朱 瑋 孟逸芳

視網(wǎng)膜靜脈阻塞(RVO)是世界范圍第二常見的視網(wǎng)膜血管疾病。RVO的確切發(fā)病機制尚不明了，通常認為與血栓形成、炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)，這些病理過程也參與了RVO并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展。包括黃斑水腫(ME)和新生血管性青光眼在內(nèi)的嚴重并發(fā)癥是導致RVO患者視力障礙甚至失明的主要原因[1]。RVO的現(xiàn)行治療方式僅能減輕臨床癥狀，無法完全逆轉(zhuǎn)由血管閉塞引起的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和視功能的損傷,且部分RVO患者的治療效果欠佳，視力挽救效果不明顯[2]。因此，我們亟待提高對RVO發(fā)病機制的認識，從而為RVO的診斷、治療和預(yù)后提供參考。

大量證據(jù)表明，活化后的中性粒細胞可以通過特有的程序性死亡方式形成由顆粒蛋白和解聚的DNA組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被稱為中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)，NETs的形成過程被稱為網(wǎng)捕死亡(NETosis)[3-4]。NETs不僅具有殺死細菌或真菌的能力，而且有助于多種生物學進程。既往研究表明，NETosis與糖尿病、高血壓、心血管疾病以及中風的發(fā)病有關(guān)[5-7]，鑒于上述疾病是RVO發(fā)生的潛在危險因素，我們推斷，NETs可能與RVO的發(fā)病有關(guān)。然而，關(guān)于NETs與RVO發(fā)病相關(guān)性的報道有限，因此，本研究通過測量RVO患者中游離DNA(cfDNA)、髓過氧化物酶(MPO)-DNA、瓜氨酸化組蛋白H3(H3Cit)等NETs相關(guān)生物標志物的表達，對NETs的狀態(tài)進行量化，并探索NETs與炎癥或血栓形成的關(guān)系，以期為NETosis和RVO發(fā)病之間的潛在關(guān)系提供重要線索。

1 資料與方法

1.1 研究對象納入2020年1月至7月在常熟市第二人民醫(yī)院眼科就診的RVO患者77例(77眼)為RVO組。RVO的診斷依據(jù)Flaxel等[8]2019年發(fā)布的RVO眼科臨床指南。對照組納入在同一臨床中心的體檢部門隨機選取的年齡和性別相匹配的志愿者48例(48眼)。

RVO組患者排除標準：(1)有全身炎癥或血栓性疾病史；(2)有虹膜紅變和葡萄膜炎病史；(3)既往RVO治療史；(4)血液病、結(jié)締組織病或惡性腫瘤患者；(5)無法配合研究的患者。對照組參與者排除標準：若志愿者滿足任意上述標準或存在RVO病史，則排除在外。

本研究符合《赫爾辛基宣言》原則，經(jīng)常熟市第二人民醫(yī)院倫理委員會批準(2021-KY-0037-001)，在采血前，所有研究相關(guān)細節(jié)均向參與者進行了解釋，并獲得了所有參與者的知情同意。在血樣采集后，所有RVO患者都將接受正規(guī)的RVO治療。

1.2 一般情況收集并記錄所有受試者的基本信息，包括年齡、性別、體重指數(shù)(BMI)、糖尿病、高血壓以及吸煙和飲酒史等。吸煙是指過去一年吸煙100支或以上，飲酒是指連續(xù)5個月每周至少飲酒一次。糖尿病和系統(tǒng)性高血壓基于參與者的陳述，并通過血糖或血壓檢查進行確認。RVO組患者根據(jù)閉塞部位分為視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CRVO)組和視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞(BRVO)組，通過詢問每個研究對象病史，詳細記錄病程。

1.3 眼科檢查所有受試者都接受了全面的眼科檢查，RVO的診斷是基于臨床癥狀、裂隙燈檢查、檢眼鏡檢查以及眼底照相，由眼底病專家確認。初診后至少隨訪1年，每2個月隨訪1次，行光學相干斷層掃描(OCT)明確ME發(fā)病情況，視網(wǎng)膜厚度大于300 μm時診斷為ME。

1.4 實驗室檢測獲得所有受試者的空腹外周血樣本，分別采集含抗凝劑或不含抗凝劑的外周血各4 mL。將血液樣本于室溫下離心(1900 r·min-1，15 min)以制備血清和血漿，所有血清和血漿樣本均于-80 ℃保存，以用于后續(xù)研究。

1.4.1 血糖及糖化血紅蛋白測定通過葡萄糖氧化酶法并采用自動生化分析儀(Modular P800,Roche Diagnostics,瑞士)檢測空腹血糖(FBG)。使用高效液相色譜法并采用自動化設(shè)備[Tosoh,HLC(r)-723HbG7，日本]測定糖化血紅蛋白(HbA1c)。

1.4.2 炎癥標志物檢測采用免疫熒光檢測儀(FS-112 Flying Test II，廈門)檢測C反應(yīng)蛋白(CRP)濃度。 CRP濃度超過5 mg·L-1者為升高。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白細胞介素(IL)-1β和IL-6等炎癥標志物的血清水平均采用ELISA試劑盒(R&D Systems,Minneapolis,美國)檢測。實驗操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.3 凝血功能測定利用自動凝血功能分析儀(SYSMEX,CA-1500，日本)對所有受試者血漿樣本凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)和纖維蛋白原(FIB)進行檢測，以評估凝血功能。

1.5 NETs相關(guān)標志物檢測

1.5.1 中性粒細胞計數(shù)在獲取參與者外周靜脈血4 h內(nèi)，將樣本送至實驗室，用五分類血細胞分析儀(BC-5300,邁瑞，中國)進行血常規(guī)檢測，記錄中性粒細胞數(shù)，以便進行進一步分析。

1.5.2 cfDNA定量分析使用PicoGreen雙鏈DNA定量分析試劑盒(Invitrogen,美國)對血漿樣本中的cfDNA進行定量。在室溫下將PBS稀釋后的血漿(110)和SytoxGreen熒光試劑(ThermoFisher Scientific,美國)混合在96孔板中，并使用讀板器在485 nm/538 nm波長下獲得光吸光度。根據(jù)標準曲線計算所有血漿樣本的cfDNA濃度。

1.5.3 MPO-DNA復(fù)合物的測量參照Middleton等[9]的研究，使用固相修飾的針對MPO和dsDNA的特異性抗體進行MPO-DNA復(fù)合物的定量測量。將5 mg·L-1抗MPO單克隆抗體(Abcam,英國)包被的96孔板在4 ℃過夜。室溫下，將96孔板用PBST(含體積分數(shù)0.05%吐溫-20的PBS溶液)洗滌3次，然后用含40 g·L-1牛血清白蛋白(BSA;Sigma,美國)的PBST在室溫下孵育2 h，以避免非特異性結(jié)合。接著，添加100 μL PBS稀釋(110)的血清樣品，室溫下孵育2 h。PBST洗滌3次后，10 mg·L-1兔抗雙鏈DNA多克隆抗體(Abcam,Cambridge,英國)室溫下孵育4 h。PBST洗滌3次后，添加辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(Abcam,Cambridge,英國)室溫下孵育1 h。PBS洗滌3次后，添加過氧化物酶底物(TMB；Bio-Rad，美國)，隨后添加2N硫酸終止液。使用酶標儀(SpectraMax M5,美國)測量450 nm處的吸光度。

1.5.4 H3Cit的測量采用抗組蛋白抗體的ELISA試劑盒(Roche Diagnostics,瑞士)檢測所有受試者血漿中H3Cit的濃度。5 mg·L-1H3Cit抗體包被的96孔板在4 ℃過夜，室溫下PBST洗滌3次，加入含50 g·L-1BSA的PBST封閉緩沖液室溫封閉1.5 h,再添加血漿樣品室溫孵育1.5 h。用封閉緩沖液沖洗3次后，添加15000的HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫下孵育1 h。添加TMB，然后用1 mol·L-1硫酸溶液在450 nm的波長下終止比色反應(yīng)。使用酶標儀測量450 nm處的吸光度，并根據(jù)標準曲線計算所有血漿樣本的H3Cit濃度。

1.6 統(tǒng)計分析連續(xù)性變量以均數(shù)±標準差表示，使用t檢驗分析兩組之間的差異。分類變量用計數(shù)和百分比表示，不同組之間的差異用卡方檢驗進行分析。利用受試者工作特征曲線(ROC)分析NETs相關(guān)生物標志物對RVO的潛在診斷價值。用Pearson方法分析NETs相關(guān)標志物與炎癥或凝血功能指標之間的相關(guān)性，線性相關(guān)性通過線性回歸進行模擬。使用Graphpad Prism 8.3進行統(tǒng)計分析。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征和實驗室檢查RVO組患者與對照組受試者間的年齡、性別分布、高血壓發(fā)生率、糖尿病發(fā)生率、吸煙史和飲酒史差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)，RVO組患者的BMI、FBG和HbA1c均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.001)。與對照組相比，RVO組患者PT、APTT均顯著縮短，F(xiàn)IB、CRP、VEGF、IL-1β、IL-6等表達水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(見表1)。

表1 兩組受試者的臨床特征和實驗室檢查結(jié)果

2.2 NETs相關(guān)標志物與RVO的相關(guān)性與對照組[(3.9±0.5)×109個·L-1]相比，RVO組患者外周血的中性粒細胞數(shù)[(4.5±0.8)×109個·L-1]增加(P<0.001)。對照組受試者外周血中cfDNA、MPO-DNA和H3Cit濃度分別為(7.9±0.6)g·L-1、(125.0±32.6)g·L-1、(3.4±1.2)g·L-1，RVO組患者分別為(21.0±29.8)g·L-1、(310.6±262.1)g·L-1、(15.6±31.2)g·L-1。與對照組相比，RVO組患者外周血中cfDNA、MPO-DNA和H3Cit濃度均有所增加(均為P<0.05)。進一步分析NETs相關(guān)標志物對RVO的診斷效果，結(jié)果顯示，中性粒細胞數(shù)對RVO具有顯著的診斷潛力(AUC=0.762，P<0.001)；cfDNA、MPO-DNA和H3Cit是RVO的潛在診斷標志物，AUC分別為0.859、0.871、0.928(均為P<0.001)。

2.3 NETs相關(guān)標志物與炎癥/血栓狀態(tài)的相關(guān)性Pearson相關(guān)矩陣分析結(jié)果顯示，NETs相關(guān)標志物(cfDNA、MPO-DNA和H3Cit)與炎癥因子(VEGF、IL-1β和IL-6)、血栓指數(shù)(PT、APTT、TT和FIB)均呈顯著線性相關(guān)，可視化相關(guān)分析結(jié)果見圖1。此外， cfDNA與 MPO-DNA、H3Cit以及MPO-DNA與H3Cit之間檢測到顯著的線性正相關(guān)，R2值分別為0.670、0.887、0.589(均為P<0.001)。

圖1 NETs相關(guān)標志物與炎癥指標和凝血功能指標之間的相關(guān)性 紅色：正相關(guān)；藍色：負相關(guān)。

2.4 CRVO與BRVO患者各指標差異與BRVO組患者相比，CRVO組患者病程較短，PT、TT較小，中性粒細胞數(shù)較高，VEGF、IL-1β、IL-6、cfDNA和MPO-DNA濃度均較高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，兩組間其余指標相比差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)(表2)。

表2 CRVO組和BRVO組患者的臨床特征、實驗室數(shù)據(jù)和NETs相關(guān)標志物

2.5 NETs相關(guān)標志物與炎癥和血栓的相關(guān)性為了檢測NETs形成與炎癥和血栓的關(guān)系，將RVO患者分成NETs相關(guān)標志物表達量前25%的RVO患者(較高組)和其余病例(較低組)進行進一步分析，相關(guān)數(shù)據(jù)見表3。在cfDNA較高組患者中，反映血栓形成狀態(tài)的PT和TT較低(均為P<0.05)，CRP、VEGF、IL-1β和IL-6濃度較高(均為P<0.05)。與MPO-DNA較低組相比，MPO-DNA較高組患者的PT較低，CRP、VEGF和IL-1β濃度較高(均為P<0.05)。與H3Cit較低組相比，H3Cit較高組患者的FIB和IL-6濃度較高(均為P<0.05)。

表3 不同NETs嚴重狀態(tài)下的炎癥和血栓特征

2.6 NETs相關(guān)標志物與RVO病程及ME的關(guān)系將RVO組患者分為病程≤3 d組(急性期)和病程>3 d組(慢性期)兩個亞組，對比后發(fā)現(xiàn)，兩組患者cfDNA、MPO-DNA和H3Cit濃度差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)(圖2)。

圖2 不同病程RVO患者的NETs相關(guān)標志物濃度 ns示差異無統(tǒng)計學意義。

隨訪1年，BRVO組及CRVO組患者中分別有25.7% (9/35)及21.4%(9/42)發(fā)生ME。對比后發(fā)現(xiàn)，CRVO組及BRVO組患者中ME與非ME患者的NETs相關(guān)標志物cfDNA、MPO-DNA和H3Cit的濃度差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)(圖3)。

圖3 CRVO組及BRVO組中ME及非ME患者的NETs相關(guān)標志物濃度對比

3 討論

RVO的發(fā)病涉及多種生物學過程，其具體分子機制尚不清楚。中性粒細胞是炎癥反應(yīng)過程中炎癥因子的主要來源，然而，關(guān)于中性粒細胞在RVO中作用的相關(guān)報道較少。NETs是由活化的中性粒細胞釋放的DNA網(wǎng)狀復(fù)合體，具有多種生物學功能。除解聚的染色質(zhì)DNA外，NETs結(jié)構(gòu)主要由CitH3、中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)、MPO、PTX-3、抗菌肽以及30多種蛋白質(zhì)和酶組成。由于NETosis與局部病理進展和系統(tǒng)性疾病進展均相關(guān)，因此，局部NETs形成和循環(huán)NETs相關(guān)標志物被用作不同疾病的生物標志物[10-12]。本研究結(jié)果表明，NETs相關(guān)標志物可能是RVO的潛在生物標志物，并且可能與RVO發(fā)病期間的炎癥反應(yīng)和血栓形成有關(guān)。本研究證明了NETosis與RVO風險之間的潛在關(guān)聯(lián)，然而，在應(yīng)用NETs作為RVO的診斷或治療靶點之前，還有很多工作需要做。

RVO是一種視網(wǎng)膜血管疾病，也與全身性疾病有關(guān)。為了檢測NETs在RVO發(fā)病中的作用，視網(wǎng)膜組織或玻璃體樣本中的NETs將提供直接有力的證據(jù)。然而，獲得RVO患者的視網(wǎng)膜組織幾乎是不可能的，視網(wǎng)膜NETs標志物不適用于作為評價RVO的潛在指標。而RVO患者的玻璃體樣本相對容易獲得，尤其是在進行眼內(nèi)注射操作時[13]。然而，眼內(nèi)注射抗VEGF藥物僅用于ME患者，這意味著只有晚期RVO患者才有機會提供玻璃體樣本。因此，在本研究中，我們分析了RVO患者和對照組受試者外周血中循環(huán)NETs相關(guān)標志物的濃度。本研究結(jié)果表明，cfDNA、MPO-DNA和H3Cit這三種NETs相關(guān)標志物水平均與RVO發(fā)病相關(guān)。由于RVO患者的三種NETs相關(guān)標志物表達均增加，提示NETosis可能在RVO的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。NETs作為RVO的生物標志物，為我們確定NETosis可能參與RVO的發(fā)生發(fā)展提供了重要線索。此外，NETs相關(guān)標志物未來可用于從整個人群中篩選RVO高?；颊?，但這仍需要更多的臨床研究。

由于RVO是由視網(wǎng)膜靜脈內(nèi)循環(huán)微血栓和全身高凝狀態(tài)引起的，這為我們探討NETosis和血栓形成之間的關(guān)系提供了基礎(chǔ)。我們研究團隊先前的一項研究表明，凝血相關(guān)抗磷脂抗體含量與RVO風險增加有關(guān)[14]?？紤]到血栓形成是一個復(fù)雜的過程，了解其在RVO發(fā)生發(fā)展中的作用，將有助于RVO的早期診斷和有效干預(yù)。據(jù)報道，NETosis與各種血栓相關(guān)疾病有關(guān)，并被視為潛在的治療靶點[15]。越來越多的證據(jù)表明，NETs的促凝活性會促進多種凝血因子，刺激纖維蛋白沉積?？紤]到NETs激活和血栓形成之間的相關(guān)性，NETs在各種血栓相關(guān)疾病中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，包括中風、深靜脈血栓、癌癥或感染相關(guān)血栓[16-19]。在本研究中，嚴重的NETs狀態(tài)與顯著的血栓前活性相關(guān)，這些結(jié)果可能解釋了NETs在RVO發(fā)生中的病理作用，至少部分如此。本研究存在的局限是我們的研究僅分析了四個凝血功能指標，其他凝血功能指標，例如D-二聚體、尿纖維蛋白原降解產(chǎn)物、凝血因子等在后續(xù)研究中應(yīng)該納入。

在本研究中，RVO組患者檢測到較高的FBG和HbA1c水平，它們可能是NETs相關(guān)標志物與RVO發(fā)病率相關(guān)性的潛在混雜因素。首先，RVO組患者和對照組受試者之間的糖尿病發(fā)病率沒有顯著差異，入組的患者糖尿病病情均已得到控制，因此我們推測，RVO組患者中包括了較為嚴重的糖尿病患者。根據(jù)相關(guān)性分析，NETs相關(guān)標志物的濃度與炎癥指標相關(guān)，包括CRP、VEGF、IL-1β和IL-6。由于上述炎癥指標與RVO發(fā)病相關(guān)[20-21]，檢測NETs在這些炎癥因子中的作用將有助于我們更好地理解RVO發(fā)生發(fā)展的病理機制。近年來大量研究報道顯示，NETs除了清除病原微生物外，還從多個方面參與炎性疾病的病理生理過程[22]。NETs可以增強自身免疫性疾病的炎癥反應(yīng)，包括牛皮癬、類風濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡[23-24]。此外，據(jù)報道，自身免疫性疾病與NETosis有關(guān)。抑制NETs的形成可以降低許多疾病的嚴重程度，從而提高患者長期生存率[25]。在RVO的發(fā)展過程中，NETosis與炎癥和凝血之間的復(fù)雜關(guān)系值得進一步研究。本研究經(jīng)過1年隨訪，未發(fā)現(xiàn)ME及非ME患者中NETs標志物含量差異，NETosis與ME的復(fù)雜關(guān)系仍需要更大樣本量及進一步的試驗研究進行分析。

為了了解NETs與RVO風險之間的關(guān)系，本研究分析了不同亞型RVO(CRVO和BRVO)和不同病程RVO患者中NETs相關(guān)標志物的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與BRVO患者相比，CRVO患者中檢測到更高的NETs相關(guān)標志物。這一現(xiàn)象很容易理解，因為CRVO通常與更嚴重的疾病狀態(tài)、更嚴重的血栓形成以及更嚴重的炎癥反應(yīng)有關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)NETs相關(guān)標志物與RVO病程無關(guān)，急性期和慢性期均可檢測到異常增加的NETs相關(guān)標志物。第一種解釋是，異常NETs形成是一種常見的血管性風險相關(guān)標志物，因此，它與包括RVO在內(nèi)的血管疾病有關(guān)；另一種解釋是，本研究中使用的循環(huán)標志物反映全身狀態(tài)，不直接指示局部疾病進展。這兩種解釋表明，外周血NETs相關(guān)標志物可能被用作RVO的早期診斷生物標志物。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)，在RVO病程較長的情況下，所研究的三種NETs相關(guān)標志物(cfDNA、MPO-DNA和H3Cit)都略有減少，這為我們將這些因素作為RVO的預(yù)后標志物提供了可能性。

本研究為從NETs形成角度理解RVO發(fā)病提供了重要的臨床依據(jù)。同時，本研究也存在局限性。首先，這是一項初步研究，僅檢測到NETs相關(guān)標志物與RVO發(fā)病風險之間存在顯著關(guān)聯(lián)；其次，NETs的形成與多種病理過程有關(guān)，其在RVO發(fā)病中的具體作用有待進一步研究；再次，由于之前沒有相關(guān)研究報道，因此很難估計所需的樣本量，而相對較小的樣本量將影響本研究的可信度。

綜上所述，RVO患者血漿NETs相關(guān)標志物(包括cfDNA、MPO-DNA和H3Cit)顯著增加，NETs的形成與炎癥和血栓進展有關(guān)。未來需要進一步大樣本的觀察性研究和臨床試驗來確定NETs相關(guān)標志物在RVO發(fā)生發(fā)展中的診斷、預(yù)后和治療潛力。