol/L NaAsO2）比 較，5 μmol/L CA074-Me干預(yù)組和10 μmol/L CA074-Me干預(yù)組細胞內(nèi)的IL-18表達量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P5μmol/L<0.01，P10μmol/L<0.01）。

Fig.7 Effects of co-culture with 8 μmol/L NaAsO2 and different concentrations of CA074-Me on the level of Caspase-1 and NLRP3 in microglia

Fig.8 Effects of co-culture with 8 μmol/L NaAsO2 and different concentrations of CA074-Me on the level of IL-1β and IL-18 in microglia

3 討 論

小膠質(zhì)細胞是腦組織內(nèi)一類重要的免疫效應(yīng)細胞，作為中樞系統(tǒng)內(nèi)唯一的巨噬細胞，具有免疫防御功能，主要有分枝狀和阿米巴樣兩種形態(tài)，前者為靜息狀態(tài)，后者為激活狀態(tài)［11］。小膠質(zhì)細胞被激活后，在細胞的形態(tài)發(fā)生改變的同時，遷移、吞噬、增殖和抗原呈遞功能也顯著加強［12］。在分子水平上，激活后的小膠質(zhì)細胞釋放大量的IL-1、IL-6、TNF-α、TGF-β、活性氧（ROS）、NO和谷氨酸鹽等炎性細胞因子和神經(jīng)毒性物質(zhì)［13］，影響突觸強度和可塑性，引起神經(jīng)元焦亡，從而損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)。小膠質(zhì)細胞的活化在有關(guān)學(xué)習(xí)記憶功能的損傷中起突出作用，亦是腦內(nèi)神經(jīng)炎癥的標(biāo)志［14］。在過去的幾年里，研究人員認為小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，小膠質(zhì)細胞的活化在阿爾茨海默病（AD）、帕金森?。≒D）和肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）等神經(jīng)退行性疾病中起重要作用［15］。

在NLRP3炎癥小體的激活過程中，有CTSB的參與［16］。組織蛋白酶是一類蛋白水解酶，在結(jié)構(gòu)和/或功能上表現(xiàn)出多樣性。溶酶體組織蛋白酶家族可分為天冬氨酸組織蛋白酶（D和E）、絲氨酸組織蛋白酶（A和G）和半胱氨酸組織蛋白酶（B、C、F、H、K、L、O、S、V、X和W）3個亞組［17］。本研究表明，一定濃度的NaAsO2可致小膠質(zhì)細胞內(nèi)溶酶體的膜穩(wěn)定性下降，由此可能導(dǎo)致溶酶體中的CTSB釋放，進而使胞內(nèi)的CTSB水平上升。值得注意的是，CTSB可以根據(jù)其在不同pH范圍內(nèi)作為內(nèi)肽酶或外肽酶的活性與組織蛋白酶家族成員區(qū)分開來［17］。在細胞內(nèi)，CTSB調(diào)節(jié)多種功能，包括細胞因子胞吐、溶酶體內(nèi)的蛋白質(zhì)裂解和誘導(dǎo)細胞死亡［18-19］。在實驗環(huán)境中，溶酶體內(nèi)或胞漿中的CTSB激活被認為可以促進NLRP3-炎癥體的激活和IL-1β的產(chǎn)生［20］。

炎癥小體是多蛋白質(zhì)復(fù)合物，由胞內(nèi)模式識別受體參與組裝，其中包括受體分子NLRP3、效應(yīng)蛋白pro-Caspase-1和含CARD的調(diào)亡相關(guān)斑點樣接頭蛋白（ASC，炎癥體的主體接頭蛋白）。NLRP3的寡聚化可以誘導(dǎo)PYD功能區(qū)在NLRP3的活性反應(yīng)過程中聚合，使同源的PYD功能區(qū)與ASC之間相互作用［21］。作為NLRP3炎性小體其中的支架蛋白，ASC還同時具有連接作用，其中的CARD和PYD結(jié)構(gòu)域募 集 下 游pro-Caspase-1的CARD結(jié)構(gòu)域，相互作用產(chǎn)生具有生物活性的Caspase-1，進一步與下游的pro-IL-1β和pro-IL-18作用，促使這部分促炎性因子從不具活性的前體蛋白成熟為具有活性的促炎因子IL-1β、IL-18，并以成熟的形式釋放到胞外［22］。

IL-1β又稱淋巴細胞刺激因子，由活化的單核巨噬細胞產(chǎn)生。在細胞內(nèi)，活化的Caspase-1可以切割無活性的pro-IL-1β和pro-IL-18，進而轉(zhuǎn)化為具有活性的促炎因子IL-1β和IL-18［23］。IL-1β對神經(jīng)系統(tǒng)的影響較為廣泛，如促進ROS自由基生成，加劇氧化損傷；促進其他炎癥因子分泌，加重炎癥反應(yīng)［24］；加速細胞鈣離子內(nèi)流，導(dǎo)致鈣超載。IL-18與IL-1β有相似之處，研究發(fā)現(xiàn)，IL-18可以中樞合成，其受體亞基在神經(jīng)元中廣泛表達［25］。在過度活躍的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞中，IL-18和IL-18R的表達分別上調(diào)［26］。有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血再灌注損傷損害后腦組織，引起經(jīng)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)活化的小膠質(zhì)細胞內(nèi)活化的IL-1β、IL-18水平均升高［27-28］。本研究表明，NaAsO2誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞胞內(nèi)IL-1β和IL-18的水平上升。但其是否被釋放到胞外，從而作用于周圍其他膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元而引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥尚存疑問［29］。雖然有部分IL-1β和IL-18在測定前已經(jīng)釋放至胞外，但是由于組間的培養(yǎng)情況相同，砷暴露的時間相同，與對照組比較可消除其釋放至胞外所造成的差異。至于是否與NaAsO2存在劑量效應(yīng)關(guān)系，還需要進一步實驗驗證。

而用化學(xué)抑制劑抑制CTSB可降低NLRP3炎癥的激活［30］。有研究表明，使用CA074-Me抑制CTSB是適當(dāng)和合理的，因為它具有高質(zhì)膜通透性和快速轉(zhuǎn)化為其非甲基化形式CA074的特性，已證明其非甲基化形式CA074可以特異性地干擾CTSB活性［31］。同時，本研究使用CTSB的選擇性化學(xué)抑制劑CA-074Me干預(yù)砷作用的小膠質(zhì)細胞的結(jié)果顯示，抑制劑干預(yù)的組與對照組相比胞內(nèi)CTSB水平和NLRP3炎癥小體的水平都有所下降，以濃度為10 μmol/L抑制劑干預(yù)的組下降較明顯。

綜上所述，本實驗證實了砷可通過破壞溶酶體，促使溶酶體內(nèi)CTSB釋放，致小膠質(zhì)細胞內(nèi)的CTSB水平上升，進一步誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的組裝，胞內(nèi)活化的Caspase-1含量增加。大量活化的Caspase-1切割pro-IL-1β和pro-IL-18，形成活性較高的IL-1β和IL-18。CTSB選擇性抑制劑CA074-Me對小膠質(zhì)細胞的干預(yù)令這一現(xiàn)象有明顯改變，進一步揭示了CTSB在砷誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細胞胞內(nèi)的炎癥因子水平上升中起著重要作用。

4 結(jié) 論

NaAsO2通過誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞內(nèi)CTSB水平的上升，介導(dǎo)NLRP3炎癥小體激活小膠質(zhì)細胞，促其釋放炎性因子，致神經(jīng)系統(tǒng)損傷。