常豆豆，王從麗，李春杰*

（1.中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所/大豆分子設(shè)計(jì)育種院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150081；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

昆蟲病原線蟲（entomopathogenic nematodes，EPN）自然存在于土壤中，是一種專性寄生昆蟲的線蟲。大量研究證明，這類線蟲可侵染和殺死鱗翅目和鞘翅目等昆蟲幼蟲，對(duì)環(huán)境、植物及非靶標(biāo)生物無(wú)副作用，在害蟲生物防治中發(fā)揮著重要作用。昆蟲病原線蟲分為斯氏科 Steinernematidae、異小桿科Heterorhabditidae[1]，用于害蟲生物防治的昆蟲病原線蟲主要包括斯氏屬Steinernema和異小桿屬Heterorhabditis。目前已發(fā)現(xiàn)和鑒定出100多種Steinernema和Heterorhabditis[2]。昆蟲病原線蟲與體內(nèi)細(xì)菌共生，共生細(xì)菌包括腸桿菌科的致病桿菌屬Xenorhabdus與發(fā)光桿菌屬Photorhabdus，分別與Steinernema和Heterorhabditis線蟲共生。腸道內(nèi)攜帶共生菌的侵染期線蟲（infective juveniles，IJs）自由生活在土壤環(huán)境中，主動(dòng)尋找并侵入合適的寄主，隨后釋放體內(nèi)共生細(xì)菌到寄主昆蟲血腔內(nèi)，細(xì)菌迅速繁殖并產(chǎn)生毒素，使寄主于48 h內(nèi)患敗血癥而死亡。線蟲和細(xì)菌利用寄主體內(nèi)組織作為營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行繁殖；當(dāng)寄主體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)消耗殆盡，侵染期線蟲從寄主體內(nèi)爬出并尋找新的寄主。在寄生過程中，線蟲依賴于共生細(xì)菌殺死其寄主昆蟲，共生細(xì)菌產(chǎn)生抗生素抑制可競(jìng)爭(zhēng)的次級(jí)微生物，將寄主組織分解成可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并作為食物來(lái)源，從而為其繁殖創(chuàng)造一個(gè)合適的環(huán)境[3]。共生細(xì)菌需要線蟲來(lái)保護(hù)自己不受外界環(huán)境的影響，被釋放到寄主血腔，并抑制寄主的抗菌蛋白[1]。線蟲與共生細(xì)菌形成致病復(fù)合物，其中共生細(xì)菌的致病機(jī)制被學(xué)者們普遍闡明，但是近年來(lái)研究表明致病復(fù)合物中線蟲表皮化合物及其共生細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)是與寄主早期互作的重要組成部分，避免被寄主昆蟲免疫系統(tǒng)識(shí)別[4]，而在侵染后期，線蟲和細(xì)菌分泌物共同作用改變寄主的生理平衡，使其患敗血癥而死亡。本文主要綜述斯氏屬線蟲及異小桿屬線蟲的表皮免疫機(jī)制、分泌蛋白鑒定和功能，以及致病機(jī)制等研究進(jìn)展，為深入揭示這類線蟲的致病機(jī)制提供參考，為這類生物農(nóng)藥的高效研發(fā)提供新思路。

1 昆蟲病原線蟲的寄生策略

當(dāng)自由生活的 IJs到達(dá)目標(biāo)昆蟲，它會(huì)面對(duì)寄主的第一道防線，即物理結(jié)構(gòu)障礙，如角質(zhì)層和中腸營(yíng)養(yǎng)膜等，當(dāng)這些屏障被打破后，昆蟲通過細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)保護(hù)自己免受細(xì)菌或線蟲感染[5]。細(xì)胞免疫反應(yīng)包括血細(xì)胞的吞噬、結(jié)瘤及包埋[6]，體液免疫包括可誘導(dǎo)的抗菌肽、細(xì)胞黏附分子、溶酶菌、凝集素、黑化作用等[7,8]。而IJs為了克服寄主體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)并成功寄生，主要采取免疫逃避和免疫抑制兩種策略。免疫逃避是線蟲合成與寄主抗原相關(guān)的分子（被稱為self-proteins）或獲得寄主的分子化合物，將這些分子物質(zhì)覆蓋在線蟲的體表來(lái)逃避寄主的免疫[9]；免疫抑制是線蟲通過排泄/分泌各種化合物來(lái)干擾或中和寄主在應(yīng)對(duì)侵染時(shí)引發(fā)的免疫[10]。線蟲在不同侵染階段采取不同的策略：在侵染寄主早期（0～3 h），線蟲和細(xì)菌通過表皮復(fù)合物的免疫逃避策略避免寄主酚氧化酶原系統(tǒng)（Prophenoloxidase system）和血細(xì)胞識(shí)別；在侵染寄主后期（3 h以后），IJs及其共生細(xì)菌釋放各種毒性因子，如蛋白酶、酚氧化酶抑制劑和毒素來(lái)抑制寄主的免疫反應(yīng)[11]。

2 昆蟲病原線蟲及其共生細(xì)菌對(duì)昆蟲致病作用

2.1 共生細(xì)菌的致病性

線蟲成功寄生過程即對(duì)寄主致病過程。多數(shù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注線蟲體內(nèi)共生細(xì)菌在致病過程的作用，認(rèn)為昆蟲病原線蟲釋放Photorhabdus或Xenorhabdus共生細(xì)菌后，細(xì)菌的表面成分如菌毛、鞭毛蛋白首先發(fā)揮作用，阻止吞噬和結(jié)瘤過程，避免被寄主免疫血細(xì)胞識(shí)別[12]，隨后，共生細(xì)菌分泌毒力因子，包括毒素復(fù)合物、蛋白酶、脂肪酶和脂多糖等抑制寄主的免疫反應(yīng)[13]，克服昆蟲的體液和細(xì)胞防御機(jī)制，細(xì)菌在血腔繁殖并在48 h內(nèi)使寄主患敗血癥而死亡[14,15]；共生菌還會(huì)產(chǎn)生有毒的次級(jí)代謝物，不僅對(duì)寄主昆蟲是致病的，而且還會(huì)阻止其他的細(xì)菌和真菌利用富含營(yíng)養(yǎng)的昆蟲尸體[16]。

在致病性和營(yíng)養(yǎng)關(guān)系方面，異小桿屬線蟲與發(fā)光桿菌之間共生關(guān)系的專一性比斯氏屬線蟲與致病桿菌更為嚴(yán)格[17]。在體外無(wú)菌培養(yǎng)時(shí)，斯氏屬線蟲被成功培養(yǎng)，而異小桿屬未被成功培養(yǎng)[18]，只有當(dāng)無(wú)菌異小桿屬線蟲在非特異性發(fā)光桿菌培養(yǎng)條件下才能得以繁殖[19]。Han和Ehlers[17]研究闡明了H.bacteriphohora和S.carpocapsae侵染期線蟲對(duì)其共生細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)依賴性，及這兩種無(wú)菌線蟲在無(wú)菌大蠟螟Galleria mellonella體內(nèi)的發(fā)育和致病性。將無(wú)菌H.bacteriphohoraH06線蟲與其非特異性的發(fā)光桿菌離體培養(yǎng)，產(chǎn)生體內(nèi)無(wú)菌（axenic）的侵染期線蟲，用該線蟲侵染無(wú)菌大蠟螟，線蟲發(fā)育受阻并且無(wú)法致死大蠟螟；無(wú)菌S.carpocapsae在大蠟螟體內(nèi)可以發(fā)育為成蟲并繁殖，在3 d后殺死寄主昆蟲；而Hallem等[20]培養(yǎng)無(wú)菌H.bacteriphohora可以致死黑腹果蠅Drosophila melanogaster，無(wú)菌線蟲H.downeseiy可以致死寄主昆蟲煙草天蛾幼蟲Manduca sexta[21]，表明不同昆蟲對(duì)異小桿屬線蟲的響應(yīng)不同，斯氏屬和異小桿屬線蟲自身均有抵御昆蟲免疫的能力。

2.2 線蟲的致病性

已有研究表明昆蟲病原線蟲剛侵入寄主體內(nèi)不能立刻釋放共生細(xì)菌，斯氏屬格氏線蟲S.glaseri侵染寄主4～5 h后釋放致病桿菌[22]，異小桿屬線蟲H.bacteriphohora侵染寄主半小時(shí)后釋放發(fā)光桿菌[23]，因此，在侵染的早期階段，避免被寄主昆蟲的免疫識(shí)別是線蟲成功寄生的關(guān)鍵。一些學(xué)者研究了斯氏屬和異小桿屬線蟲致病過程，線蟲在線蟲-細(xì)菌復(fù)合體的致病性中，不僅具有“活注射器”的功能，而且還在侵入寄主后的不同時(shí)期通過表皮和其他分泌物的聯(lián)合作用來(lái)逃避和抑制寄主昆蟲的免疫。

2.2.1 斯氏屬線蟲表皮復(fù)合物對(duì)寄主的免疫調(diào)節(jié) 線蟲表皮是指線蟲身體最外層結(jié)構(gòu)，又稱為外鞘，與線蟲的上表皮松散連接[24]。Blaxter等[25]提出了線蟲角質(zhì)層免疫規(guī)避作用的一般模型，侵染期線蟲表面外膜（surface coat）在逃避昆蟲免疫過程中發(fā)揮重要作用。侵染期線蟲表皮由碳水化合物、脂類和蛋白質(zhì)等物質(zhì)組成，帶負(fù)電荷，處于動(dòng)態(tài)變化中，其組分不斷被合成，并且向寄主擴(kuò)散。研究表明S.feltiae表皮脂質(zhì)可以與來(lái)自大蠟螟血淋巴因子相結(jié)合，在線蟲周圍形成一層薄膜，這種非特異性的薄膜可以逃避寄主血細(xì)胞識(shí)別[26]，S.glaseri表皮蛋白模擬昆蟲對(duì)侵染期線蟲表皮特定蛋白的識(shí)別進(jìn)而逃避寄主免疫[27]。在斯氏屬線蟲侵染的早期階段，即共生細(xì)菌在寄主血腔被釋放之前，線蟲和寄主昆蟲免疫系統(tǒng)相互作用過程中，線蟲體表化合物，即脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等首先接觸昆蟲免疫系統(tǒng)發(fā)揮其免疫抑制功能[4]。

2.2.1.1S.feltiae表皮脂質(zhì)的免疫抑制 Dunphy和Webster[28]鑒定了S.feltiae部分表皮成分可抑制大蠟螟血細(xì)胞包埋，用脂肪酶處理表皮會(huì)導(dǎo)致其抑制特性的喪失，推測(cè)角質(zhì)層脂質(zhì)的變化導(dǎo)致可識(shí)別抗原的暴露；同樣，Brivio等[29]研究發(fā)現(xiàn)S.feltiae表皮可抑制大蠟螟免疫反應(yīng)，提取S.feltiae的表皮也可抑制酚氧化酶活性，進(jìn)而證實(shí)該線蟲體表參與免疫抑制。進(jìn)一步研究結(jié)果表明這一特性是由表皮上脂類物質(zhì)發(fā)揮作用，從S.feltiae表皮上提取的脂類可以抑制大蠟螟酚氧化酶活性及血細(xì)胞包埋反應(yīng)[30]和抗菌肽的合成[31]。表皮脂類物質(zhì)之所以抗免疫活性是因?yàn)槟軌蚪Y(jié)合昆蟲體內(nèi)的寄主互作蛋白（host-interacting proteins，HIPs）[26,30]。寄主互作蛋白是寄主免疫反應(yīng)中與外源物互作的一類蛋白的總稱，脂類與寄主互作蛋白的結(jié)合導(dǎo)致血淋巴中寄主互作蛋白濃度降低，阻止了酚氧化酶原系統(tǒng)激活和黑色素包埋所需的血淋巴絲氨酸蛋白酶的激活，從而抑制寄主免疫反應(yīng)[31]。從S.feltiae和大蠟螟相互作用之間關(guān)系可以看出，這種線蟲表皮脂質(zhì)實(shí)施的免疫抑制策略能夠中和寄主昆蟲的免疫防御引起寄主發(fā)病。

通過角質(zhì)層的研究可以排除由線蟲分泌物或其共生細(xì)菌造成的影響，并避免使用無(wú)菌性線蟲，因?yàn)楣采娜笔Э赡軙?huì)在生理上發(fā)生改變。關(guān)于S.feltiae線蟲表皮脂類功能研究相對(duì)比較清楚，其具體成分或分子靶標(biāo)已有報(bào)道。Lu等[32]認(rèn)為S.feltiae的侵染期線蟲表皮對(duì)寄主免疫的抑制作用來(lái)源于線蟲自身的分泌蛋白，潛在地粘附在表皮上。

2.2.1.2S.glaseri表皮蛋白的免疫抑制功能 在斯氏屬S.glaseri中同樣觀察到表皮的免疫抑制，但發(fā)揮作用的是表皮蛋白。Wang等[33]發(fā)現(xiàn)沒有共生細(xì)菌的S.glaseri抑制日本金龜子Popillia japonica血細(xì)胞包埋和黑化作用，說明S.glaseri自身可以分泌抑制昆蟲免疫的物質(zhì)；用乙醇粗提取S.glaseri表皮蛋白并測(cè)試活性，發(fā)現(xiàn)該表皮蛋白可使異小桿屬線蟲H.bacteriophora在日本金龜子體內(nèi)存活率提高四倍，進(jìn)一步分析粗提物，表皮蛋白中含有至少一種與昆蟲血細(xì)胞免疫相關(guān)的蛋白，其中表面外膜蛋白（surface coat protein 3a，SCP3a）可抑制血細(xì)胞對(duì)外來(lái)物的吞噬，降低寄主血細(xì)胞數(shù)目，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的免疫抑制效果[26]。劉華[34]也從S.glaseri表皮蛋白粗提物中分離純化了一個(gè)具有抑制昆蟲血細(xì)胞吞噬作用的蛋白組分，經(jīng)過雙向電泳分離和二級(jí)質(zhì)譜鑒定，獲得了免疫抑制蛋白的序列信息，序列分析證實(shí)免疫抑制蛋白與多個(gè)物種烯醇化酶（enolase）具有較高同源性，具備烯醇化酶家族的各種特征，將其命名為 Sg-ENOL（S.glaserienolase）。免疫電鏡分析證實(shí)天然的 Sg-ENOL 位于線蟲表皮，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Sg-ENOL也存在于線蟲肌肉組織中。S.glaseri在昆蟲源物質(zhì)誘導(dǎo)下會(huì)分泌Sg-ENOL，而無(wú)誘導(dǎo)物時(shí)不會(huì)分泌；在進(jìn)入寄主體內(nèi)后開始分泌Sg-ENOL，證實(shí)Sg-ENOL與S.glaseri侵染過程密切相關(guān)。

斯氏屬線蟲侵入寄主昆蟲體腔后，表皮復(fù)合物在抑制昆蟲免疫過程中發(fā)揮重要作用，但線蟲在生活史中蛻皮 4次，外表皮層在組成和組織上會(huì)發(fā)生改變，這與線蟲的外部環(huán)境有關(guān)[25]。另外，用不同來(lái)源的培養(yǎng)基繁殖S.glaseri線蟲的表皮蛋白組成和活性存在差異，活體和離體培養(yǎng)S.glaseri后進(jìn)行裂解血細(xì)胞試驗(yàn)，結(jié)果表明源于大蠟螟培養(yǎng)的S.glaseri的表皮蛋白表現(xiàn)出強(qiáng)烈的裂解血細(xì)胞活性，而源于人工培養(yǎng)基繁殖的S.glaseri的表皮蛋白活性不明顯[35]。劉勁和劉華[36]通過比較S.glaseri侵染期線蟲表皮蛋白和分泌蛋白，發(fā)現(xiàn)線蟲的免疫抑制作用主要是由分泌蛋白產(chǎn)生的；而自身表皮上的蛋白，雖然也具有一定的免疫抑制活性，但含量相對(duì)較低，活性很弱。線蟲侵入寄主早期，表皮蛋白幫助逃避昆蟲的血細(xì)胞包埋，線蟲在與寄主體內(nèi)物質(zhì)接觸后，線蟲自身分泌物通過體表分泌到昆蟲血腔，對(duì)寄主的致病作用起著促進(jìn)作用。

2.2.2 斯氏屬線蟲分泌蛋白的致病性 線蟲排泄/分泌（excretory/secretory，ES）產(chǎn)物既是有效的免疫原，在線蟲的致病力和寄主環(huán)境適應(yīng)性上起到了重要作用。S.feltiae、S.glaseri以及S.carpocapsae[37]等斯氏屬線蟲除了自身表皮復(fù)合物對(duì)寄主的免疫抑制作用，協(xié)助分泌蛋白和共生細(xì)菌等致病因子致死昆蟲，許多研究者發(fā)現(xiàn)斯氏屬線蟲還可利用分泌物調(diào)節(jié)免疫功能，是對(duì)寄主的主要致病因子。分泌物是由不同種分子組成的混合物，學(xué)者們重點(diǎn)關(guān)注并解析其中的蛋白。線蟲通過分泌蛋白（excretory/secretory protein，ESP）破壞寄主先天免疫反應(yīng)，增強(qiáng)其在寄主內(nèi)存活和致病。最初主要通過基因重組蛋白[38]、色譜純化法[39]、表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）[40]等方法對(duì)線蟲分泌蛋白進(jìn)行鑒定，隨著組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)被用于分泌蛋白的鑒定。

2.2.2.1 線蟲分泌蛋白的鑒定及其功能 蛋白酶是寄生蟲感染和生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的最豐富的酶，在寄生過程中發(fā)揮著重要作用[41]。目前多個(gè)斯氏屬線蟲寄生相關(guān)基因已被鑒定，這些基因編碼不同的蛋白酶，通過分子生物學(xué)等研究方法從S.carpocapsae的分泌產(chǎn)物中鑒定了5種絲氨酸蛋白酶及1種絲氨酸蛋白酶抑制劑、1種金屬蛋白酶和2種天冬氨酸蛋白酶，表達(dá)分析結(jié)果表明這些基因在寄生階段表達(dá)量增加，同時(shí)其基因功能、致病機(jī)制已被明確，部分效應(yīng)子是通過調(diào)控線蟲的寄生、降解寄主組織、抑制寄主昆蟲的免疫反應(yīng)等來(lái)調(diào)控其致病機(jī)制，具體蛋白的詳細(xì)功能如表1。

表1 已被鑒定的S.carpocapsae分泌的蛋白及其功能Table 1 The secreted protein and its functions of S.carpocapsae identified

斯氏屬線蟲能分泌蛋白質(zhì)（主要是蛋白酶）參與寄主免疫抑制，幫助線蟲感染寄主并在寄主內(nèi)生存。但蛋白酶在寄主-寄生蟲相互作用中的確切生物學(xué)作用及蛋白酶分泌來(lái)源尚不清楚，以上研究斯氏屬的ESP都是在感染環(huán)境之外進(jìn)行鑒定，在寄主免疫抑制與逃避及組織損傷中發(fā)揮作用，是調(diào)節(jié)免疫的活性分子；而Lu等[32]與Chang等[49]對(duì)S.carpocapsae及S.feltiae在無(wú)菌條件下分泌蛋白進(jìn)行組學(xué)分析和在寄主體內(nèi)活性分析，挖掘斯氏屬線蟲分泌蛋白中發(fā)揮毒性作用的核心蛋白，進(jìn)一步驗(yàn)證斯氏屬線蟲在促進(jìn)線蟲-細(xì)菌復(fù)合物的致病性方面具有更積極的作用，而不是簡(jiǎn)單地依賴于它們的共生細(xì)菌。

2.2.2.2 斯氏屬線蟲分泌蛋白的組學(xué)分析 當(dāng)自由生活侵染期線蟲侵染寄主時(shí)，會(huì)發(fā)生顯著的形態(tài)變化，這個(gè)過程被稱為“激活”，代表了線蟲生命周期中從自由生活轉(zhuǎn)換為主動(dòng)寄生，研究ESP需要設(shè)計(jì)一種模擬自然侵染條件的試驗(yàn)，以便獲得與自由生活的個(gè)體產(chǎn)生的盡可能相似的ESP[50]。Lu等[32]與Chang等[49]通過寄主昆蟲勻漿分別激活S.carpocapsae和S.feltiae侵染期線蟲，并收集線蟲分泌的蛋白，兩種線蟲的蛋白對(duì)果蠅、家蠶Bombyx mori和大蠟螟3種昆蟲均具有致病性，因ESP的毒性和在寄主體內(nèi)的快速擴(kuò)散特征，稱其為毒液蛋白。凝膠電泳分析從無(wú)菌S.carpocapsae侵染期線蟲中收集到的ESP與從帶共生細(xì)菌的侵染期線蟲中收集到的ESP具有相似的蛋白圖譜，并且從兩個(gè)群體中收集到的ESP具有相似的毒性。但斯氏屬不同種線蟲的ESP含量和組成存在顯著差異，當(dāng)暴露寄主組織6～30 h，S.feltiaeESP的含量是波動(dòng)且下降的，而S.carpocapsae的ESP較穩(wěn)定且數(shù)量緩慢下降，表明這兩種線蟲可能利用不同的策略建立寄生關(guān)系。為了戰(zhàn)勝并殺死寄主昆蟲，S.feltiae可能對(duì)其共生細(xì)菌X.bovienii有更強(qiáng)的依賴性，在激活和釋放共生細(xì)菌后不久，侵染期線蟲可能會(huì)將它們的生存策略從殺死寄主轉(zhuǎn)變?yōu)樯?、取食和發(fā)育。通過分析未激活和激活侵染期線蟲的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)在IJs激活期間，即線蟲早期寄生階段的基因表達(dá)發(fā)生了變化。

質(zhì)譜分析了毒液蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)毒液蛋白是一種包含許多種蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物，不同種線蟲的毒液蛋白包含的結(jié)構(gòu)域有差異，S.carpocapsae的毒液蛋白中除了含有上述（表1）的蛋白酶及蛋白酶抑制劑，還檢測(cè)到了毒素相關(guān)蛋白，如含Shk結(jié)構(gòu)域蛋白和脂肪酸及視黃醇結(jié)合蛋白，這些蛋白是抑制寄主免疫系統(tǒng)的潛在候選蛋白。而同樣的在S.feltiae鑒定的266種S.feltiae毒液中含量最多的蛋白質(zhì)組是絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。基因同源性分析發(fā)現(xiàn) 52個(gè)共同的毒液基因高表達(dá)，代表了這兩種斯氏屬線蟲共有一個(gè)核心效應(yīng)蛋白。在這組關(guān)鍵的ESP中，有肽酶、糖基水解酶、凝集素以及可能參與免疫調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，如FAR（fatty acid/retinol binding protein）蛋白、免疫球蛋白和免疫球蛋白樣蛋白。這些關(guān)鍵毒液蛋白的具體功能尚不清楚，但它們?cè)赟.carpocapsae和S.feltiae之間的保守性表明它們?cè)诙喾N昆蟲寄主中起著重要的寄生作用。

2.2.3 異小桿屬線蟲表皮的免疫抑制作用 Bedding和Molyneux[51]的研究結(jié)果表明侵染期異小桿屬線蟲有獨(dú)特的頭部端齒結(jié)構(gòu)，能夠穿透寄主的表皮和節(jié)間膜便于線蟲侵入。異小桿屬線蟲除了在寄主昆蟲內(nèi)釋放共生細(xì)菌外，侵染期線蟲還可抑制寄主昆蟲的免疫反應(yīng)[52,53]。Eleftherianos等[21]發(fā)現(xiàn)無(wú)菌異小桿屬線蟲H.downesei能夠有效地抑制煙草天蛾細(xì)胞免疫反應(yīng)，如血細(xì)胞的數(shù)量、血細(xì)胞的吞噬能力和血細(xì)胞聚集。侵染寄主早期，異小桿屬線蟲的表皮干擾寄主的細(xì)胞免疫和體液免疫。侵染期線蟲保留2齡表皮（J2-cuticle）稱之為包鞘（ensheath）幼蟲，出鞘（exsheath）標(biāo)志著線蟲褪去2齡表皮，從自由生活過渡到寄生生活[54]。斯氏屬線蟲的J2-cuticle在土壤移動(dòng)過程中容易褪去，但異小桿屬線蟲J2-cuticle較穩(wěn)定，這種表皮有助于線蟲避免昆蟲Tipula oleracea的細(xì)胞包埋[55]，Yi等[56]研究表明H.bacteriphohora表皮通過抑制在寄主免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用的必需活性因子——類花生酸（Eicosanoids），進(jìn)而抑制大蠟螟的血細(xì)胞密度、微聚集、吞噬和包埋、無(wú)細(xì)胞血淋巴酚氧化酶和抗菌活性，但表皮中是何種成分發(fā)揮免疫抑制的關(guān)鍵作用尚不清楚。

2.2.4 異小桿屬線蟲分泌蛋白的致病性 隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展和組學(xué)的出現(xiàn)，線蟲在侵染早期的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與基因組[57]和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究相結(jié)合，闡明可能參與致病的特定基因或基因家族。Adhikari等[58]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究檢測(cè)到H.bacteriphohora與寄主相互作用中，分泌或排泄的一些潛在分子與毒力相關(guān)的基因表達(dá)模式，推測(cè)這些分泌物在昆蟲寄生和抑制寄主防御機(jī)制中發(fā)揮重要作用。Vadnal等[59]對(duì)H.bacteriophoraIJs在煙草天蛾幼蟲血淋巴中孵育9 h后進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，使用qRT-PCR驗(yàn)證了上調(diào)和下調(diào)的基因亞群，揭示了一系列候選寄生基因。Moshayov等[60]將H.bacteriophora在大蠟螟體內(nèi)孵育，通過反轉(zhuǎn)錄、構(gòu)建抑制性消減雜交文庫(kù)及表達(dá)序列標(biāo)簽等分子生物學(xué)方法鑒定出寄生期間高表達(dá)的23個(gè)基因。Hao等[61]在H.bacteriophora中鑒定出凝集素、金屬蛋白酶、烯醇化酶、幾丁質(zhì)酶、表面相關(guān)抗原等與寄主昆蟲互作的相關(guān)基因，分別在逃避寄主免疫和寄主組織降解等過程中發(fā)揮作用。

線蟲在侵染寄主昆蟲的后期分泌毒性因子作用于寄主昆蟲[62]，如表2。異小桿屬H.bacteriophora在寄主體內(nèi)分泌特定類型的胞外蛋白酶選擇性地降解昆蟲的抗菌蛋白——天蠶抗菌肽（cecropin），使寄主抗菌免疫失活，促進(jìn)共生細(xì)菌P.luminescens在昆蟲體腔內(nèi)定殖[63,64]。H.bacteriophora線蟲分泌物通過抑制黑腹果蠅的 Imd（Immune deficiency）通路促進(jìn)共生細(xì)菌侵染[65]，產(chǎn)生的 UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycosyltransferase）抑制昆蟲蛻皮激素的活性及抗菌肽基因表達(dá)[66]，絲氨酸羧肽酶（Serine carboxypeptidase）和無(wú)脊椎動(dòng)物型溶菌酶 （lysozyme）等引起昆蟲黑化、細(xì)胞反應(yīng)、抑制抗菌肽合成[67]。Eliá?等[68]研究表明H.bacteriophora侵染期線蟲分泌蛋白抑制寄主的酚氧化酶活性，純化篩選出38 kDa的肽段被鑒定為酚氧化酶抑制化合物的主要候選來(lái)源，通過質(zhì)譜和重測(cè)序方法進(jìn)一步分析，在這一活性ESP片段中鑒定了6個(gè)肽序列，包括參與泛素化和免疫通路調(diào)控的蛋白質(zhì)；Noguez等[69]研究表明由H.bacteriophora線蟲產(chǎn)生的小分子信息素可以調(diào)控線蟲的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)而促進(jìn)毒性發(fā)揮。

表2 已被鑒定的H.bacteriphohora分泌的蛋白及其功能Table 2 The secreted protein and its functions of H.bacteriphohora identified

異小桿屬線蟲H.bacteriophora分泌的蛋白中調(diào)節(jié)寄主免疫蛋白的分子鑒定及功能已經(jīng)明確，但分泌蛋白中發(fā)揮毒性作用的關(guān)鍵蛋白尚不清楚，關(guān)于異小桿屬線蟲分泌蛋白的組學(xué)分析尚未見報(bào)道。

3 展望

本文綜述了廣泛研究的斯氏屬和異小桿屬線蟲致病機(jī)理方面的研究成果，例證除了共生細(xì)菌對(duì)昆蟲發(fā)揮致病作用外，昆蟲病原線蟲自身還能通過兩種方式促進(jìn)昆蟲致?。呵秩炯闹髟缙冢ㄟ^表皮復(fù)合物抑制寄主免疫，為線蟲和攜帶的細(xì)菌分泌物的釋放創(chuàng)造合適的血淋巴環(huán)境；當(dāng)線蟲到達(dá)寄主血腔后，通過分泌具有免疫調(diào)節(jié)的蛋白破壞寄主組織或具有毒性的蛋白殺死寄主。因此，線蟲通過分泌多種有活性的毒性物質(zhì)致死寄主，而不是歸因于任何單一的分泌產(chǎn)物的作用。但目前仍然有許多問題值得深入研究，如線蟲分泌蛋白的靶標(biāo)蛋白和具體功能，分泌蛋白的具體來(lái)源及作用途徑尚不清楚；在生物防治應(yīng)用實(shí)踐中，能否利用現(xiàn)代分子生物學(xué)對(duì)已挖掘的線蟲寄生基因進(jìn)行遺傳改良以提升線蟲的生物防治效果[70]。昆蟲病原線蟲在環(huán)境中面臨著各種生物和非生物因素的干擾，環(huán)境生物因素包括同類線蟲、共生細(xì)菌、寄主昆蟲、寄生真菌以及其他昆蟲病原等；環(huán)境非生物因素主要有土壤類型、溫濕度、鹽度、紫外線等[71]。昆蟲病原線蟲在不同逆境中對(duì)寄主昆蟲的致病過程中毒素蛋白是否也發(fā)揮著作用還是空白。因此需要深入研究昆蟲病原線蟲的致病機(jī)制，尤其是毒性蛋白的深入研究將備受關(guān)注，包括毒性蛋白的分離、鑒定、合成、功能驗(yàn)證、殺蟲機(jī)制及應(yīng)用潛力等。毒性蛋白方面的研究將不僅有助于理解侵染期線蟲寄生機(jī)制以及線蟲與寄主的互作機(jī)制，而且將提高對(duì)昆蟲免疫知識(shí)的認(rèn)知，也將為設(shè)計(jì)新的生物殺蟲劑提供新材料，對(duì)害蟲高效生物防治具有重要的促進(jìn)作用。