商健茹 黃光慶 趙 旭 柏 勇 劉 杰

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市人民醫(yī)院急危重癥中心重癥醫(yī)學(xué)科，湖北省十堰市 442000)

膿毒血癥是指一種因感染性因素而導(dǎo)致的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，其中有42%的膿毒血癥患者會出現(xiàn)急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)[1]。膿毒血癥合并AKI患者的病死率高達(dá)70%以上，是單純AKI或單純膿毒血癥患者的5倍[2]。AKI的主要病理機(jī)制是缺血或腎毒性因素而導(dǎo)致腎小管急性壞死[3]。研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷可減少血管灌注及腎小管上皮細(xì)胞供氧和營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，加重腎臟的缺氧缺血，從而導(dǎo)致腎功能損傷[4]。目前，尚缺乏治療AKI的有效方案。因此，尋找治療AKI的有效藥物具有重要意義。鼠尾草酸是迷迭香的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)等藥理作用[5]。研究表明，鼠尾草酸可抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路，改善糖尿病導(dǎo)致的腎損傷[6]。但鼠尾草酸對膿毒血癥所致AKI的作用，目前尚未見到相關(guān)報告。本研究采用盲腸結(jié)扎穿刺法構(gòu)建膿毒血癥AKI大鼠模型，并采用鼠尾草酸進(jìn)行干預(yù)，觀察鼠尾草酸對膿毒血癥所致AKI大鼠模型的腎臟和血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，探討鼠尾草酸對Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)/NF-κB/NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)信號通路的影響，以期為鼠尾草酸的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：50只無特定病原體級SD雄性大鼠由廣州市旭生生物科技有限公司提供[SCXK(粵)2019-0045]，12周齡，體質(zhì)量200～220 g，每籠5只，飼養(yǎng)于(22±2)℃恒溫、50%～60%濕度且無特殊病原體的環(huán)境中，水和食用飼料均經(jīng)滅菌后由大鼠自由攝入。所有動物實驗均通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑和儀器：鼠尾草酸(≥97%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(批號：C117958)；戊巴比妥鈉購自青島捷世康生物科技有限公司(批號：191109)；HE染色液、ECL試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(批號：G1120、PE0010)；SDS-PAGE、RIPA裂解液、PVDF膜均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號：P0690、P0013C、FFP32)；血肌酐和血尿素氮ELISA試劑盒購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司(批號：02161、07531)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑和牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購自美國Thermo Fisher Scientific有限公司(批號：23225、23209)；兔抗鼠NF-κB、NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)α、TLR4、NLRP3、血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)和β-actin單分子抗體及山羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司(批號：ab239882、ab18450、ab217274、ab263899、ab6994、ab199553、ab150077)。CX43型電子顯微鏡購自日本Olympus公司；SAF-680T型酶標(biāo)儀購自上海巴玖實業(yè)有限公司；Experion型電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 模型建立與干預(yù) 采用隨機(jī)數(shù)字表法將實驗大鼠分為健康對照組、模型組、鼠尾草酸低劑量組(50 mg/kg)、鼠尾草酸中劑量組(100 mg/kg)和鼠尾草酸高劑量組(200 mg/kg)，每組10只。除健康對照組外，其他4組大鼠參照文獻(xiàn)[7]建立膿毒血癥所致AKI模型：給予大鼠經(jīng)腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉1.4 mL進(jìn)行麻醉，體溫維持在36.5 ℃～37.5 ℃。麻醉成功后，將大鼠側(cè)臥固定于操作臺，腹部脫毛，碘附消毒后鋪孔巾，腹部正中線做一2 cm切口，暴露盲腸，在回盲瓣1.5 cm的盲腸末端用4-0線結(jié)扎，接著在盲腸遠(yuǎn)端用18號針頭刺穿2次。擠壓盲腸，擠出腸腔內(nèi)少許糞便后將盲腸放入腹腔內(nèi)，用3-0線縫合腹腔。健康對照組大鼠經(jīng)腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉1.4 mL進(jìn)行麻醉，剖腹探查后再以3-0線縫合腹腔。所有大鼠術(shù)后6 h皮下注射1 mL生理鹽水改善循環(huán)。

給藥劑量參考文獻(xiàn)[8]，以羧甲基纖維素鈉溶解鼠尾草酸，配制濃度為50、100、200 mg/kg的鼠尾草酸藥液。在盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)后3 d，分別給予鼠尾草酸低、中、高劑量組大鼠灌胃50、100、200 mg/kg的鼠尾草酸藥液，給予健康對照組、模型組灌胃等量的生理鹽水，1次/d，持續(xù)4周。

1.3 樣本處理 于末次干預(yù)后24 h，采用30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉所有大鼠后對其進(jìn)行腹部解剖，經(jīng)腹主動脈采血8 mL，常溫靜置30 min后，4 ℃下3 000 r/min離心15 min收集血清，用于檢測肌酐、尿素氮水平。然后處死大鼠，經(jīng)腹主動脈反復(fù)灌注預(yù)冷的PBS，當(dāng)腎臟顏色轉(zhuǎn)為白色后取出左側(cè)腎臟，去除包膜，濾紙吸干后沿著腎門沿冠狀面破開，一半放入10%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋及切片，用于觀察腎臟病理形態(tài)，另一半放入液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 腎臟病理形態(tài)學(xué)檢測 將固定于10%多聚甲醛的大鼠腎臟組織制作成5 μm石蠟切片，將切片烤干后進(jìn)行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的酒精中脫水3 min，使用蘇木精染色5 min后流水清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗之后使用0.5%伊紅液染色5 min后，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠腎組織的病理學(xué)變化。采用半定量評分規(guī)則評價腎損傷程度[9]：腎小管有無損傷、腎小管上皮細(xì)胞有無凋亡及刷毛緣有無減少(無=0分，有=1分)，腎小管腔內(nèi)有無擴(kuò)張(無=0分，有=1分)，腎間質(zhì)或腎小球毛細(xì)血管有無充血情況(無=0分，有=1分)，腎間質(zhì)有無管型(無=0分，有=1分)，腎間質(zhì)有無炎癥浸潤(無=0分，有=1分)。計算總分0分為無明顯病變，評分越高表明腎損傷程度越重。

1.5 ELISA檢測血清肌酐和尿素氮水平 根據(jù)ELISA說明書，將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后，依次加入100 μL樣品，孔板覆膜后于37 ℃下進(jìn)行孵育。孵育1 h后，棄去上清液，依次加入抗體工作液和酶結(jié)合液，覆膜后37 ℃孵育30 min。加入顯色液，避光孵育10 min，加入終止液，于酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測各孔吸光度值。每組設(shè)置5個復(fù)孔。

1.6 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)量 取凍存于液氮中的大鼠腎臟組織0.5 mg，采用低溫勻漿儀勻漿30 s，蛋白裂解混懸裂解液[RAPI ∶苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF) ∶磷酸蛋白酶抑制劑體積比為100 ∶1 ∶1]緩沖液裂解蛋白后提取各樣品的總蛋白。采用BCA試劑檢測蛋白質(zhì)的總濃度后，將其變性并儲存于-20 ℃。通過SDS-PAGE分離蛋白后將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜，采用3% BSA常溫封閉膜2 h，TBST洗滌3次，10 min/次。將膜分別放入一抗NF-κB、IκBα、TLR4、NLRP3、vWF和β-actin中(抗體 ∶稀釋液=1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次，10 min/次，放入二抗混懸液(二抗 ∶3% BSA=1 ∶4 000)中，室溫孵育2 h。TBST洗滌3次，10 min/次，使用ECL孵育1～3 min，放入化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行顯影。通過ImageJ軟件分析灰度值，以β-actin為內(nèi)參計算目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腎臟組織病理形態(tài)學(xué)的比較 健康對照組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)完整，無損傷。模型組大鼠腎組織水腫，可見炎性細(xì)胞浸潤，腎小球皺縮，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，腎小管管腔變窄。與模型組比較，鼠尾草酸低、中、高劑量組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)趨于完整，炎性細(xì)胞浸潤減少，存在輕度腎組織水腫現(xiàn)象，腎小球皺縮恢復(fù)，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)趨于正常，腎小管管腔變大，腎臟組織病理損傷不同程度減輕，其中高劑量組減輕程度最為明顯。模型組腎臟組織病理損傷評分高于健康對照組(P<0.05)；與模型組比較，鼠尾草酸低、中、高劑量組腎臟組織病理損傷評分均降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見表1。

圖1 各組大鼠腎臟HE染色結(jié)果(×200)

表1 各組大鼠腎臟病理損傷評分的比較(x±s，分)

2.2 各組大鼠腎組織中vWF表達(dá)量的比較 與健康對照組比較，模型組大鼠腎組織中vWF表達(dá)量增加(P<0.05)。與模型組比較，鼠尾草酸低、中、高劑量組vWF表達(dá)量均降低(均P<0.05)，但各劑量鼠尾草酸組vWF蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表2和圖2。

表2 各組大鼠腎組織中vWF蛋白相對表達(dá)量的比較(x±s)

圖2 各組大鼠腎組織中vWF蛋白的表達(dá)情況

2.3 各組大鼠血清肌酐和尿素氮水平的比較 與健康對照組比較，模型組血清肌酐和尿素氮水平增加(P<0.05)。與模型組比較，鼠尾草酸低、中、高劑量組血清肌酐和血尿素氮水平均降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清肌酐和尿素氮水平的比較(x±s)

2.4 各組大鼠腎組織中TLR4、NF-κB、NLRP3、IκBα蛋白表達(dá)量的比較 與健康對照組比較，模型組大鼠腎組織中TLR4、NF-κB和NLRP3蛋白表達(dá)量均增加(均P<0.05)，IκBα蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)。與模型組比較，鼠尾草酸低、中、高劑量組TLR4、NF-κB和NLRP3蛋白表達(dá)量均降低(均P<0.05)，IκBα蛋白表達(dá)量均增加(P<0.05)，但鼠尾草酸各劑量組的NF-κB、IκBα、TLR4和NLRP3表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表4，圖3。

表4 各組大鼠腎組織中TLR4、NF-κB、NLRP3、IκBα蛋白表達(dá)量的比較(x±s)

圖3 各組大鼠腎組織中TLR4、IκBα、NF-κB、NLRP3蛋白表達(dá)情況

3 討 論

AKI的主要臨床癥狀是尿量減少、腎小球濾過率降低、血清肌酐和尿素氮水平增加、腎小管上皮損傷，在短時間內(nèi)可誘發(fā)包括腎臟等多器官功能衰竭[10]。AKI病情發(fā)展迅速，病死率高，預(yù)后差[11]。膿毒血癥是誘發(fā)AKI的主要原因之一[12]。目前認(rèn)為膿毒血癥引起AKI的主要因素是炎性介質(zhì)釋放增加、凝血功能異常、腎缺血再灌注、內(nèi)毒素釋放和細(xì)胞壞死，而血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化是膿毒血癥致AKI發(fā)生的重要血液動力學(xué)因素，主要機(jī)制是內(nèi)皮細(xì)胞受損、血管擴(kuò)張因子減少、血管內(nèi)壁結(jié)構(gòu)完整性被破壞導(dǎo)致腎微循環(huán)功能障礙[13]。

盲腸結(jié)扎穿孔法制備的膿毒血癥模型是目前公認(rèn)的與臨床相關(guān)性較強(qiáng)的膿毒血癥急性腎損傷模型。本研究根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[7]采用盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒血癥模型，結(jié)果顯示，與健康對照組比較，模型組大鼠腎組織水腫，可見炎性細(xì)胞浸潤，腎小球皺縮，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，腎小管管腔變窄。血清肌酐和尿素氮水平明顯增加，說明模型組大鼠的腎功能受損。vWF在止血和血栓形成過程中有重要作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，機(jī)體產(chǎn)生大量vWF，形成微血栓，導(dǎo)致微循環(huán)障礙[14]。因此，vWF可作為血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，與健康對照組比較，模型組大鼠腎組織中vWF蛋白表達(dá)量增加(P<0.05)，與以往研究結(jié)果[15]相似，上述結(jié)果說明本研究的膿毒血癥所致AKI大鼠模型構(gòu)建成功。

鼠尾草酸是酚型二萜類化合物，是迷迭香的強(qiáng)氧化劑[16]。研究表明，鼠尾草酸可降低慶大霉素誘導(dǎo)的AKI大鼠血清中肌酐和尿素氮水平，改善腎臟損傷[8]。此外，鼠尾草酸還可減輕順鉑誘導(dǎo)的大鼠腎臟損傷[17]。但鼠尾草酸對膿毒癥所致AKI的影響目前尚不清楚。本研究使用鼠尾草酸干預(yù)膿毒血癥致AKI大鼠模型，結(jié)果顯示，鼠尾草酸能減輕膿毒血癥致AKI大鼠模型的腎臟損傷，下調(diào)其血清肌酐、尿素氮及vWF蛋白的水平，說明鼠尾草酸對膿毒血癥致AKI大鼠模型具有積極的治療作用，可以抑制缺血缺氧引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而發(fā)揮保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。本研究結(jié)果還顯示，鼠尾草酸對膿毒血癥致AKI大鼠模型腎組織損傷及血清肌酐、尿素氮水平的改善作用具有劑量依賴性，高劑量鼠尾草酸的干預(yù)效果更明顯。而隨著鼠尾草酸劑量的增加，膿毒血癥致AKI大鼠模型腎臟組織中的vWF蛋白表達(dá)量降低，但各劑量間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明低劑量的鼠尾草酸即可有效減輕膿毒癥AKI大鼠腎血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。這些研究結(jié)果為鼠尾草酸保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞提供了理論依據(jù)。

TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路是機(jī)體調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡、氧化應(yīng)激及免疫炎癥等的主要信號通路，在AKI的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的調(diào)控作用[18]。TLR4的激活可促進(jìn)NF-κB蛋白向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移[19]。在正常情況下，細(xì)胞質(zhì)中的NF-κB蛋白二聚體與IκBα結(jié)合形成復(fù)合物，當(dāng)IκBα磷酸化失活后，NF-κB被活化并移位至細(xì)胞核，誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的表達(dá)[20]。研究表明，NLRP3在膿毒血癥AKI模型中起著非常重要的作用，其通過激活NF-κB信號通路進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重臟器損傷，可成為治療腎損傷的新靶點[21]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，鼠尾草酸低、中、高劑量組TLR4、NF-κB和NLRP3蛋白表達(dá)量均降低(均P<0.05)，IκBα蛋白表達(dá)量增加(P<0.05)，說明鼠尾草酸可以抑制TLR4、NF-κB和NLRP3蛋白的表達(dá)，促進(jìn)IκBα的表達(dá)，提示鼠尾草酸可通過阻礙TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路的傳導(dǎo)，減輕血管內(nèi)皮損傷，從而保護(hù)腎臟功能。但鼠尾草酸各劑量組NF-κB、IκBα、TLR4和NLRP3蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，由此可見低劑量鼠尾草酸即可發(fā)揮調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路的作用，但高劑量鼠尾草酸對腎的保護(hù)作用更具優(yōu)勢。

綜上所述，鼠尾草酸對膿毒血癥致AKI大鼠模型具有較好的腎臟保護(hù)作用，其主要機(jī)制可能與改善血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，以及抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路有關(guān)。本研究還存在一定不足，后續(xù)需深入研究鼠尾草酸干預(yù)膿毒血癥致AKI的藥理機(jī)制及相關(guān)劑量關(guān)系。