周婷婷 劉 帥

（1新疆維吾爾自治區(qū)牧業(yè)信息中心，烏魯木齊 830000；2新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊 830000）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus,PCV）是單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA病毒，為無(wú)囊膜的二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，屬圓環(huán)病毒科（circovirdae）、圓環(huán)病毒屬（circovirus）成員[1]。目前可以將豬圓環(huán)病毒分為豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬圓環(huán)病毒3型（PCV3）以及2019年在我國(guó)湖南某豬場(chǎng)新鑒定的豬圓環(huán)病毒4型（PCV4）[2]。PCV基因組大小約為1 700～2 000 kb，主要編碼Rep蛋白和Cap蛋白，根據(jù)PCV的Cap蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析是劃分PCV基因型的有力工具。目前，PCV2主要流行的基因亞型為PCV2a、PCV2b以及PCV2d，而相關(guān)研究表明全球的PCV2流行情況已經(jīng)由PCV2b向PCV2d轉(zhuǎn)變[3-5]。而PCV3也存在多種亞型，主要為PCV3a、PCV3b以及 PCV3c[6]。PCV4在進(jìn)化關(guān)系上與水貂圓環(huán)病毒（MiCV）最近。PCV3和PCV4的報(bào)道讓臨床上感染PCV的情況變得復(fù)雜，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的危害。

在致病性方面，PCV1無(wú)致病性，而PCV2的致病性較高，主要引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）等一系列豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病，PCV2感染可以使豬出現(xiàn)免疫抑制，導(dǎo)致疫苗免疫失敗的發(fā)生，造成其他病原的繼發(fā)感染。PCV3首次于2016年在美國(guó)報(bào)道[7]，當(dāng)?shù)啬肛i出現(xiàn)繁殖障礙和皮炎腎?。≒DNS）問(wèn)題，經(jīng)相關(guān)病原的測(cè)序及分析，將該新型病毒歸類(lèi)為PCV3型，隨后PCV3在世界范圍內(nèi)被相繼報(bào)道。PCV4在患有呼吸道疾病、腸炎和PDNS的豬群中首次被鑒定[7]。因此，了解PCV感染所造成的臨床癥狀，建立高通量，快速的抗原、抗體檢測(cè)方法具有重要的意義。近年來(lái)，科研工作者建立了許多新的檢測(cè)PCV的方法，對(duì)于PCV致病機(jī)理的了解也越來(lái)越深入。因此，本文匯總了PCV感染所引起患病豬的臨床癥狀以及近幾年新建立的針對(duì)PCV的核酸檢測(cè)技術(shù)，以期對(duì)臨床上根據(jù)不同情況和應(yīng)用方向來(lái)選擇合適的檢測(cè)方法提供參考。

1 宏基因組測(cè)序分析

宏基因組是指特定環(huán)境中全部微生物的總DNA或RNA。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，病毒宏基因組學(xué)和高通量測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing,NGS）已能夠廣泛應(yīng)用于病毒的檢測(cè)和鑒定。運(yùn)用NGS對(duì)臨床樣品中存在的幾乎所有微生物的基因組片段進(jìn)行測(cè)序，然后根據(jù)可公開(kāi)獲得的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行重新組裝，鑒定出樣品中存在的核苷酸序列。PCV3的鑒定得益于這種技術(shù)，2016年美國(guó)當(dāng)?shù)氐幕疾∧肛i出現(xiàn)PNDS和木乃伊胎癥狀，而通過(guò)PCR鑒定PCV2以及PRRSV等病原的核酸為陰性，Palinski等將[7]相關(guān)病料進(jìn)行宏基因組測(cè)序，組裝獲得了2 000 bp的與PCV2相近的核苷酸序列，并通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增鑒定引起這些臨床癥狀的病原為PCV3。Franzo[8]等運(yùn)用宏基因組學(xué)方法在患有仔豬斷奶發(fā)育不全綜合征（periweaning failure-to-thrive syndrome,PFTS）的豬群中檢測(cè)出PCV3。此外，也檢測(cè)到了PPV6、BoPV2的廣泛存在。Blomstrom等[9]利用宏基因組測(cè)序分析技術(shù)探究了健康豬和患有PWMS的豬體內(nèi)病毒的共感染情況，發(fā)現(xiàn)PCV2、TTSuV1、TTSuV2廣泛存在于患有PMWS豬體內(nèi)，然而這些病毒在健康豬體內(nèi)也同樣存在，但其含量相對(duì)較少。此外，該研究還鑒定了一種新型非典型豬瘟病毒（APPV）存在于歐洲患有PMWS豬的體內(nèi)。Sun等[10]通過(guò)宏基因組測(cè)序分析，對(duì)我國(guó)1996—2016年的病料進(jìn)行了PCV3的回溯性研究，發(fā)現(xiàn)最早于1996年我國(guó)的豬群中就已經(jīng)存在PCV3。

2 多重PCR

多重PCR是通過(guò)在一個(gè)PCR體系中添加多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)。相比于普通PCR，多重PCR具有快速鑒別診斷不同病原的優(yōu)勢(shì)，大大縮短了核酸檢測(cè)時(shí)間和試劑消耗。Zhang等[11]建立的雙重納米PCR方法鑒別診斷PCV2和PCV3，其對(duì)于PCV2的檢測(cè)限為9.32×101拷貝/μL，PCV3的檢出限為9.16×101拷貝/μL，其靈敏度比普通雙重PCR方法靈敏100倍，且擴(kuò)增不會(huì)出現(xiàn)其他雜帶。Yang等[12]建立了檢測(cè)PCV的多重PCR，該方法對(duì)PCV1、PCV2或PCV3的檢出限均為10拷貝/μL，通過(guò)擴(kuò)增條帶大小的不同鑒定檢測(cè)結(jié)果。Liu等[13]建立了多重PCR檢測(cè)和鑒別豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬A型輪狀病毒（RVA）、豬C型輪狀病毒（RVC）和豬圓環(huán)病毒2（PCV2）等5種豬腹瀉相關(guān)病毒，多重PCR的檢測(cè)限為50拷貝。運(yùn)用該方法檢測(cè)了69個(gè)田間樣品，其中PCV2的陽(yáng)性率為37.7%、PEDV和RVC為4.3%、TGEV為2.9%、RVA為1.4%。

3 熒光定量PCR

熒光定量PCR是近幾年來(lái)常用的臨床檢測(cè)病毒的一種方法，通過(guò)熒光信號(hào)不斷累積而實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR過(guò)程，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的PCR方法。目前有SYBR GreenⅠ染料法和TaqMan探針?lè)?，其中染料法操作?jiǎn)便，而探針?lè)ǜ犹禺悺enriques等[14]建立了基于TaqMan探針的實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)樣品中的PCV2 ORF1基因，該測(cè)定法可以檢測(cè)至少3個(gè)質(zhì)?？截悺＠顣苑频萚15]建立了檢測(cè)PCV3的TaqMan-MGB熒光定量PCR方法，其質(zhì)粒檢測(cè)范圍為4.78×101～4.78×109拷貝/μL，較常規(guī)PCR方法的敏感度高100倍。Chen[16]建立了基于SYBR GreenⅠ的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法用于PCV3的檢測(cè)。

此外，雙重或多重?zé)晒舛縋CR是在臨床上同時(shí)檢測(cè)多種病毒的有力工具。Wang等[17]建立了多重qPCR檢測(cè)方法用于檢測(cè)和區(qū)分PCV3和PCV2。確定為每個(gè)反應(yīng)質(zhì)粒拷貝的檢測(cè)下限（LOD），PCV3為17拷貝，PCV2為14拷貝。Li等[18]建立了檢測(cè)PCV2和PCV3的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，該方法對(duì)PCV2質(zhì)粒的敏感性為2.9拷貝，對(duì)PCV3質(zhì)粒的敏感性為22.5拷貝，運(yùn)用該方法檢測(cè)340份臨床樣品，其中PCV2與PCV3的混合感染率為27.6%。Kim等[19]建立了用于PCV2和PCV3快速鑒別診斷的多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，檢出限均在PCV2和PCV3靶基因的50個(gè)拷貝以下。運(yùn)用該方法檢測(cè)國(guó)內(nèi)某豬場(chǎng)的PCV感染情況，結(jié)果顯示PCV2和PCV3單獨(dú)感染率分別為21.7%和6.5%，而PCV3與PCV2混合感染率為28.3%。Zhao等[20]建立了基于TB GreenⅡ的雙重qPCR以檢測(cè)PCV2和PCV3，對(duì)于PCV2和PCV3的檢出限分別為10和78拷貝/μL。該方法檢測(cè)了56個(gè)組織樣本，PCV2與PCV3共感染率為39.28%（22/56）。這些熒光定量PCR方法的建立可以用來(lái)對(duì)PCV2和PCV3進(jìn)行快速的調(diào)查，以監(jiān)測(cè)它們?cè)谪i場(chǎng)中的流行情況。

4 環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法是一種快速而簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法，可適用于實(shí)驗(yàn)室診斷和田間檢測(cè)，該方法只需常規(guī)水浴或熱阻即可進(jìn)行反應(yīng)。Zhou等[21]建立了用于快速檢測(cè)PCV2 ORF2基因的LAMP方法。在63℃下60 min即可完成擴(kuò)增，檢測(cè)限接近DNA質(zhì)粒的1個(gè)拷貝，比PCR更加靈敏。Park等[22]開(kāi)發(fā)了一種使用羥基萘酚藍(lán)的LAMP分析方法，用于快速可視化檢測(cè)PCV3 Cap基因，擴(kuò)增可以在62℃下40 min內(nèi)完成，并且可以用肉眼目測(cè)檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)限為50個(gè)PCV3 DNA拷貝，與qPCR的拷貝數(shù)相當(dāng)。Zheng等[23]建立的LAMP方法檢測(cè)PCV3，在60℃水浴60 min即可完成擴(kuò)增。該方法檢測(cè)極限約為1×101拷貝。Wang等[24]建立了檢測(cè)PCV3的LAMP方法，其檢測(cè)限為1×101拷貝/μL。因此，RT-LAMP比常規(guī)PCR靈敏度更高，操作更加簡(jiǎn)便。

5 聚合酶螺旋反應(yīng)

聚合酶螺旋反應(yīng)（PSR）同樣屬于一種恒溫?cái)U(kuò)增核酸的方法，其原理是運(yùn)用一對(duì)寡核苷酸引物，在引物的5’端添加互為反向的核苷酸片段，在恒溫條件下使目的基因螺旋式延伸，從而完成核酸的擴(kuò)增。Ji等[25]建立的PSR可以在62℃水浴50 min即可精確擴(kuò)增PCV3基因組。可以通過(guò)凝膠電泳或使用包含酚紅和甲酚紅指示劑的染料進(jìn)行結(jié)果鑒定，檢測(cè)極限為1.13×102拷貝/μL，特異性良好，運(yùn)用PSR檢測(cè)臨床樣品中的PCV3，其陽(yáng)性檢出率要高于RT-LAMP檢測(cè)。

6 原位雜交技術(shù)

原位雜交技術(shù)（in situ hybridization,ISH）是利用設(shè)計(jì)的探針與組織或細(xì)胞上待測(cè)核酸互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合形成專(zhuān)一的核酸雜交分子，然后將待測(cè)核酸在組織或細(xì)胞上的位置顯示出來(lái)的一種核酸檢測(cè)方法。王曉捷等[26]針對(duì)PRRSV N基因和PCV2 Rep基因序列設(shè)計(jì)了2組特異性探針，利用RNAscope原位雜交技術(shù)分別檢測(cè)了同一豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）中PRRSV和PCV2單獨(dú)感染或PRRSV與PCV2共感染的情況，其檢測(cè)結(jié)果與IFA結(jié)果一致。Phan等[27]利用原位雜交技術(shù)檢測(cè)PCV3在感染豬的心臟和肺臟中的分布情況，結(jié)果表明PCV3在心肌細(xì)胞和心肌中的炎癥細(xì)胞等多處存在，這些細(xì)胞都顯示出彌漫性的肌漿、胞漿反應(yīng)，而在肺組織切片未能檢測(cè)到PCV3。Mora-Díaz等[28]運(yùn)用原位雜交技術(shù)驗(yàn)證了PCV3分離株在CD/CD模型豬體內(nèi)的復(fù)制，結(jié)果表明PCV3在心肌細(xì)胞、動(dòng)脈中膜和內(nèi)皮細(xì)胞以及炎性細(xì)胞內(nèi)均有陽(yáng)性信號(hào)。此外，在腎小管上皮、內(nèi)皮細(xì)胞中同樣存在PCV3 DNA。

7 小結(jié)

豬圓環(huán)病毒病對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的危害日益嚴(yán)重，雖然有針對(duì)PCV2的滅活疫苗和亞單位疫苗在田間使用，但PCV2仍然在田間流行。隨著對(duì)PCV3的檢出以及對(duì)PCV3的回顧性研究越來(lái)越多，發(fā)現(xiàn)PCV3早在多年前便存在于豬體內(nèi)[29]，臨床上PCV2與PCV3的共感染情況嚴(yán)重，有研究表明PCV2與PCV3存在抗原性差異，PCV2疫苗并不能免疫豬群免受PCV3感染[30]，且由于PCV3的存在是否會(huì)影響PCV2疫苗的免疫效果尚不清楚[31]。目前仍沒(méi)有PCV3的疫苗在臨床上應(yīng)用。此外，定期監(jiān)測(cè)PCV抗體和開(kāi)展PCV分子流行病學(xué)調(diào)查同樣具有重要意義。

多重PCR、qPCR在快速鑒別診斷方面發(fā)揮著重要的作用，通過(guò)一次反應(yīng)就能夠鑒別出樣品中的不同病毒，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。而RT-LAMP、PSR由于其可視化、恒溫快速的優(yōu)勢(shì)則更適合田間檢測(cè)。而ISH和IHC更適合研究病毒在宿主體內(nèi)的分布情況，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)病毒在組織或細(xì)胞中的定位情況。