黃菊芳 張揚(yáng)武 黎敏航 羅 婷 羅偉生

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西南寧市 530001； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)瑞康臨床醫(yī)學(xué)院， 廣西南寧市 530011)

肝纖維化是肝內(nèi)纖維組織異常增生，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)活化，細(xì)胞外基質(zhì)大量產(chǎn)生、沉積并出現(xiàn)合成與降解失衡，繼發(fā)肝臟自我修復(fù)的動(dòng)態(tài)可逆性病理過程[1]。肝纖維化會(huì)損害肝組織的結(jié)構(gòu)和功能，其若得不到阻抑或逆轉(zhuǎn)則可能進(jìn)展為失代償期肝硬化，并導(dǎo)致各種終末期肝病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生，如消化道出血、感染、肝性腦病、肝腎綜合征等，進(jìn)而嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量和預(yù)后，甚至導(dǎo)致死亡[2]。如在早期階段給予有效的治療，肝纖維化具有可逆性[3]。研究表明，中藥可通過抑制HSC活化[4]與肝內(nèi)炎癥反應(yīng)[5]，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞因子[6]，以及調(diào)控氧化應(yīng)激[7]等方式，發(fā)揮延緩肝纖維化的作用。因此，從中醫(yī)藥中尋找有效的抗肝纖維化藥物具有必要性和重要性。荔枝核為無患子科荔枝屬植物荔枝的干燥成熟種子，味甘、微苦，性溫，歸肝、腎、胃經(jīng)，具有行氣散結(jié)、祛寒止痛的作用[8]。荔枝核的主要成分包括荔枝核皂苷、揮發(fā)油、總黃酮、糖類等[9]。研究表明，荔枝核總黃酮為抗肝纖維化的主要有效活性成分[10-11]。本課題組前期研究提示，荔枝核總黃酮通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)[12]、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1[13]及過氧化物酶體增殖物激活受體γ/c-Ski[14]等信號(hào)通路的表達(dá)來減輕肝細(xì)胞的損傷，達(dá)到抗肝纖維化的作用。但是肝纖維化涉及的細(xì)胞分子機(jī)制極其復(fù)雜，目前荔枝核抗肝纖維化的相關(guān)活性成分有待進(jìn)一步開發(fā)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)旨在研究藥物、疾病、靶標(biāo)三者之間復(fù)雜多樣的關(guān)系，為中醫(yī)藥的傳承創(chuàng)新提供了一種新方法。故本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從整體性的角度對(duì)荔枝核抗肝纖維化作用機(jī)制進(jìn)行探討，為深入研究荔枝核及含荔枝核的中藥復(fù)方的抗肝纖維化作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 檢索荔枝核有效活性成分 以“荔枝核”為檢索詞，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索荔枝核的活性成分，設(shè)定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18作為主要有效活性成分的篩選條件[15]，獲取荔枝核的有效活性成分，并將結(jié)果導(dǎo)入Excel表格。

1.2 預(yù)測(cè)荔枝核主要有效活性成分的作用靶點(diǎn) 采用 Perl 軟件(https://www.perl.org/)對(duì)荔枝核有效成分的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，然后利用UniProt在線蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)查找作用靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.3 篩選肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn) 在GeneCards?數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)、OMIM?數(shù)據(jù)庫(kù) (https://omim.org)中，以“l(fā)iver fibrosis”“fibrosis”“hepatofibrosis”為關(guān)鍵詞獲取肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)。

1.4 獲取荔枝核-肝纖維化靶點(diǎn) 通過微生信網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/)將肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)和荔枝核有效成分的作用靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖，得到荔枝核-肝纖維化靶點(diǎn)，即荔枝核抗肝纖維化的靶點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建“中藥-活性成分-基因靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò) 將1.2獲得的荔枝核主要有效成分的作用靶點(diǎn)和1.4獲得的荔枝核-肝纖維化靶點(diǎn)輸入Perl軟件進(jìn)行映射，然后運(yùn)用CytoScape軟件3.7.0進(jìn)行可視化分析，得到“中藥-活性成分-基因靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 建立蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及篩選核心基因 在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/)中輸入荔枝核-肝纖維化靶點(diǎn)，選擇多種蛋白質(zhì)，限定研究生物為“homosapiens”，將獲得的tsv文件導(dǎo)入CytoScape軟件構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，將tsv的文件輸入R語(yǔ)言軟件3.6.1(https://www.r-project.org/)并運(yùn)行，根據(jù)鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目，得到PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因。

1.7 功能和通路富集分析 將荔枝核-肝纖維化靶點(diǎn)輸入R語(yǔ)言軟件3.6.1，進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析(主要分析生物學(xué)過程)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號(hào)通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 荔枝核的主要有效活性成分 利用TCMSP平臺(tái)檢索到荔枝核的有效成分72個(gè)，根據(jù)設(shè)定的OB和DL進(jìn)行篩選，共獲得荔枝核的有效活性成分 8個(gè)，見表1。

表1 荔枝核的主要有效活性成分

2.2 荔枝核-肝纖維化靶點(diǎn) 獲得荔枝核主要有效活性成分的作用靶點(diǎn)87個(gè)，以及肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)6 899個(gè)，將兩者取交集，得出79個(gè)荔枝核-肝纖維化靶點(diǎn)，包括前列腺內(nèi)過氧化物合酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1,PTGS1)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)、毒蕈堿型乙酰膽堿受體(cholinergic receptor muscarinic,CHRM)3、CHRM1、CHRM2、腎上腺素受體α1A(adrenoceptor alpha 1A，ADRA1A)、煙堿型乙酰膽堿受體α1亞單位(cholinergic receptor nicotinic alpha 1 subunit,CHRNA2)等。見圖1。

圖1 荔枝核-肝纖維化靶點(diǎn)的韋恩圖

2.3 “中藥-活性成分-基因靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò) “中藥-活性成分-基因靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)見圖2，圖中橘色代表肝纖維化，紫色代表荔枝核，藍(lán)色代表荔枝核的主要有效活性成分，黃色代表荔枝核-肝纖維化靶點(diǎn)；由圖2可知，荔枝核主要通過6種有效活性成分(甘露醇、β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、表兒茶素、槲皮素)作用于79個(gè)荔枝核-肝纖維化靶點(diǎn)，從而發(fā)揮干預(yù)肝纖維化的作用。

圖2 中藥-活性成分-基因靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)及核心基因 利用CytoScape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。共篩選出30個(gè)核心基因，根據(jù)鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目由多到少排序?yàn)榘准?xì)胞介素(interleukin,IL)-6、Caspase-3、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、MYC、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)、細(xì)胞周期蛋白(cyclin D1)、FOS、Erb-B2 受體酪氨酸激酶2(Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2,ERBB2)、雄激素受體(androgen receptor,AR)、RELA、過氧化物酶體增生激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)3、孕激素受體(progesterone receptor,PGR)、Caspase-8、陷窩蛋白1(caveolin 1,CAV1)、缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor,HIF)1A、芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,AHR)、細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM1)、Caspase-9、核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(nuclear factor,erythroid 2 like 2,NFE2L2)、核因子κB抑制因子α(nuclear factor kappa-B inhibitor alpha，NFKBIA)、細(xì)胞色素P450家族3亞家族A成員4(cytochrome P450 family 3 subfamily A member 4,CYP3A4)、NAD(P)H苯醌脫氫酶1 [NAD(P)H quinone dehydrogenase 1,NQO1]、RB1、cyclin B1、熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)B1、胰島素生長(zhǎng)因子2(insulin growth factor 2,IGF2)、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(poly ADP-ribose polymerase 1,PARP1)、血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM1)，見圖4。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因

2.5 GO富集分析結(jié)果 荔枝核-肝纖維化靶點(diǎn)共參與了101個(gè)生物學(xué)過程，主要為RNA聚合酶Ⅱ特異性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、核受體的活動(dòng)、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、乙酰膽堿受體的活動(dòng)、類固醇結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、谷胱甘肽結(jié)合、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活動(dòng)等，見圖5。

圖5 GO 功能富集分析柱狀圖

2.6 KEGG通路分析結(jié)果 荔枝核-肝纖維化靶點(diǎn)共涉及74條信號(hào)通路，涉及的信號(hào)通路主要與炎癥途徑密切相關(guān)，如人類巨細(xì)胞病毒感染、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、細(xì)胞凋亡、HIF-1、腫瘤壞死因子、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、EB病毒感染、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、甲型流感、p53等信號(hào)通路。見圖6。

圖6 KEGG通路分析柱狀圖

3 討 論

中醫(yī)藥是一個(gè)多組分的藥物協(xié)同體系，針對(duì)不同疾病具有獨(dú)特的治療作用。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出荔枝核的8個(gè)主要有效活性成分，以及主要有效活性成分的作用靶點(diǎn)87個(gè)；在GeneCards?、OMIM?數(shù)據(jù)庫(kù)中得到肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)6 899個(gè)，與荔枝核主要有效活性成分的作用靶點(diǎn)取交集后，得到荔枝核抗肝纖維化的靶點(diǎn)79個(gè)，荔枝核抗肝纖維化的可能關(guān)鍵成分6個(gè)，分別為槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、甘露醇、谷甾醇、表兒茶素。槲皮素屬于黃酮類天然化合物，廣泛存在于自然界的水果、中草藥及綠葉蔬菜。研究表明，槲皮素具有抗癌[16]、治療糖尿病[17]、抗氧化[18]等作用。Wu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads與PI3K/AKT通路之間的連接來減弱HSC的活化并減少自噬，并促進(jìn)基質(zhì)降解，從而預(yù)防了肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類槲皮素通過抑制巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)并通過靶向(Notch受體1，NOTCH1)途徑調(diào)節(jié)M1型巨噬細(xì)胞極化，從而減輕肝臟炎癥和纖維化。這說明槲皮素可通過抑制HSC的活化而成為抗纖維化的潛在藥物。β-谷甾醇是一種類膽固醇的植物甾醇，可從各種植物中提取獲得。Kim等[21]研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇通過對(duì)肝纖維化基因的mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)水平的調(diào)節(jié)，以減輕肝纖維化小鼠的肝臟損傷并防止膠原蛋白積聚，也可通過抑制氧化應(yīng)激和HSC活化標(biāo)志物來發(fā)揮抗肝纖維化的作用[22]，這表明β-谷甾醇可能是肝纖維化的潛在治療劑。有研究表明，豆甾醇對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有改善作用[23]?？傊笾说亩喾N有效活性成分具有一定的抗肝纖維化作用。

本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)可知，荔枝核抗肝纖維化的核心靶點(diǎn)包括IL-6、Caspase-3、EGFR、VEGFA、MYC、ESR1、cyclin D1、FOS、ERBB2、AR、RELA、PPARG、NOS3、PGR等。有研究表明，通過下調(diào)依賴于IL-17A的IL-6/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3信號(hào)通路可以改善肝纖維化[24]；通過調(diào)節(jié)Caspase-3/活化型Caspase-3蛋白來抑制B細(xì)胞淋巴瘤2蛋白的表達(dá)，可誘導(dǎo)HSC凋亡，達(dá)到預(yù)防肝細(xì)胞損傷的目的[25]；誘導(dǎo)型NOS的表達(dá)水平升高而內(nèi)皮型NOS的表達(dá)水平降低，與肝纖維化中氧化應(yīng)激標(biāo)志物的升高密切相關(guān)[26]；激活蛋白1轉(zhuǎn)錄因子亞基FOS相關(guān)抗原1(FOS like 1,activator protein-1 transcription factor subunit，F(xiàn)ra-1)與肝纖維化有關(guān)[27]。此外，F(xiàn)ra-1的表達(dá)升高可以防止對(duì)乙酰氨基酚引起的肝損傷[28]。由此可見，上述這些靶標(biāo)都有可能是荔枝核抗肝纖維化的主要調(diào)節(jié)因子。

本研究KEGG通路分析結(jié)果顯示，荔枝核抗肝纖維化的靶點(diǎn)涉及p53、PI3K/AKT、HIF-1等信號(hào)通路。p53信號(hào)通路在多種疾病，尤其是腫瘤疾病中起重要作用[28]。肝細(xì)胞中p53信號(hào)的激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而激活HSC，是肝纖維化的啟動(dòng)因子，而抑制p53信號(hào)通路的傳導(dǎo)對(duì)肝細(xì)胞具有保護(hù)作用[29]。p53可促進(jìn)HSC鐵死亡的上游分子，而通過小干擾RNA技術(shù)下調(diào)p53基因可阻斷HSC的鐵死亡，進(jìn)而加重肝纖維化[30]。PI3K/AKT通路參與調(diào)節(jié)HSC活化和增殖、膠原蛋白合成，促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展[31]。體外實(shí)驗(yàn)研究表明，通過下調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路可顯著抑制HSC增殖，其有可能成為臨床抗纖維化治療的靶點(diǎn)[32]。纖維化酶賴氨酰氧化酶是一種分泌型胺氧化酶，可催化細(xì)胞外基質(zhì)中膠原纖維之間共價(jià)交聯(lián)的形成，組織缺氧及其他刺激會(huì)增加纖維化酶賴氨酰氧化酶的表達(dá)，而這一過程主要由HIF-1主導(dǎo)[33]。肝纖維化可能與肝細(xì)胞缺氧相關(guān)，而纖維化酶賴氨酰氧化酶和相關(guān)蛋白可能在肝纖維化的發(fā)展中起到關(guān)鍵作用[34]。

綜上所述，荔枝核抗可能通過甘露醇、β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、表兒茶素、槲皮素等有效活性成分，干預(yù)多靶點(diǎn)、調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路來達(dá)到抗肝纖維化的效果。本研究結(jié)果或可為荔枝核治療肝纖維化提供一定的依據(jù)，也可為臨床抗肝纖維化及中藥的開發(fā)提供一定的思路。然而，本研究仍存在一些不足之處：首先，本研究?jī)H基于肝纖維化的現(xiàn)有靶點(diǎn)進(jìn)行分析，這可能會(huì)遺漏一些作用于新治療靶點(diǎn)的中藥活性成分；其次，本研究不能區(qū)分一種成分是直接與靶點(diǎn)結(jié)合還是間接影響靶點(diǎn)。深入、系統(tǒng)地探討荔枝核抗肝纖維化的機(jī)制研究，以及開展高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)研究，將是今后進(jìn)一步研究的方向。