◎ 李信萍，張 昂，馬紫朝，楊彥寶

（1.寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.秦皇島海關(guān)技術(shù)中心，河北 秦皇島 066000；3.甘肅民族師范學(xué)院，甘肅 甘南 747000；4.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川 750021）

隨著我國葡萄酒市場日漸繁榮，2021年，我國葡萄園面積已達(dá)78.3萬hm2，葡萄酒消費(fèi)量約在10.5億L， 呈快速增長趨勢[1-2]。在經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)下，不法生產(chǎn)商在葡萄酒釀造過程中，通過摻廉價(jià)糖、摻外源乙醇、摻水等方式欺騙消費(fèi)者[3]。這些行為侵犯了消費(fèi)者的權(quán)益，同時(shí)損害了葡萄酒行業(yè)的形象[4]。目前國內(nèi)外鑒別葡萄酒摻假的方法較多，其中行之有效的當(dāng)屬利用各種穩(wěn)定同位素建立的鑒別方法。例如，王廣浩[5]利用EIM-IRMS和SNIF-NMR測定葡萄酒樣品中δ2H值來鑒別葡萄酒中外源糖的添加，發(fā)現(xiàn)葡萄酒樣品中乙醇不可交換位點(diǎn)δ2H值可以被用來鑒別摻糖葡萄酒。譚夢茹等[6]采用EA-IRMS對不同種類純正葡萄汁中的糖、有機(jī)酸δ13C值進(jìn)行測定，初步建立了純正葡萄汁中δ13C值的數(shù)據(jù)庫，根據(jù)糖和有機(jī)酸δ13C值間的差異鑒別葡萄汁中C4植物糖的摻假?；诖?，本文通過制備不同δ13C值分布的外源糖，并將其添加到純正葡萄汁中進(jìn)行發(fā)酵，測定發(fā)酵后葡萄酒樣品中甘油δ13C值，建立葡萄酒摻糖鑒別模型，旨在為我國葡萄酒摻糖鑒別的深入研究提供思路，以期促進(jìn)葡萄酒產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔗糖，選取來自黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古等主要產(chǎn)區(qū)的甜菜糖和廣西、福建、廣東等主要產(chǎn)區(qū)的蔗糖作為試樣，信息如表1所示；葡萄汁，實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)榨葡萄汁；水，實(shí)驗(yàn)室純凈水。

表1 不同穩(wěn)定碳同位素比值分布的外源糖樣品信息表

甲醇（色譜純），天津永晟精細(xì)化工有限公司；4-甲級-2-戊醇（99%），北京百靈威科技有限公司；超純水，Millipore公司的Milli-Q系統(tǒng)制備；淀粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（δ13C值：-24.55‰），奧地利維也納國際原子能機(jī)構(gòu)，作為碳穩(wěn)定同位素參照標(biāo)準(zhǔn)；Chromosorb W 吸附劑，Sercon公司。

1.2 儀器與設(shè)備

元素分析儀（EA GSL），英國Sercon公司；超純水制備儀（Milli-QG），美國Millipore公司；氣相色譜儀（GC 2023），日本島津公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（HPP260），德國Memmert公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 采用EA-IRMS測定不同δ13C值分布的外源糖

制備外源糖樣品：分別稱取每個(gè)編號(hào)的蔗糖和甜菜糖樣品10 g置于燒杯中，加入20 mL純凈水，低溫加熱溶解，搖勻后移入容量瓶中對應(yīng)編號(hào)備用。

采用移液器移取制備好的樣品1～3 μL。稱樣時(shí)，選用規(guī)格為5 mm×8 mm的錫杯，先在錫杯中加少量吸附劑，然后用柱塞式移液器吸取制好的液體樣品2 μL注入錫杯中，用彎曲的鑷子將錫囊置于潔凈平磁板上，并用鑷子輕輕鑷緊錫杯側(cè)壁使之閉合；以側(cè)面平置錫杯，用一只鑷子壓住其底部，以另一只鑷子的扁平面適當(dāng)用力刮壓錫杯使之側(cè)壁完全閉合成扁平狀；然后將其疊成小圓球狀，并將其壓緊[7]。設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)名稱，輸入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)參數(shù)，按照已設(shè)定檢驗(yàn)順序，在自動(dòng)進(jìn)樣器上擺放好待測外源糖樣品，在計(jì)算機(jī)軟件控制下，運(yùn)行檢測批進(jìn)行測定。測定完畢后，試樣的δ13C值由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算給出。δ13C值按公式（1）計(jì)算。

式中：X為13C/12C；R樣品和R標(biāo)準(zhǔn)分別為樣品和標(biāo)準(zhǔn)物中的重輕同位素的豐度比。

1.3.2 模擬摻糖葡萄酒樣品發(fā)酵

發(fā)酵預(yù)實(shí)驗(yàn)：在250 mL三角瓶中量取200 mL純正葡萄汁、摻水葡萄汁、摻糖葡萄汁。發(fā)酵7.0%（v/v， 下同）、13.0%葡萄酒（接入酵母0.06 g/200 mL），發(fā)酵16.0%葡萄酒（另加酵母多糖0.08 g/200 mL），紗布封口，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱發(fā)酵。設(shè)定發(fā)酵條件為溫度28 ℃；濕度60%RH，發(fā)酵時(shí)間根據(jù)發(fā)酵酒精度數(shù)設(shè)定，發(fā)酵期間多次對酒樣搖勻并觀察氣泡變化，待氣泡完全消失用滴定法測得葡萄酒樣品中殘?zhí)橇啃∮? g·L-1時(shí)，發(fā)酵完全，采用滴定法測得葡萄酒中總糖含量為241.6 g·L-1，按理論上17.5 g的糖可以轉(zhuǎn)化 1.0%的酒精度，純正葡萄汁可發(fā)酵成潛在酒精度為13.8%的葡萄酒。

根據(jù)葡萄汁發(fā)酵后潛在酒精度13.8%，將純正葡萄汁通過加水稀釋使其能發(fā)酵成3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、6.0%、9.0%、9.5%、10.0%、10.5%、11.0%和12.0%的葡萄汁，通過加糖（與純正葡萄汁δ13C值相同的糖）使其能發(fā)酵成12.5%、13.0%、13.5%、14.0%和15.0%的葡萄汁，再將1.3.1制備好的不同δ13C值分布的外源糖摻入以上葡萄汁中，紗布封口，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵（條件同上），使其發(fā)酵成國家標(biāo)準(zhǔn)中要求的最低酒精度7.0%，生活中普遍可見的酒精度為13.0%以及普通酵母耐受的酒精度為16.0%。發(fā)酵結(jié)束后，采用氣相色譜儀測定葡萄酒樣酒精度（以已知葡萄酒的酒精度為基準(zhǔn)）。

1.3.3 采用LC-IRMS測定葡萄酒中甘油δ13C值

將7%vol的葡萄酒樣品用超純水稀釋50倍，13.0%、16.0%的葡萄酒樣品用超純水稀釋100倍，過0.22 μm尼龍濾膜，移至樣品瓶中，供LC-IRMS測定葡萄酒中乙醇和甘油的δ13C值。在測定酒樣之前，先要用蔗糖IAEA-CH6（δ13C值：-10.4‰）碳穩(wěn)定同位素參考標(biāo)準(zhǔn)對實(shí)驗(yàn)室工作標(biāo)準(zhǔn)（葡萄糖水合物：δ13C值：-26.03‰±0.2‰）進(jìn)行校準(zhǔn)測定，再使用實(shí)驗(yàn)室工作標(biāo)準(zhǔn)對CO2氣體進(jìn)行標(biāo)定，每次測定樣品使用CO2標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)怏w計(jì)算δ13C值。將經(jīng)過前處理的葡萄酒樣品上機(jī)測樣，以上步驟均由儀器軟件程序自動(dòng)控制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同穩(wěn)定碳同位素比值分布的蔗糖和甜菜糖

采用EA-IRMS對不同產(chǎn)區(qū)蔗糖和甜菜糖樣品δ13C值進(jìn)行測定，測定結(jié)果如表2所示。每個(gè)產(chǎn)區(qū)蔗糖和甜菜糖δ13C值都在C3（-34‰～-22‰）和C4（-19‰～-9‰）植物δ13C值之間。從測定結(jié)果中選取δ13C值為-12.68‰的蔗糖和-26.68‰的甜菜糖，進(jìn)行任意質(zhì)量配比，制備實(shí)驗(yàn)中所需不同δ13C值分布的外源糖。

2.2 不同δ13C值分布的外源糖測定結(jié)果表

將表2中δ13C值為-12.68‰的蔗糖和-26.68‰的甜菜糖以任意比例混合均勻，采用EA-IRMS測定δ13C值，結(jié)果如表3所示。從表3測定結(jié)果中篩選出δ13C值分別為-14.64‰、-16.63‰、-18.67‰、-20.65‰、-22.68‰和-24.64‰的外源糖，將這8種不同δ13C值分布的外源糖添加到純正葡萄汁中進(jìn)行發(fā)酵來模擬摻糖葡萄酒樣品，根據(jù)表3測定的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：這些不同δ13C值分布的外源糖基本處于C3（-34‰～-22‰）和C4（-19‰～-9‰）植物的δ13C值范圍內(nèi)。

表2 不同穩(wěn)定δ13C值分布的蔗糖和甜菜糖表

表3 不同穩(wěn)定碳同位素比值分布的外源糖表（n=3）

2.3 發(fā)酵后葡萄酒中甘油δ13C值測定

采用LC-IRMS技術(shù)測定不同酒精度葡萄酒樣品中甘油δ13C值，結(jié)果如表4所示。不同δ13C值分布的外源糖發(fā)酵的葡萄酒樣品中甘油穩(wěn)定碳同位素比值的結(jié)果為-33.27‰～-25.37‰。

表4 葡萄酒中甘油穩(wěn)定碳同位素比值測定表

2.4 基于甘油穩(wěn)定碳同位素的葡萄酒中外源糖鑒別技術(shù)

2.4.1 外源糖添加量與葡萄酒中甘油δ13C值的相關(guān)性分析對不同外源糖添加量的葡萄酒中甘油穩(wěn)定碳同位素值測定并進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表5、圖1、圖2所示。對不同穩(wěn)定碳同位素比值分布的外源糖添加量與葡萄酒中甘油δ13C值數(shù)據(jù)進(jìn)行線性判別分析，由圖1可知，摻入與葡萄汁同位素值（δ13C值：-25.17‰） 相比，偏正的外源糖進(jìn)行發(fā)酵后，葡萄酒中甘油δ13C值會(huì)明顯偏正，不同外源糖添加量與葡萄酒中甘油δ13C值呈良好正相關(guān)關(guān)系，擬合方程分別為YS1=0.46X-32.31，R2=0.9 9 4；YSB5=0.4 7X-3 2.8 7，R2=0.9 9 6；YSB9=0.38X-32.87，R2=0.982；YSB13=0.31X-32.73，R2=0.9 7 0；YSB19=0.2 4X-3 2.7 8，R2=0.9 9 2；YSB26=0.15X-32.45，R2=0.989；YSB31=0.09X-32.93，R2=0.999；由圖2可知，摻入與葡萄汁同位素值（δ13C值：-25.17‰）相比，偏負(fù)的外源糖進(jìn)行發(fā)酵后葡萄酒中甘油δ13C值會(huì)明顯偏負(fù)，不同外源糖添加量與葡萄酒中甘油δ13C值呈良好負(fù)相關(guān)關(guān)系，擬合方程為y=0.04x-32.61，R2=0.984。

圖2 偏負(fù)外源糖添加量與葡萄酒中甘油穩(wěn)定碳同位素圖

表5 不同外源糖添加量的葡萄酒中甘油穩(wěn)定碳同位素測定結(jié)果表

圖1 外源糖添加量與葡萄酒中甘油穩(wěn)定碳同位素圖

2.4.2 葡萄酒中甘油δ13C值顯著性差異分析

葡萄酒作為一種營養(yǎng)成分豐富的低酒精度飲料，在發(fā)酵過程中添加非來自葡萄的乙醇、糖、水以增加葡萄酒中乙醇含量，使其滿足葡萄酒國家標(biāo)準(zhǔn)對酒精度的要求。這不僅給合法生產(chǎn)者帶來了經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也使消費(fèi)者對食品供應(yīng)鏈及政府監(jiān)管產(chǎn)生不信任[8]。因此，針對葡萄酒摻假現(xiàn)象，建立葡萄酒真實(shí)性的鑒別方法至關(guān)重要[9]。

葡萄酒釀造過程中，約8%的糖轉(zhuǎn)化為甘油，是僅次于水和乙醇的重要副產(chǎn)物，在酒精發(fā)酵開始時(shí)，參加3-磷酸甘油醛轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油酸這一反應(yīng)所需的輔酶Ⅰ（NAD），是通過磷酸二羧丙酮的氧化作用來提供的，甘油伴隨著這一氧化作用產(chǎn)生[10-11]。因此，甘油δ13C值間的差異也可用于鑒別葡萄酒發(fā)酵過程中有無外源糖的添加。通過測定對照組和摻糖葡萄酒樣品中甘油δ13C值來鑒別外源糖的摻入。對照組中葡萄酒中甘油δ13C值為-32.78‰，與摻糖葡萄酒樣品中甘油δ13C值進(jìn)行SD分析，當(dāng)SD＞0.100時(shí)，認(rèn)為兩個(gè)樣品存在顯著性差異，可以檢出葡萄汁在發(fā)酵過程中添加了外源糖，分析結(jié)果如表6～13所示。

表6 摻δ13C值為-12.68‰的外源糖葡萄酒中甘油δ13C值顯著性差異分析表

表7 摻δ13C值為-14.64‰的外源糖葡萄酒中甘油δ13C值顯著性差異分析表

表8 摻δ13C值為-16.63‰的外源糖葡萄酒中甘油δ13C值顯著性差異分析表

表9 摻δ13C值為-18.67‰的外源糖葡萄酒中甘油δ13C值顯著性差異分析表

表10 摻δ13C值為-20.65‰的外源糖葡萄酒中甘油δ13C值顯著性差異分析表

表11 摻δ13C值為-22.68‰的外源糖葡萄酒中甘油δ13C值顯著性差異分析表

表12 摻δ13C值為-24.64‰的外源糖葡萄酒中甘油δ13C值顯著性差異分析表

表13 摻δ13C值為-26.68‰的外源糖葡萄酒中甘油δ13C值顯著性差異分析表

由表6～13可知，在200 mL的葡萄酒樣品中，摻入δ13C值為-12.68‰、-14.64‰、-16.63‰、-18.67‰、 -20.65‰、-22.68‰和-24.64‰的外源糖，葡萄汁與外源糖δ13C值分別相差12.49‰、10.53‰、8.54‰、6.50‰、4.52‰、2.49‰和0.53‰，酒精度調(diào)節(jié)1.0%時(shí)，SD＞0.100，說明當(dāng)摻入δ13C值為-12.68‰、-14.64‰、 -16.63‰、-18.67‰、-20.65‰、-22.68‰和24.64‰的外源糖時(shí)，該預(yù)測模型至少能夠檢出酒精度提升1.0%時(shí)的添加量；在200 mL的葡萄酒樣品中，當(dāng)摻入與葡萄汁較相近的δ13C值為-26.68‰的外源糖時(shí)，葡萄汁與外源糖δ13C值相差1.53‰，酒精度調(diào)節(jié)1.0%時(shí)，對照組樣品與葡萄酒摻糖樣品中甘油δ13C值相差0.08‰，SD＜0.100，不能檢出，酒精度調(diào)節(jié)2.0%時(shí)，對照組樣品與葡萄酒摻糖樣品中甘油δ13C值相差0.19‰，SD＞0.100，能檢出，說明該預(yù)測模型至少能夠檢出酒精度提升2.0%的添加量。

3 討論

葡萄酒是新鮮葡萄或葡萄汁經(jīng)發(fā)酵后獲得的低酒精度飲料產(chǎn)品，酵母菌可以將葡萄漿果中的糖分解為乙醇、甘油、有機(jī)酸等其他副產(chǎn)物，反應(yīng)過程相當(dāng)復(fù)雜，有許多連續(xù)反應(yīng)和中間產(chǎn)物，且需要一系列酶參與。酒精發(fā)酵主要分為糖分子、丙酮酸的分解、甘油發(fā)酵。因此，在葡萄汁發(fā)酵過程中添加外源糖時(shí)，外源糖也會(huì)參加以上的生化反應(yīng)，會(huì)產(chǎn)生乙醇、甘油等其他副產(chǎn)物。因此可以根據(jù)葡萄汁發(fā)酵過程中碳的去向，通過測定發(fā)酵產(chǎn)物甘油δ13C值有效鑒別外源糖摻入。

江偉等[12]基于不同植物來源糖發(fā)酵后乙醇不同位點(diǎn)D/H含量存在差異的原理，采用SNIF-NMR分析了加糖釀造葡萄酒乙醇分子中同位素的變化。結(jié)果表明，當(dāng)葡萄酒在發(fā)酵過程中添加蔗糖和甜菜糖時(shí)，乙醇分子（D/H）Ⅰ含量和R值都會(huì)發(fā)生變化，通過測定乙醇分子中甲基位（D/H）Ⅰ的含量，可判斷葡萄酒在釀造前是否添加了外源糖。相比之下，本課題的研究是基于對照組與摻糖葡萄酒中甘油δ13C值間的SD建立葡萄酒摻糖鑒別模型，且該模型可以鑒別外源糖的添加，并有效鑒別了葡萄酒征求意見稿中酒精度提升2.0%的外源糖添加量。

4 結(jié)論

穩(wěn)定同位素聯(lián)用技術(shù)與其他化學(xué)計(jì)量法聯(lián)合使用對同位素進(jìn)行分析，能夠有效降低葡萄酒摻糖判定誤差，提高葡萄酒摻糖的鑒別效率，已成為解決葡萄酒摻糖的強(qiáng)有力手段。本文通過該技術(shù)制備了8種不同δ13C值分布的外源糖添加到葡萄汁中進(jìn)行發(fā)酵，獲得了國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定最低酒度7.0%、生活中普遍可見酒度13.0%以及普通酵母耐受酒度16.0%的葡萄酒樣。測定發(fā)酵后葡萄酒樣中甘油的δ13C值，與對照組樣品進(jìn)行差異性分析可得，在200 mL的酒樣中，摻入δ13C值-12.68‰、-14.64‰、-16.63‰、-18.68‰、 -20.68‰、-22.68‰和-24.64‰外源糖的量調(diào)節(jié)1.0%酒精度時(shí)，都能有效檢出外源糖的摻入，且該預(yù)測模型外源糖的最小檢出限為3.8 g，摻入δ13C值為-26.68‰的外源糖的量調(diào)節(jié)1.0%酒精度時(shí)，由差異性分析可知SD＜0.100，無法鑒別外源糖的摻入，當(dāng)摻入的量調(diào)節(jié)2.0%酒精度，能有效檢出外源糖的摻入，且該預(yù)測模型外源糖的最小檢出限為7.6 g。針對葡萄酒征求意見稿中提出的發(fā)酵過程中允許添加白砂糖作為外源糖提高酒精度的最大添加量不超過產(chǎn)生2.0%酒精，利用本文建立的外源糖鑒別技術(shù)可以有效地進(jìn)行鑒別，這種聯(lián)用技術(shù)為我國葡萄酒摻糖鑒別的深入研究提供了思路，同時(shí)也對實(shí)現(xiàn)我國葡萄酒市場的有效監(jiān)管、促進(jìn)葡萄酒市場向規(guī)范化發(fā)展具有極其重要的指導(dǎo)意義。