吳聰英 周 翠 張 捷

（1）北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 101121；2）北京大學(xué)第一醫(yī)院，北京 100034）

艾灸是傳統(tǒng)中醫(yī)的常用治療方法。其借灸火的熱力給人體以溫?zé)嵝源碳?，通過(guò)經(jīng)絡(luò)腧穴的作用，以達(dá)到溫通經(jīng)絡(luò)、調(diào)和氣血、扶正祛邪及防病保健的方法?！鹅`樞經(jīng)·官針》篇指出：“針?biāo)粸?，灸之所宜”。隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步與科研技術(shù)的發(fā)展，艾灸對(duì)癌癥的治療作用也逐漸被揭示，如改善血液循環(huán)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能和機(jī)體代謝、減輕化療毒副反應(yīng)，以及減少癌癥并發(fā)癥等［1］。所以有學(xué)者認(rèn)為，艾灸的治療根本在于“扶正以抑瘤”。艾灸通過(guò)作用于人體氣血經(jīng)絡(luò)，扶助人體正氣，改善全身整體功能，從而達(dá)到祛病抑癌的目的［2］。但也有實(shí)驗(yàn)證明，艾灸對(duì)癌細(xì)胞有直接的抑制和殺傷作用［3］，只是具體機(jī)制尚未得到闡明。

艾灸是一種綜合性的療法，其中首要的作用是熱療。在腫瘤學(xué)中，熱療是目前國(guó)際上認(rèn)可的一種抑制癌癥的物理治療方法（高于37℃，一般為40~43℃）。作為放療和化療的輔助手段，熱療已經(jīng)被用于多種癌癥的治療，例如頭頸癌、乳腺癌、宮頸癌、肉瘤和黑素瘤［3］。在癌癥治療中使用熱療是很有吸引力的，因?yàn)樽鳛橐环N物理療法，熱療的副作用比化療和放療少得多，而且它可以與這些療法結(jié)合使用。然而，由于熱療臨床抑癌效果的機(jī)制尚未得到明確，應(yīng)用受到了限制［4］。

本研究通過(guò)運(yùn)用長(zhǎng)時(shí)間的顯微縮時(shí)攝影技術(shù)、細(xì)胞計(jì)數(shù)以及凋亡標(biāo)志物成像等細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)研究42℃熱療對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞系的作用，從而明確熱療對(duì)癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期從一個(gè)角度揭示艾灸治療癌癥的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和熱療處理

U251星形膠質(zhì)細(xì)胞癌細(xì)胞系購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司（CL-0237，STR鑒定正確）。本研究的U251細(xì)胞在適宜的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)液的成分為：體積占比89%DMEM培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific），體積占比10%胎牛血清（Gibco）和體積占比1%青霉素鏈霉素抗生素混合溶液（Gibco）。正常的培養(yǎng)條件為在細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific）中以5% CO2和37℃以及95%以上濕度進(jìn)行培養(yǎng)。熱療的培養(yǎng)條件為在細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific）中以5%CO2和42℃以及95%以上濕度進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 顯微縮時(shí)攝影

長(zhǎng)時(shí)間的顯微縮時(shí)攝影是應(yīng)用Olympus CKX41倒置熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行記錄，用INU二氧化碳培養(yǎng)小室（TOKAI HIT）對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的溫度、濕度和CO2濃度進(jìn)行控制。本研究的觀測(cè)熱療對(duì)U251細(xì)胞的培養(yǎng)條件為：5%CO2和42℃以及95%以上濕度。

1.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)方法

將U251細(xì)胞傳代于24孔板，對(duì)照組和熱療組分別在37℃和42℃培養(yǎng)3 d（72 h）后，輕柔吸盡培養(yǎng)液，每孔加入1 ml細(xì)胞消化液（0.25%胰酶-EDTA，Gibco），37℃消化10 min。吹打混勻后，取10ul與等體積的0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液（瑞沃德）進(jìn)行混勻染色，然后取10 μl加入DS-50細(xì)胞計(jì)數(shù)板（瑞沃德），在C100自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（瑞沃德）下計(jì)數(shù)，記錄全細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)。用非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 核固縮觀測(cè)

將U251細(xì)胞傳代于激光共聚焦培養(yǎng)皿（Nest），對(duì)照組和熱療組分別在37℃和42℃培養(yǎng)2 d（48 h）后，加入1 ml 4%多聚甲醛細(xì)胞固定液（雷根）固定細(xì)胞，室溫固定10 min。然后加入用PBS溶液配制的2 mg/L Hoechst33342（Invitrogen H3570）細(xì)胞核染色液，染色5 min。在Olympus激光共聚焦顯微鏡（FLUOVIEW FV10i）下觀測(cè)。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

將U251細(xì)胞傳代于激光共聚焦培養(yǎng)皿（Nest），對(duì)照組和熱療組分別在37℃和42℃培養(yǎng)2 d（48 h）后，應(yīng)用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（C1062S，碧云天）經(jīng)染色。每孔的玻片 小 室 內(nèi) 加 入210 μl染 色 液（195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液+5 μl Annexin V-FITC染色液+10 μl碘化丙啶（PI）染色液），室溫避光孵育20 min。在Olympus激光共聚焦顯微鏡（FLUOVIEW FV10i）下觀測(cè)。

1.6 活細(xì)胞Caspase-3活性檢測(cè)

將U251細(xì)胞傳代于激光共聚焦培養(yǎng)皿（Nest），對(duì)照組和熱療組分別在37℃和42℃培養(yǎng)2 d（48 h）后，應(yīng) 用 活 細(xì) 胞Caspase-3活 性 與Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（C1077S，碧云天）。每孔的玻片小室內(nèi)加入200 μl染色液（194 μl Annexin V-mCherry結(jié) 合 液+5 μl Annexin V-mCherry染色液+1 μl GreenNuc?Caspase-3染色液），室溫避光孵育20 min。在Olympus激光共聚焦顯微鏡（FLUOVIEW FV10i）下觀測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 熱療對(duì)U251細(xì)胞影響的動(dòng)態(tài)觀察

為了細(xì)致觀測(cè)熱療對(duì)U251細(xì)胞的影響，進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)108 h的動(dòng)態(tài)觀察（圖1，視頻S1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第1天（24 h）內(nèi)，仍有一部分細(xì)胞進(jìn)行了分裂增殖，說(shuō)明在熱療初期并不能完全抑制細(xì)胞的增殖，在這一段時(shí)間內(nèi)大部分變圓的細(xì)胞是因?yàn)榧?xì)胞分裂。然而在1 d后，就很少見到細(xì)胞分裂，變圓的細(xì)胞開始慢慢增多。隨著時(shí)間推移，細(xì)胞變圓的現(xiàn)象更加明顯，而變圓的細(xì)胞往往最后會(huì)死亡，而這種現(xiàn)象在48 h（第2天），變得比較明顯，后續(xù)將此事件節(jié)點(diǎn)作為檢測(cè)細(xì)胞凋亡的時(shí)間點(diǎn)。而在72 h（第3天），底層貼壁細(xì)胞變少變大，上層變圓和死亡的細(xì)胞明顯增多，后續(xù)將此時(shí)間節(jié)點(diǎn)作為細(xì)胞計(jì)數(shù)的時(shí)間點(diǎn)。

2.2 42℃熱療引起星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞的凋亡

2.2.142℃熱療引起星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞的核固縮

通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，在42℃熱療處理2 d（48 h）后，細(xì)胞變圓和細(xì)胞死亡的現(xiàn)象變得比較明顯，首先觀測(cè)熱療對(duì)U251細(xì)胞胞核的影響。與對(duì)照組相比，有一部分42℃熱療的星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞（往往是變圓的細(xì)胞）的細(xì)胞核縮小、形態(tài)畸變、凝聚，即核固縮，提示其可能發(fā)生了凋亡（圖2）。

2.2.242℃熱療引起星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞的凋亡

因?yàn)橛^察到熱療可以引起U251細(xì)胞核的核聚縮，用凋亡的標(biāo)記物Annexin V來(lái)驗(yàn)證熱療是否引起了細(xì)胞凋亡。42℃熱療處理U251細(xì)胞2 d（48 h）后，與對(duì)照組相比發(fā)現(xiàn)，凋亡的標(biāo)志物Annexin V和細(xì)胞死亡的標(biāo)志物PI陽(yáng)性的細(xì)胞明顯增多。與此同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，有一部分Annexin V陽(yáng)性的細(xì)胞也同時(shí)是PI陽(yáng)性，而且PI陽(yáng)性的細(xì)胞則往往是Annexin V陽(yáng)性的，提示這些PI陽(yáng)性的細(xì)胞為凋亡后期失去細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞（圖3）。此實(shí)驗(yàn)證明了42℃熱療可以導(dǎo)致U251細(xì)胞的死亡，且細(xì)胞死亡以凋亡為主。

Fig.1 Hyperthermia affected the morphology of astroglioma U251 cells during 108 h

Fig.2 Hyperthermia affected the nuclear pyknosis of astroglioma U251 cells

2.2.3熱療通過(guò)Caspase途徑介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞凋亡

在確定熱療可以引起U251細(xì)胞凋亡后，進(jìn)一步明確凋亡的類型。在42℃熱療處理U251細(xì)胞2 d（48 h）后，較對(duì)照組相比發(fā)現(xiàn)，收縮變圓的細(xì)胞往往顯示Caspase-3和Annexin V雙陽(yáng)性（圖4），提示熱療引起的細(xì)胞凋亡是Caspase-3相關(guān)的細(xì)胞凋亡。

2.3 42℃熱療抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞的增殖

通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，在42℃熱療1 d后，U251細(xì)胞基本上處于不再增殖且不斷凋亡的狀態(tài)。在熱療3 d后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，評(píng)價(jià)熱療對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響。發(fā)現(xiàn)無(wú)論是對(duì)于全細(xì)胞數(shù)還是活細(xì)胞數(shù)，42℃熱療組均明顯低于正常溫度（37℃）的對(duì)照組，且活細(xì)胞占比也明顯下降（圖5），這說(shuō)明42℃熱療抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞的增殖。

Fig.3 Hyperthermia induced the apoptosis of astroglioma U251 cells

Fig.4 Hyperthermia might mediate apoptosis of glioma U251 cells via Caspase-3 pathway

Fig.5 Hyperthermia inhibited the proliferation of glioma U251 cells

3 討 論

現(xiàn)在癌癥的發(fā)病率越來(lái)越高，已成為人類最常見的死亡原因之一。2020年全世界有大約1 930萬(wàn)癌癥病例，估計(jì)到2040年這一數(shù)字可能增加到2 840萬(wàn)［5］。國(guó)家癌癥中心最新發(fā)布的《2022年全國(guó)癌癥報(bào)告》顯示，中國(guó)2016年惡性腫瘤新發(fā)病例約406.4萬(wàn)人，死亡約241.4萬(wàn)人。平均每天超過(guò)1萬(wàn)人被確診為癌癥。與歷史數(shù)據(jù)相比，癌癥負(fù)擔(dān)呈持續(xù)上升態(tài)勢(shì)。目前，中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病、死亡數(shù)持續(xù)上升，每年惡性腫瘤所致的醫(yī)療花費(fèi)超過(guò)2 200億［6］?，F(xiàn)有癌癥的治療方法效果有限，手術(shù)治療及放療、化療仍是當(dāng)今腫瘤治療的主流方法。但放療、化療產(chǎn)生的胃腸道反應(yīng)、免疫力低下等副作用嚴(yán)重影響腫瘤的治療及效果。近年來(lái)，艾灸療法作為中國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)的重要組成部分，艾灸對(duì)腫瘤患者的細(xì)胞免疫、體液免疫及放、化療后不良反應(yīng)的改善都有顯著療效，在緩解腫瘤患者的癌痛、胃腸道反應(yīng)、機(jī)體免疫力低下和癌因性疲乏等方面都有顯著療效［7］。

艾灸的第一個(gè)特點(diǎn)是熱。在18世紀(jì)，人們注意到發(fā)燒患者的腫瘤會(huì)縮小。從那時(shí)起，熱療作為一種潛在的癌癥治療方法被廣泛研究［8］。在20世紀(jì)70年代，體外和體內(nèi)研究表明，腫瘤細(xì)胞不能像健康細(xì)胞一樣耐受升高的溫度［9］。國(guó)內(nèi)外的多項(xiàng)研究表明，熱療的抑癌機(jī)制可能是多方面的，包括但不限于幫助克服耐藥性［10］、增加放療敏感性［11］、調(diào)節(jié)血流［12］和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13］。盡管許多研究表明，熱療在癌癥治療中具有積極作用，但這種方法仍存在爭(zhēng)議，其主要問(wèn)題是缺乏熱療的精確腫瘤學(xué)定義并難以標(biāo)準(zhǔn)化［14］。而本研究在42℃下用顯微縮時(shí)攝影技術(shù)長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)觀測(cè)熱療對(duì)U251細(xì)胞的作用，為建立標(biāo)準(zhǔn)化的熱療抑癌范式提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

熱療可以部分解釋艾灸的抑癌機(jī)制，然而這可能不是艾灸抑制癌癥的唯一原因。有學(xué)者認(rèn)為，艾灸效應(yīng)的原理并不僅僅是溫?zé)嵝?yīng)，而是由輻射、藥化、創(chuàng)傷及綜合等效應(yīng)的綜合作用結(jié)果［1］。也有學(xué)者認(rèn)為，艾灸的作用機(jī)理是由艾條燃燒時(shí)所產(chǎn)生的物理和化學(xué)因子作用于腧穴，將刺激信號(hào)傳入中樞，經(jīng)過(guò)整合作用后傳出信號(hào)，調(diào)控機(jī)體神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等，從而調(diào)整機(jī)體的內(nèi)環(huán)境，以達(dá)到防病治病的功效［15］。國(guó)內(nèi)的學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，艾灸能一定程度抑制胃荷瘤大鼠的瘤體增長(zhǎng)，上調(diào)胃部瘤體內(nèi)HSP70 mRNA的表達(dá)，促進(jìn)HSP70的生成及細(xì)胞外釋放，且艾灸相對(duì)于紅外線的作用更明顯［3］，艾灸的第二個(gè)特點(diǎn)是艾草燃燒產(chǎn)生很多揮發(fā)油性的物質(zhì)。這些物質(zhì)的分子質(zhì)量和親脂性可以讓它們比較容易地進(jìn)入人體細(xì)胞中發(fā)揮作用。桉葉油素（1,8-cineole，Eucalyptol）是艾煙的主要成分［16］。本課題組的另外一項(xiàng)研究證實(shí)了1,8-cineole可以調(diào)節(jié)U251細(xì)胞內(nèi)的多條癌癥相關(guān)通路從而起到抑制細(xì)胞增殖的作用。以上研究均說(shuō)明艾灸的抑癌作用是一個(gè)綜合作用，而并不僅僅是熱療作用。

癌癥目前來(lái)說(shuō)是威脅人類健康的第一大疾病，且缺乏有效且安全的治療手段。現(xiàn)階段西醫(yī)治療癌癥的放化療方法并不能有效控制癌癥的發(fā)展和提高病人的生存質(zhì)量。中醫(yī)有著悠久的歷史，在中國(guó)歷經(jīng)了幾千年的驗(yàn)證和積累，形成了一整套有效的醫(yī)藥運(yùn)用方法。艾灸是一種經(jīng)典的中醫(yī)治療手段，集合了物理療法和化學(xué)療法，對(duì)多種癌癥有抑制作用。本研究從熱療的角度揭示艾灸抑制癌癥細(xì)胞增殖的細(xì)胞機(jī)制，為臨床艾灸治療癌癥提供理論基礎(chǔ)，具有一定的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié) 論

通過(guò)以上結(jié)果看到熱療明顯抑制細(xì)胞的增殖，細(xì)胞死亡明顯增加。熱療處理后的U251細(xì)胞較對(duì)照組存在明顯的核固縮，標(biāo)志物Annexin V和PI明顯升高，PI陽(yáng)性細(xì)胞均呈Annexin V陽(yáng)性，說(shuō)明熱療導(dǎo)致的細(xì)胞死亡以細(xì)胞凋亡為主；大部分收縮變圓的細(xì)胞Caspase-3和Annexin V呈共同陽(yáng)性，說(shuō)明熱療可能通過(guò)Caspase途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。從而得出本研究結(jié)論：熱療可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞癌細(xì)胞系U251細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)Caspase途徑相關(guān)的凋亡。

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