常曉荊 胡 媛

(1 武漢市第六醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，湖北省武漢市 430014； 2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，湖北省武漢市 430022)

頭頸鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)又稱為頭頸癌，好發(fā)于鼻腔、鼻竇、嘴唇、口腔、唾液腺及喉部等部位[1]，其預(yù)后良好，治愈率高[2]。有研究顯示，頭頸部腫瘤的發(fā)生與遺傳、吸煙、病毒感染等多種因素有關(guān)，吸煙和飲酒是HNSCC發(fā)生的兩大危險(xiǎn)因素，且人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)16感染也與HNSCC的發(fā)生密切相關(guān)[3]。趨化因子屬于小分子細(xì)胞因子家族蛋白[4]。其中，C-X-C基序趨化因子配體(C-X-C motif chemokine ligand，CXCL)9/10對(duì)T淋巴細(xì)胞有趨化作用，可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞，在腫瘤血管形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。本研究探討CXCL9/10在HNSCC中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征、HPV16感染的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年3月至2016年3月武漢市第六醫(yī)院病理科存檔的60例HNSCC組織標(biāo)本和30例相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本(其余30例相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本不可用，故未納入分析)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)HNSCC均經(jīng)病理檢查確診；(2)HNSCC患者的臨床資料完整；(3)HNSCC患者入組前均未接受過(guò)放化療等抗癌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他部位惡性腫瘤者；(2)合并腦部疾病者；(3)復(fù)發(fā)的HNSCC患者。60例HNSCC患者中，男性40例、女性20例，年齡18～<60歲者35例、60～80歲者25例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者22例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例，組織分化程度為：高分化13例、中分化24例、低分化23例；根據(jù)2018年美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)診治指南與美國(guó)癌癥分期聯(lián)合委員會(huì)第8版TNM分期新標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期[6]，Ⅰ～Ⅱ期共31例，Ⅲ～Ⅳ期共29例。本研究經(jīng)過(guò)武漢市第六醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批同意。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HNSCC組織和癌旁組織中CXCL9/10 mRNA表達(dá)水平：取適量HNSCC組織和癌旁組織，使用TRIzol試劑(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：GMS12279)提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海信裕生物科技有限公司，批號(hào)：60906-10)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。CXCL9上游引物序列為5′-AGGGTCGCTGTTCCTGCATC-3′，下游引物序列為5′-TTCACATCTGCTGAATCTGGGTTTA-3′；CXCL10上游引物序列為5′-CTTTCTGACTCTAAGTGGCATTC-3′，下游引物序列為5′-CACCCTTCTTTTTCATTCTAGCAA-3′；GAPDH(內(nèi)參)上游引物序列為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物序列為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板2.5 μL、Taq酶0.3 μL、上下游引物各1 μL、SYBR Premix Ex Taq 5 μL、用雙蒸水補(bǔ)充至25 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃，30 s，72 ℃、15 s，共35個(gè)反應(yīng)循環(huán)。采用PCR儀(濟(jì)南歐萊博技術(shù)有限公司，型號(hào)：LEIA-X4)自動(dòng)分析得出循環(huán)閾值(Ct值)，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算HNSCC組織和癌旁組織中CXCL9 mRNA、CXCL10 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2 免疫組化分析及結(jié)果判定：取適量HNSCC組織和癌旁組織，經(jīng)石蠟包埋后用切片機(jī)以4 μm的厚度連續(xù)切片，隨后用二甲苯對(duì)石蠟切片進(jìn)行脫蠟處理10 min，采用枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，蒸餾水反復(fù)沖洗后加入3%過(guò)氧化物酶，浸泡30 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。然后用PBS沖洗3次，3 min/次；分別加入CXCL9、CXCL10兔抗人單克隆抗體25 μL(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab290643、ab283681；稀釋比例均為1 ∶100)，室溫環(huán)境下孵育過(guò)夜，PBS沖洗5次，3 min/次；加入30 μL通用型二抗(上海威奧生物科技有限公司，批號(hào)：WB6030；稀釋比例為1 ∶500)，室溫環(huán)境下孵育30 min，PBS沖洗5次，3 min/次；使用二氨基聯(lián)苯胺試劑盒(上海吉至生化科技有限公司，批號(hào)：DA1010-10 ml)顯色，PBS反復(fù)沖洗后用蘇木素復(fù)染3 min，最后脫水處理，二甲苯透明，并用中性樹脂封片。在顯微鏡(上海無(wú)陌光學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：WMS-1037)下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×100)進(jìn)行細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分，其中細(xì)胞不染色計(jì)0分，細(xì)胞著淺黃色計(jì)1分，細(xì)胞著黃褐色計(jì)2分，著淺黃色或黃褐色為陽(yáng)性細(xì)胞。并按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比為<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別計(jì)0、1、2、3、4分。細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分的乘積即為總分?？偡帧?判定為表達(dá)陽(yáng)性(+)，總分<1分判定為表達(dá)陰性(-)；總分≥2分定義為高表達(dá)，總分<2分定義為低表達(dá)。

1.2.3 單管實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HNSCC組織HPV16陽(yáng)性率：取適量HNSCC組織，提取總RNA與合成cDNA的方法與1.2.1一致。采用HPV16熒光檢測(cè)試劑盒(無(wú)錫市申瑞生物制品有限公司，批號(hào)：20140928)進(jìn)行HPV16檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系(45 μL)包括cDNA模板2 μL、HPV16反應(yīng)混合液40 μL、Taq DNA聚合酶3 μL。上游引物序列為5′-CCACCCAGAAAGTTACCACA-3′，下游引物序列為5′-TGCAACAAGACATACATCGA-3′。PCR擴(kuò)增條件為37 ℃ 5 min； 94 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共44個(gè)反應(yīng)循環(huán)。采用PCR儀自動(dòng)分析得出Ct值，Ct值≤37為陽(yáng)性，Ct值>37為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HNSCC組織和癌旁組織中CXCL9/10 mRNA表達(dá)水平的比較 HNSCC組織中的CXCL9、CXCL10 mRNA表達(dá)水平均高于癌旁組織(均P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 HNSCC組織和癌旁組織中CXCL9/10 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.2 HNSCC組織和癌旁組織中CXCL9/10的陽(yáng)性表達(dá)情況 免疫組化染色結(jié)果顯示，CXCL9、CXCL10主要位于細(xì)胞質(zhì)，見(jiàn)圖1。CXCL9、CXCL10在HNSCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁組織(均P<0.05)，見(jiàn)圖1和表2。

圖1 免疫組化染色結(jié)果(×100)

表2 HNSCC組織和癌旁組織中CXCL9/10的陽(yáng)性表達(dá)情況[n(%)]

2.3 CXCL9/10表達(dá)水平與HNSCC患者臨床病理特征、HPV16感染情況的關(guān)系 CXCL9、CXCL10高表達(dá)患者中，TNM Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HPV16陽(yáng)性的患者比例均高于CXCL9、CXCL10低表達(dá)患者(均P<0.05)。CXCL9、CXCL10表達(dá)水平與HNSCC患者的年齡、性別、分化程度均無(wú)關(guān)(均P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 CXCL9/10表達(dá)水平與HNSCC患者臨床病理特征、HPV16感染情況的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

大多數(shù)HNSCC起源于頭頸部黏膜鱗狀上皮細(xì)胞，是不同組織學(xué)級(jí)別的鱗狀細(xì)胞癌[7]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年全球約有89萬(wàn)例新發(fā)HNSCC患者，患者總數(shù)較1990年增加了1倍以上，且死亡患者總數(shù)約有50.7萬(wàn)例[8]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，2010年美國(guó)口腔HPV感染率約為6.9%，其中HPV16感染率約為1%[9]?？谇桓腥綡PV與口咽癌病情的加重密切相關(guān)[10]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，HPV感染是導(dǎo)致HNSCC發(fā)生的重要原因[11]。HPV感染機(jī)體后侵入黏膜組織，感染鱗狀上皮基底層細(xì)胞，進(jìn)而造成兩個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子(細(xì)胞周期素依賴激酶和細(xì)胞周期素)失活，導(dǎo)致細(xì)胞周期檢查點(diǎn)失控、細(xì)胞增殖異常及病毒基因組擴(kuò)增[12]。持續(xù)感染HPV的細(xì)胞會(huì)不受控制地增殖，這容易造成DNA損傷和染色體異常，從而增加致癌風(fēng)險(xiǎn)[13]。

趨化因子是與G蛋白偶聯(lián)受體的子集相互作用的小蛋白質(zhì)[14]，在誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞趨化、促進(jìn)白細(xì)胞分化和增殖、引起組織外滲等方面起著關(guān)鍵作用[15]。CXCL9、CXCL10均屬于趨化因子CXC亞族，二者表達(dá)不僅與腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞遷移、分化有一定關(guān)系，還參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡，在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮促癌作用[16-17]。例如，宋雪等[16]報(bào)告，肝內(nèi)膽管癌患者血清CXCL9表達(dá)水平較健康人高，CXCL9表達(dá)異常升高與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度密切相關(guān)，且CXCL9高水平患者的生存率更低；高建等[17]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中CXCL10 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平高于乳腺良性組織，CXCL10參與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的進(jìn)展。還有研究表明，CXCL9/10主要調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞遷移、分化和激活，通過(guò)募集免疫細(xì)胞(如細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)誘發(fā)免疫反應(yīng)[18]。

本研究結(jié)果顯示，HNSCC組織中的CXCL9、CXCL10 mRNA表達(dá)水平及陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁組織(均P<0.05)，提示兩者可能與HNSCC的發(fā)生有關(guān)，檢測(cè)HNSCC患者癌組織中的CXCL9/10表達(dá)水平或陽(yáng)性表達(dá)情況有助于診斷HNSCC。本研究結(jié)果還顯示，CXCL9、CXCL10高表達(dá)患者中TNMⅢ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HPV16陽(yáng)性的患者比例均高于低表達(dá)患者(均P<0.05)，說(shuō)明CXCL9、CXCL10高表達(dá)患者的TNM分期晚，可能伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且感染HPV16的風(fēng)險(xiǎn)更高，臨床可通過(guò)檢測(cè)CXCL9、CXCL10表達(dá)水平評(píng)估HNSCC患者病情，有利于制訂更合適的治療方案，從而改善HNSCC患者的預(yù)后。

綜上所述，CXCL9/10在HNSCC組織中呈高表達(dá)，且CXCL9/10高表達(dá)患者的TNM分期更晚，可能伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且感染HPV16的風(fēng)險(xiǎn)更高。這兩個(gè)指標(biāo)或可為臨床上診治HNSCC提供了新思路。