趙向紅

（山東省菏澤市定陶區(qū)畜牧服務(wù)中心，山東菏澤 274100）

非洲豬瘟疫情于1921年在肯尼亞被首次報(bào)道，1957年傳入西歐及拉美國(guó)家后才開(kāi)始引起世人的關(guān)注，2007年以來(lái)，疫情在多個(gè)國(guó)家相繼發(fā)生，2017年3月，俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)發(fā)生的非洲豬瘟疫情與我國(guó)僅距1 000 km。2018年沈陽(yáng)市沈北新區(qū)首次發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)非洲豬瘟病例，此后，疫情在我國(guó)31個(gè)省份快速點(diǎn)狀發(fā)生，至2019年底，我國(guó)共報(bào)告非洲豬瘟疫情160余起，捕殺、銷(xiāo)毀生豬超過(guò)120萬(wàn)頭，對(duì)國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重威脅?？蒲泄ぷ髡咄ㄟ^(guò)對(duì)非洲豬瘟病毒的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些與病毒致病相關(guān)的蛋白，通過(guò)對(duì)已知蛋白的解析，以期為非洲豬瘟疫情防控提供參考。

1 非洲豬瘟病毒

非洲豬瘟病毒（ASFV）是唯一的雙股蟲(chóng)媒大核DNA病毒，形態(tài)呈對(duì)稱(chēng)的二十面體，直徑約200 nm，堿基數(shù)約為17～19萬(wàn)個(gè)，其中包括開(kāi)放閱讀框151～167個(gè)，編碼多種蛋白質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)蛋白和免疫調(diào)節(jié)蛋白。病毒核內(nèi)膜為單一脂膜，含p54、p22、p30等蛋白，核衣殼主要為結(jié)構(gòu)蛋白p72，目前僅研究出68種結(jié)構(gòu)蛋白的功能，其中參與復(fù)制的蛋白約30個(gè)，其余為參與誘導(dǎo)凋亡、破壞凝血、病毒吸附、免疫逃逸等，大多數(shù)ASFV基因的功能還是處于未知狀態(tài)，使新的疫病防控策略受到嚴(yán)重制約。因此，深入研究ASFV的致病基因成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

2 非洲豬瘟病毒研究現(xiàn)狀

2.1 檢測(cè)技術(shù)

非洲豬瘟疫情給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)的損失較大，目前仍沒(méi)有疫苗可以防控，只能依靠完善的生物安全防控來(lái)阻斷疫情發(fā)生。在防控非洲豬瘟疫情方面，主要通過(guò)對(duì)生豬、豬場(chǎng)內(nèi)部環(huán)境、工作人員等的早期病毒檢測(cè)來(lái)進(jìn)行早期清除。為了精確監(jiān)測(cè)非洲豬瘟病毒，對(duì)病毒的檢測(cè)技術(shù)要求也較高，我國(guó)于2020年12月14日由國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)共同發(fā)布了《非洲豬瘟診斷技術(shù)》[1]（GB/T 18648-2020）新版國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，代替GB/T 18648-2002，并于2020年12月14日正式實(shí)施，新標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了非洲豬瘟的臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷方法。

非洲豬瘟的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，從被檢靶標(biāo)物質(zhì)的分子水平上可以分為3大類(lèi)，即核酸檢測(cè)法、病毒檢測(cè)法和抗體檢測(cè)法。其中，核酸檢測(cè)法是指檢測(cè)ASFV的一段編碼為p72的蛋白基因序列，包括普通PCR法、熒光定量PCR法和熒光RAA法。病毒檢測(cè)法主要利用高敏熒光免疫分析法和夾心ELISA抗原檢測(cè)法檢測(cè)靶標(biāo)完整的病毒顆粒。核酸和病毒檢測(cè)方法中任何一種檢測(cè)陽(yáng)性，均可診斷為ASF病例；但當(dāng)檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)，服從熒光定量PCR法和熒光RAA法中的任何一種陽(yáng)性結(jié)果。抗體檢測(cè)法中被檢病毒的結(jié)構(gòu)蛋白抗體為p54和p30特異性抗體，包括間接ELISA抗體檢測(cè)法、阻斷ELISA抗體檢測(cè)法和夾心ELISA抗體檢測(cè)法3種酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法和間接免疫熒光法，任何一項(xiàng)檢測(cè)陽(yáng)性，均可診斷為抗體陽(yáng)性；但當(dāng)檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)，所有檢測(cè)結(jié)果服從間接免疫熒光法。

ASF病原檢測(cè)簡(jiǎn)單易操作[2]，但耗時(shí)較長(zhǎng)，還常因一些人為因素影響結(jié)果，不適宜做現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)行的核酸檢測(cè)方法，優(yōu)點(diǎn)是時(shí)間短、靈敏度高，但對(duì)操作的環(huán)境條件（如溫度、濕度等）要求嚴(yán)格。膠體金免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸附法等血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)利用抗原—抗體結(jié)合物的檢測(cè)，靈敏度高、檢測(cè)速度快，易于觀(guān)察、特異性強(qiáng)，但有制備抗體時(shí)間長(zhǎng)、成本高、不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。操作簡(jiǎn)便快捷、成本低廉、結(jié)果高效準(zhǔn)確及多種診斷方法聯(lián)合應(yīng)用將是今后疫病診斷的發(fā)展方向。

2.2 病毒研究

由于非洲豬瘟疫情在國(guó)內(nèi)的擴(kuò)散和蔓延，防控和凈化將是未來(lái)一個(gè)時(shí)期豬場(chǎng)的重點(diǎn)工作，快速、科學(xué)的早期診斷技術(shù)對(duì)控制和預(yù)防非洲豬瘟非常重要。目前的研究表明，ASFV較好的抗原表位蛋白產(chǎn)生的抗體滴度高，維持時(shí)間長(zhǎng)，全球?qū)SFV研究大多集中在p22、p30、p54、p72、CD2v等結(jié)構(gòu)蛋白方面。

2.2.1 關(guān)于p22蛋白

p22是非洲豬瘟病毒感染后早期產(chǎn)生的主要結(jié)構(gòu)蛋白，位于ASFV顆粒的內(nèi)膜和感染細(xì)胞的表面，能被非離子去污劑從病毒表面溶解釋放。有研究表明[3]，非洲豬瘟病毒p22可以與參與不同細(xì)胞通路的幾種宿主蛋白相互作用，這些通路有助于病毒感染過(guò)程的內(nèi)吞作用，與非洲豬瘟病毒體外和體內(nèi)復(fù)制過(guò)程中的幾個(gè)關(guān)鍵功能有關(guān)。但是，p22基因缺失不會(huì)影響ASFV的復(fù)制及病毒毒力。還有研究表明p22同時(shí)可以誘導(dǎo)豬產(chǎn)生體液免疫及細(xì)胞免疫。顏世君等[3]利用某桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)非洲豬瘟病毒p22蛋白，制備抗p22蛋白單克隆抗體，成功得到可溶性的重組p22蛋白，鑒定結(jié)果表明，重組p22蛋白可以特異地與非洲豬瘟病毒陽(yáng)性血清反應(yīng)，它的研究將為亞單位疫苗及診斷試劑開(kāi)發(fā)提供一定的幫助。

2.2.2 關(guān)于p30蛋白

P30蛋白是最具抗原性的蛋白之一，常在感染后的2～4 h表達(dá)，12 h后合成減少，能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，在整個(gè)感染期都能檢測(cè)到，是ASFV重要的結(jié)構(gòu)蛋白。我國(guó)新修定的ASFV檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中，檢測(cè)時(shí)的包被抗體是P30蛋白單克隆抗體，酶標(biāo)抗體是辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的P30蛋白單抗[4]，這種檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，可降低假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)，廣泛應(yīng)用于血清學(xué)的檢測(cè)。

2.2.3 關(guān)于p54蛋白

p54蛋白是病毒入侵豬體后表達(dá)的早期膜蛋白，位于病毒的內(nèi)囊膜，也是研究較多的蛋白之一，免疫原性較好，結(jié)構(gòu)保守，在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生時(shí)間早、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，在病毒的吸附和入侵中具有重要作用。p54蛋白可直接與動(dòng)力蛋白結(jié)合，形成病毒跨膜結(jié)構(gòu)域，實(shí)現(xiàn)病毒在胞質(zhì)內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)?？梢愿鶕?jù)p54蛋白特性建立一系列非洲豬瘟病毒的ELISA檢測(cè)方法，如曹琛福等[5]基于p54蛋白建立了阻斷ELISA抗體檢測(cè)法，也可以制作基于p54蛋白的單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA）。p54蛋白能引發(fā)強(qiáng)的IgG免疫應(yīng)答，能檢測(cè)到IgG反應(yīng)又能檢測(cè)到IgM，戴建華等[6]建立了基于p54蛋白的非洲豬瘟抗體膠體金的檢測(cè)方法，且該方法快速實(shí)用。同時(shí)，研究結(jié)果表明建立的膠體金試紙條能作為非洲豬瘟抗體的快速檢測(cè)方法，可用于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查和無(wú)癥狀感染豬的篩查。

此外，P30蛋白和p54蛋白在非洲豬瘟病毒感染過(guò)程中具有相似的作用，常將二者聯(lián)合用于研制亞單位疫苗，同時(shí)也是DNA疫苗的靶標(biāo)抗原。如Sanna等[7]利用p30蛋白和p54蛋白研發(fā)的非洲豬瘟疫苗的保護(hù)率有50%，高于任何用p30蛋白（疫苗保護(hù)率0）或p54蛋白（疫苗保護(hù)率0）制備的疫苗。

2.2.4 關(guān)于p72蛋白

P72蛋白產(chǎn)生在病毒感染后的晚期，其免疫原性好、保守性較強(qiáng)，是病毒主要的核衣殼蛋白，具有高度抗原性和免疫原性，常常用于診斷和疫苗研制[8,9]。如王彩霞等[10]以抗ASFV p72蛋白的特異性單克隆抗體為檢測(cè)抗體，建立了特異性檢測(cè)ASFV抗體的阻斷ELISA方法。Borca等[11]利用人胚胎腎細(xì)胞表達(dá)的 ASFV B646L（p72）制備的亞單位疫苗，免疫豬后發(fā)現(xiàn)抗原蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)。Lokhandwala等[12]構(gòu)建了表達(dá)p72的重組腺病毒表達(dá)載體疫苗，使用該疫苗免疫豬只后，發(fā)現(xiàn)疫苗能夠誘導(dǎo)豬機(jī)體產(chǎn)生高水平的特異性體液，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。

2.2.5 關(guān)于CD2v蛋白

CD2v蛋白作為非洲豬瘟病毒的外膜糖蛋白，由402個(gè)氨基酸構(gòu)成，它的結(jié)構(gòu)類(lèi)似于T淋巴細(xì)胞表面黏附受體CD2，因?yàn)樨i紅細(xì)胞表面有CD2受體，因此，ASFV極易被吸附在紅細(xì)胞表面，協(xié)助紅細(xì)胞結(jié)合到感染細(xì)胞，與胞外病毒粒子一起促進(jìn)病毒擴(kuò)散。CD2v蛋白的C端能幫助病毒定位，促進(jìn)病毒復(fù)制，增加ASFV在宿主體內(nèi)的傳播，王曼等[13]研究發(fā)現(xiàn)CD2v蛋白可以抑制淋巴細(xì)胞增殖，參與病毒的復(fù)制與傳播和免疫逃逸機(jī)制。CD2v蛋白結(jié)構(gòu)和功能的解析促進(jìn)了它的應(yīng)用研究，是目前ASFV疫苗研究的熱點(diǎn)，以CD2v為靶點(diǎn)研制的減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗和病毒載體疫苗均有問(wèn)世，且具有較大的開(kāi)發(fā)前景。

2.2.6 核酸適配體

近年來(lái)，由于核酸適配體成本低、穩(wěn)定性好，常用作病毒的體外篩選，且在諸多領(lǐng)域均有關(guān)注。Spinach是一種類(lèi)似增強(qiáng)綠色熒光蛋白的核酸適配體，該核酸適配體能夠與熒光染料結(jié)合而產(chǎn)生熒光，且細(xì)胞通透性強(qiáng)，是目前研究DNA和RNA體外組裝的主要染料指示劑。韓程程等[14]以非洲豬瘟病毒的編碼保守蛋白p54的基因序列片段為檢測(cè)目標(biāo)，結(jié)合點(diǎn)亮Spinach RNA適配體的開(kāi)關(guān)功能，運(yùn)用Spinach—p54的嵌合式RNA適配體，特異地結(jié)合目標(biāo)序列并產(chǎn)生熒光，實(shí)現(xiàn)了在RNA水平上對(duì)非洲豬瘟病毒的快速檢測(cè)。

除上述幾種非洲豬瘟病毒的熱點(diǎn)蛋白外，病毒的A104R、B602L和K205R等基因[15]也都可作為靶抗原，用于疫苗的研制，但由于細(xì)胞的免疫保護(hù)率數(shù)據(jù)不足影響了疫苗的研發(fā)。深入探索ASFV保護(hù)性抗原與現(xiàn)有病毒多樣性之間的關(guān)系，有助于亞單位疫苗的研發(fā)。

3 結(jié)語(yǔ)

非洲豬瘟病毒已經(jīng)在我國(guó)形成了較大范圍的污染，防控和凈化將是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程。撲殺感染豬只和生物安全措施的防控作用較有限，目前亟需安全有效的疫苗控制非洲豬瘟疫情。但是人們對(duì)ASFV的免疫機(jī)理和免疫逃逸機(jī)制的認(rèn)識(shí)和研究還有一定的局限性，阻礙著疫苗的研發(fā)進(jìn)程。此外，非洲豬瘟病毒在長(zhǎng)時(shí)間流行和傳播過(guò)程中存在毒力減弱趨勢(shì)[16]，未來(lái)臨床中癥狀溫和、乃至無(wú)臨床癥狀感染的非洲豬瘟病例可能出現(xiàn)，“耐過(guò)豬”難以被及時(shí)發(fā)現(xiàn)，使防控形勢(shì)更加復(fù)雜。因此，快速、準(zhǔn)確、便捷的診斷技術(shù)是控制和預(yù)防非洲豬瘟疫情的重要手段，解析ASFV的特點(diǎn)，研制出安全、有效的疫苗是目前防控形勢(shì)的迫切要求。