張鈺王君宇段若愚肖江喜吳曄姜玉武延會(huì)芳**王靜敏

（1）北京大學(xué)第一醫(yī)院兒科，北京 100034；2）兒科遺傳性疾病分子診斷與研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100009；3）首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100045；4）北京大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，北京 100034；5）國家衛(wèi)生健康委員會(huì)神經(jīng)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100034）

髓鞘形成低下性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良（hypomyelinating leukodystrophy，HLD）是一類嬰幼兒期起病、以發(fā)育遲緩與腦白質(zhì)髓鞘形成低下為特征的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病。其臨床及遺傳學(xué)異質(zhì)性強(qiáng)，致病機(jī)制復(fù)雜，由少突膠質(zhì)細(xì)胞分化及功能異常導(dǎo)致，尚無治愈方法。1987年Cremers等［1］發(fā)現(xiàn)HLD1型（佩梅病）致病基因PLP1。至今，國際上共報(bào)道24個(gè)HLD相關(guān)致病基因，在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）命名為HLD1~24型。2022年，本課題組［2］主導(dǎo)定位TMEM163為HLD新致病基因并報(bào)道2例患兒。目前，國內(nèi)外尚缺乏對(duì)TMEM163突變患者自然病程的認(rèn)識(shí)，且尚無疾病模型開展機(jī)制研究。本研究現(xiàn)對(duì)本課題組之前報(bào)道的兩例TMEM163突變患者進(jìn)行隨訪，明確其臨床及遺傳學(xué)特點(diǎn)，并構(gòu)建患者來源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC），為后續(xù)致病機(jī)制研究及藥物靶點(diǎn)篩選打下基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

2例TMEM163變異致病患兒通過門診、電話或微信隨訪獲得資料，末次隨訪時(shí)間為2022年8月。隨訪內(nèi)容包含臨床癥狀、體征、血生化檢查、頭顱磁共振成像（MRI）、發(fā)育評(píng)估、康復(fù)訓(xùn)練情況等。發(fā)育評(píng)估采用Gesell發(fā)育評(píng)估量表及粗大運(yùn)動(dòng)功能分級(jí)（Gross motor function classification system，GMFCS）［3］進(jìn)行。

病例1（Patient 1，Pt1），男，11歲。出生后至7歲發(fā)育遲緩，緩慢進(jìn)步，現(xiàn)無臨床癥狀。出生后發(fā)現(xiàn)水平性眼震，8月齡消失。運(yùn)動(dòng)發(fā)育輕度遲緩，6月會(huì)抬頭，7月會(huì)翻身，1歲可獨(dú)坐，2歲會(huì)獨(dú)走。語言發(fā)育遲緩，1歲可說單詞。隨訪發(fā)現(xiàn)，患兒發(fā)育緩慢進(jìn)步，7歲僅表現(xiàn)為步態(tài)異常，進(jìn)入普通小學(xué)就讀?，F(xiàn)成績中等，步態(tài)恢復(fù)正常。無抽搐。第一胎，第一產(chǎn)。出生體重4 200 g。父母非近親婚配，否認(rèn)家族類似疾病史。查體：7月齡肌張力降低。7月齡頭顱核磁顯示腦白質(zhì)髓鞘形成低下。血常規(guī)及血尿代謝篩查未見異常。2歲、7歲GMFCS評(píng)級(jí)均為I級(jí)。

病例2（Patient 2，Pt2），女，5歲1月齡。發(fā)育遲緩，緩慢進(jìn)步。2月齡發(fā)現(xiàn)水平性眼震，2歲消失。運(yùn)動(dòng)發(fā)育中度遲緩，3月會(huì)抬頭，10月齡會(huì)翻身，14月齡會(huì)獨(dú)坐，2歲10月齡可獨(dú)走伴異常步態(tài)，4歲可雙腿跳躍，現(xiàn)可獨(dú)自上樓梯。語言發(fā)育遲緩，2歲可說單詞，3歲3月齡可說完整句子。現(xiàn)發(fā)音欠清晰，語速慢，認(rèn)知社交能力正常。無抽搐。第一胎，第一產(chǎn)，出生體重3 489 g。父母非近親婚配，胞兄體健，否認(rèn)家族類似疾病史。查體：4月齡肌張力低，頭圍位于第50%百分位；15月齡肌張力低，身體生長指標(biāo)、肌力、聽力及視力均正常。13月齡Gesell發(fā)育評(píng)估提示運(yùn)動(dòng)發(fā)育中度遲緩，精細(xì)運(yùn)動(dòng)、語言、個(gè)人和社會(huì)適應(yīng)輕度遲緩。4月齡及13月齡頭顱核磁顯示彌漫性髓鞘發(fā)育遲緩。肝功能、腎功能、電解質(zhì)、血乳酸、同型半胱氨酸、維生素B12、先天性代謝病及溶酶體活性篩查均未見異常。2歲GMFCS評(píng)級(jí)為II級(jí)，5歲GMFCS評(píng)級(jí)為I級(jí)。

本研究經(jīng)北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2005-04），已獲患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1遺傳學(xué)分析

軟件預(yù)測利用REVEL等數(shù)據(jù)庫/軟件進(jìn)行。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)分析使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫［4］（UniProtKB，https://www.uniprot.org）查詢蛋白質(zhì)條目，利用AlphaFold［5］蛋白質(zhì)模型數(shù)據(jù)庫預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，下載蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)文件（PDB格式），再利用VENUS［6］及DynaMut2［7］等軟件，定量預(yù)測突變型和野生型蛋白質(zhì)熱力學(xué)穩(wěn)定性差異。閾值定義為：與野生型相比，突變體結(jié)構(gòu)的自由能變化（ΔΔG值）>3 kcal/mol為嚴(yán)重不穩(wěn)定，1~3 kcal/mol為不穩(wěn)定，<1 kcal/mol為中性或良性［8-9］，評(píng)估變異對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。在ClinVar、OMIM、Mastermind、PubMed、中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研。結(jié)合軟件預(yù)測結(jié)果、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)分析結(jié)果及文獻(xiàn)內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參考美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）2015年發(fā)布的變異致病性注釋指南對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行致病性評(píng)級(jí)［10］，評(píng)估變異位點(diǎn)致病性。

1.2.2患者來源iPSC構(gòu)建

采集Pt2外周血5 ml，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），配置PBMC培 養(yǎng) 基，即RPMI-1640（Thermo Fisher Scientific）/10%胎 牛 血 清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Thermo Fisher Scientific）添加100μg/L促血小板生成素（thrombopoietin，TPO，Peprotech）、100 μg/L干 細(xì) 胞 因 子（stem cell factor，SCF，Peprotech）、100 μg/L Fms相關(guān)酪氨酸激酶3配體（Fms-related tyrosine kinase 3 ligand，F(xiàn)LT-3，Peprotech）、10μg/L粒 細(xì) 胞 集 落 刺 激 因 子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF，Peprotech）、10μg/L IL-3（Peprotech）及GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific）、青霉素鏈霉素（penicillin streptomycin，P/S，Thermo Fisher Scientific）。分離后的PBMC以1×106/ml密度用PBMC培養(yǎng)基培養(yǎng)于超低黏附6孔板的一個(gè)孔中，于5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液，4 d后電轉(zhuǎn)。每1×106PBMC電轉(zhuǎn)10 μg非整合型誘導(dǎo)質(zhì)粒（包含4 μg pEV-SFFV-OCT4-E2A-SOX2、4 μg pEV-SFFV-MYC-E2A-KLF4和2 μg pEV-SFFVBCL-XL）（上海捷易生物科技有限公司），電轉(zhuǎn)采用Amaxa Nucleofector II電轉(zhuǎn)儀的U-008程序和Amaxa? Human CD34+Cell Nucleofector? Kit（LONZA）試劑盒進(jìn)行。電轉(zhuǎn)后的PBMC用2 ml PBMC培養(yǎng)基培養(yǎng)于6孔板的一個(gè)孔中；鋪飼養(yǎng)層細(xì)胞（MEF）于6孔板，以備第2天接種。配置hiPSC誘導(dǎo)培養(yǎng)基，即DMEM/F12（Thermo Fisher Scientific）添 加20% KSR（KnockOut?Serum Replacement，Thermo Fisher Scientific）、GlutaMAX、NEAA（Thermo Fisher Scientific）、P/S、0.1 mmol/L 2-巰基乙醇（2-mercaptoethanol，Thermo Fisher Scientific）、20μg/L FGF2（Fibroblast Growth Factor-basic，成纖維細(xì)胞生長因子，Peprotech）。電轉(zhuǎn)后第2天，離心收取電轉(zhuǎn)的PBMC，用1 ml PBMC培養(yǎng)基+1 ml hiPSC誘導(dǎo)培養(yǎng)基種于MEF細(xì)胞上。隨后，每2 d換2 ml hiPSC誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在電轉(zhuǎn)后第10天看到小克隆出現(xiàn)。繼續(xù)保持每2 d換液，待克隆團(tuán)長到合適大小，用 槍 頭 挑 取 單 克 隆，用mTeSR1（STEMCELL）種于用基質(zhì)膠（matrigel，BD，#354277）包埋后的12孔板中，建系傳代培養(yǎng)。傳代第5代之后，進(jìn)行鑒定。

1.2.3iPSC鑒定

a.堿性磷酸酯酶染色

堿性磷酸酶（AP）染色采用BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（碧云天）。將第10代iPSC吸棄培養(yǎng)基，加入PBS清洗2次，每次5 min；加入4%多聚甲醛（Sigma），室溫放置20 min固定；PBS洗3次，每次5 min。按照如下比值配置BCIP/NBT染色工作液：BCIP/NBT染色工作液3.03 ml=堿性磷酸酶顯色緩沖液3 ml+BCIP溶液（300×）10μl+NBT溶液（150×）20μl。將BCIP/NBT染色工作液加入培養(yǎng)皿中，室溫避光孵育30 min，顯色至合適深淺。去除工作液，用蒸餾水洗滌2次，終止顯色反應(yīng)。光鏡下觀察結(jié)果。

b.變異位點(diǎn)Sanger測序

利用基因組DNA提取試劑盒（寧波有成）提取患兒第5代iPSC基因組DNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送檢進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證iPSC是否攜帶TMEM163c.227T>C變異。

c.染色體核型分析

染色體G帶分析實(shí)驗(yàn)在北京大學(xué)細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室中完成。

d.細(xì)胞免疫熒光檢測

第10代的誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞用PBS清洗3次，4%多聚甲醛溶液室溫固定20 min，PBS清洗3次，每 次5 min。0.2% TritonX-100（Sigma）破 膜30 min，PBS清洗3次，2%BSA封閉30 min，PBS清洗3次。加入2%BSA稀釋的一抗4℃孵育過夜，次日用PBS清洗3次，與相應(yīng)的二抗室溫避光孵育2 h，PBS清 洗3次，每次5 min。Hoechst33342（1∶500）染細(xì)胞核，熒光顯微鏡（萊卡，DMi8）觀察細(xì)胞并拍照。用于免疫熒光檢測的抗體如下：rabbit-anti-NANOG（Abcam，#ab80892），mouseanti-OCT4（Santa Cruz，#sc-5279），goat-anti-SOX2（R&D，#AF2018），mouse-anti-TRA-1-60（Millipore，#MAB4360），donkey anti-mouse IgG 488 conjugate（Thermo Fisher Scientific，#A-21202），donkey anti-goat IgG 594 conjugate（Thermo Fisher Scientific，#A-11058），donkey anti-rabbit IgG 488 conjugate（Thermo Fisher Scientific，#A-21206）。

e.畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)

選取核型鑒定為正常染色體的iPSC擴(kuò)增，EDTA消化，計(jì)數(shù)；用100μl PBS混懸誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞（細(xì)胞量約1×107），1∶1加入基質(zhì)膠（每只小鼠注射1×107個(gè)細(xì)胞），植入NOD-SCID小鼠的一側(cè)下肢腹股溝皮下，8~10周后處死小鼠，分離腫塊將其置于甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察三胚層形成情況。

f.實(shí)時(shí)定量PCR（real time quantitative PCR，RT-qPCR）

首 先，收 集iPSC，加 入1 ml TRI試 劑（Sigma），混勻，-20℃過夜。利用Direct-zol RNA MiniPrep試劑盒（ZYMO RESEARCH）按照說明書操作抽提RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用EasyScript?cDNA Synthesis Kit進(jìn)行（20 μl體系），步驟同說明書。qPCR采用KAPA SYBR? Fast Mastermix實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒依據(jù)說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系如表1。

Table 1 qPCR reagents

qPCR反應(yīng)程序如下。

階 段1：95℃，3 min。階 段2：95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循壞。階段3：95℃10 s，65℃5 s。根據(jù)2-ΔΔCt方法，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量（PBMC作為陰性對(duì)照，H9-hESC作為陽性對(duì)照），引物序列見表2。

Table 2 Nucleotide sequences of primers used in RT-qPCR

g.支原體檢測

收 取48 h培 養(yǎng) 液 上 清1 ml，2 000×g離 心10 min，去沉淀；17 000×g離心10 min，去上清，剩余底部50μl液體作為擴(kuò)增樣本模版；進(jìn)行PCR，檢測上游引物為ACACCATGGGAGCTGGTAAT，下游引物為CTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT及CTTCTTCGACTTCCAGACCCAAGGCAT。

h.整合分析實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞DNA抽提具體步驟見前述，取P12的iPSC作檢測；PCR實(shí)驗(yàn)具體步驟見前述；檢測外源質(zhì)粒載體整合，所用引物序列見表3。

Table 3 Nucleotide sequences of primers used in integrated analysis

2 結(jié) 果

2.1 臨床特點(diǎn)

在嬰幼兒期，2例患兒均以眼震為首發(fā)癥狀，主要表現(xiàn)為全面發(fā)育遲緩、肌張力低、步態(tài)異常。頭顱核磁顯示腦白質(zhì)髓鞘形成低下。學(xué)齡前期，2例患兒肌張力正常，運(yùn)動(dòng)發(fā)育正?；蜉p度遲緩，語言發(fā)育均正常，Pt2頭顱核磁顯示40月齡頭顱核磁內(nèi)囊前肢髓鞘形成好轉(zhuǎn)，其余區(qū)域腦白質(zhì)仍表現(xiàn)為彌漫性低信號(hào)，提示髓鞘形成低下（圖1）。Pt1進(jìn)入學(xué)齡期后，步態(tài)恢復(fù)正常。臨床特點(diǎn)對(duì)比見表4。

Fig.1 T2-weighted MRI images at 4 months(left)and 40 months(right)of Pt2

Table 4 Clinical characteristics of two patients with variants in TMEM163

2.2 遺傳學(xué)特點(diǎn)

Pt1與Pt2分別發(fā)現(xiàn)TMEM163c.227T>G p.（L76R）與c.227T>C p.（L76P）新發(fā)錯(cuò)義變異，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示（圖2），在L76R突變體中，第76位的亮氨酸突變?yōu)榫彼幔淖兞税被釘y帶的電荷量，突變體的氨基酸殘基可能會(huì)破壞附近的泛素化位點(diǎn)，VENUS預(yù)測ΔΔG=2.3 kcal/mol，突變體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。在L76P變體中，第76位的亮氨酸突變?yōu)楦彼?，從非芳香族變?yōu)榉枷阕灏被幔邩O性，VENUS預(yù)測ΔΔG=2.7 kcal/mol，突變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，且可能破壞附近的泛素化位點(diǎn)。錯(cuò)譯變異預(yù)測軟件REVEL評(píng)估L76P為0.81，即有81%可能性為致病性變異，評(píng)估L76R為0.91，即有91%可能性為致病性變異。

Fig.2 The predicted structure of TMEM163 wild-type and mutant proteins

Pt1檢測發(fā)現(xiàn)TMEM163c.227T>G p.（L76R）新發(fā)錯(cuò)義變異，位點(diǎn)依據(jù)ACMG評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)為“致病性”（PS1+PS2+PM1+PM2+PP3）。Pt2檢測發(fā)現(xiàn)檢測發(fā)現(xiàn)TMEM163c.227T>C p.（L76P）新發(fā)錯(cuò)義變異，位點(diǎn)依據(jù)ACMG評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)為“致病性”（PS1+PS2+PM1+PM2+PP3）。

2.3 iPSC構(gòu)建及鑒定

利用Pt2TMEM163c.227T>C p.（L76P）來源外周血單個(gè)核細(xì)胞構(gòu)建iPSC。iPSC表現(xiàn)為典型的人胚胎干細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征（圖3a），堿性磷酸酶染色呈陽性（圖3b）。經(jīng)Sanger測序驗(yàn)證，其和患者血單個(gè)核細(xì)胞中突變位點(diǎn)一致（圖3c）。核型分析結(jié)果無異常（圖4）。免疫熒光染色證實(shí)其表達(dá)多能性標(biāo)志物OCT4、SOX2、TRA-1-60和NANOG，且RT-qPCR分析證實(shí)其多能性標(biāo)志物OCT4、SOX2、NANOG、LIN28和REX1在iPSCs中的表達(dá)高于PBMCs（圖5）。此外，畸胎瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有三胚層分化潛能（圖6）。支原體特異性PCR檢測結(jié)果表明，與陽性對(duì)照相比，誘導(dǎo)的iPSC沒有支原體污染（圖7a）。整合分析提示細(xì)胞沒有外源質(zhì)粒載體整合（圖7b）。該細(xì)胞系已經(jīng)過人類多能干細(xì)胞系全球注冊中心（hPSCreg?,https://hpscreg.eu/）注冊認(rèn)證，細(xì)胞系編號(hào)為PUFHi00 4-A。

Fig.3 Morphology,alkaline phosphatase activity and Sanger sequencing of iPSC

Fig.4 Karyotype analysis

Fig.5 Positive immunofluorescence staining for pluripotency markers

Fig.6 Representative hematoxylin and eosin staining of teratomas derived from the established iPSC clones

Fig.7 Mycoplasma test and integrated analysis

3 討 論

HLD是因中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘化低下導(dǎo)致的以發(fā)育遲緩為主要表現(xiàn)的一類遺傳性疾?。?1］。大多數(shù)重度髓鞘形成低下的患者在嬰幼兒期起病，并發(fā)展為重度神經(jīng)功能障礙，但部分患者癥狀較輕，癥狀在青春期或成年期開始出現(xiàn)。其主要特征為頭顱MRI腦白質(zhì)T2WI彌漫性高信號(hào)伴T1WI等信號(hào)、輕度低信號(hào)或輕度高信號(hào)。發(fā)病率預(yù)估范圍為1/5 000~1/50 000［12］，中國尚未見相關(guān)報(bào)道。臨床表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)認(rèn)知發(fā)育遲緩，神經(jīng)系統(tǒng)異常如眼震、肌張力異常、共濟(jì)失調(diào)、痙攣性截癱及錐體外系征，部分患者可有牙齒發(fā)育異常等［13］。本研究中，2例患者臨床特點(diǎn)為早期運(yùn)動(dòng)語言發(fā)育遲緩、頭顱磁共振成像顯示腦白質(zhì)髓鞘化不良，且癥狀隨生長發(fā)育逐漸改善。均于嬰兒期起病，以眼球震顫為首發(fā)癥狀，學(xué)齡前期均有步態(tài)異常與肌張力低，臨床診斷為HLD。與之前對(duì)2例患者的觀察相比［2］，Pt1于10歲時(shí)智力水平及運(yùn)動(dòng)發(fā)育正常，Pt2頭顱核磁顯示內(nèi)囊前肢髓鞘化好轉(zhuǎn)，均提示該類HLD具有獨(dú)特的癥狀逐漸好轉(zhuǎn)的特點(diǎn)。

目前有24種基因與HLD相關(guān)（OMIM，https://omim.org/），本研究病例為TMEM163同一位點(diǎn)2種錯(cuò)義變異，Pt1發(fā)現(xiàn)TMEM163c.227T>G p.（L76R）新發(fā)變異，Pt2發(fā)現(xiàn)TMEM163c.227 T>C p.（L76P）新發(fā)變異。兩變異軟件預(yù)測均提示有害，均未在千人數(shù)據(jù)庫、ExAC數(shù)據(jù)庫等收錄，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測提示突變體蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，且可能破壞附近的泛素化位點(diǎn)，引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)濃度失衡，導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙，影響髓鞘形成。功能實(shí)驗(yàn)證明兩變異均可引起HeLa細(xì)胞內(nèi)鋅穩(wěn)態(tài)失衡及斑馬魚髓鞘形成障礙［2］，ACMG評(píng)級(jí)均為“致病性”（PS1+PS2+PM2+PP3）。據(jù)此，認(rèn)為Pt1為TMEM163c.227 T>G p.（L76R）變異致病，Pt2為TMEM163c.227 T>C p.（L76P）變異致病，兩例患者臨床遺傳學(xué)診斷為HLD。與先前評(píng)級(jí)相比［2］，本研究首次對(duì)兩位點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析預(yù)測變異對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性影響，首次納入新軟件預(yù)測結(jié)果（如PROVEAN、REVEL等），完善ACMG評(píng)級(jí)證據(jù)。

目前，HLD尚無治愈方法，其致殘性為患兒家庭及社會(huì)帶來了沉重負(fù)擔(dān)，而探討TMEM163獨(dú)特臨床病程的病理機(jī)制，尤其是髓鞘形成好轉(zhuǎn)機(jī)制，有希望為同類疾病提供治療線索。為此，本研究采集Pt2外周血構(gòu)建iPSC。建立的患者iPSC在各方面與人胚胎干細(xì)胞相似，包括形態(tài)、增殖潛能、表面標(biāo)志物、基因表達(dá)、染色體結(jié)構(gòu)、變異位點(diǎn)、體外分化畸胎瘤形成、外源質(zhì)粒整合分析等。經(jīng)Sanger測序及染色體核型分析，其變異位點(diǎn)與患者血單個(gè)核細(xì)胞中變異位點(diǎn)一致且無大片段染色體結(jié)構(gòu)變異，證明誘導(dǎo)過程未造成染色體結(jié)構(gòu)損傷。干細(xì)胞標(biāo)志物堿性磷酸酶染色陽性，經(jīng)免疫熒光染色及RT-qPCR，與PBMCs相比，多能性標(biāo)志物OCT4、SOX2、NANOG、LIN28和REX1表達(dá)升高，畸胎瘤分化實(shí)驗(yàn)可觀察到腸、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)管等組織，證明其具有三胚層分化潛能。因采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，故對(duì)外源質(zhì)粒載體進(jìn)行檢測，結(jié)果提示細(xì)胞沒有外源質(zhì)粒載體整合。與大/小鼠模型相比，iPSC取材自患者，貼近人類遺傳學(xué)背景，利于探索細(xì)胞通路、細(xì)胞代謝及轉(zhuǎn)錄因子相互作用機(jī)制。由iPSC誘導(dǎo)為腦類器官，可觀察發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)變化，為治療探索奠定基礎(chǔ)。iPSC誘導(dǎo)模型局限性為無法對(duì)行為學(xué)現(xiàn)象進(jìn)行建模觀察，在后續(xù)藥物研究中，仍需結(jié)合動(dòng)物模型觀察行為學(xué)變化情況，以進(jìn)一步明確藥效。

4 結(jié) 論

本研究為國際首次對(duì)2例TMEM163致病HLD患兒進(jìn)行隨訪研究，總結(jié)了該類HLD的自然病程，擴(kuò)展了對(duì)HLD臨床表型認(rèn)識(shí)。國際首次構(gòu)建了TMEM163c.227T>C p.（L76P）變 異 患 者 來 源iPSC，為機(jī)制研究及治療探索打下了基礎(chǔ)。