王雨潤(rùn)，岑金鳳，孟文琪，裴志鵬，肖 凱，謝 穎*，孫銘學(xué)*

1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子流行病學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410000

2.海軍軍醫(yī)大學(xué)（第二軍醫(yī)大學(xué)）海軍醫(yī)學(xué)系防化醫(yī)學(xué)教研室，上海 200433

芥子氣（sulfur mustard，SM）是難防難治化學(xué)戰(zhàn)劑的典型代表，自第一次世界大戰(zhàn)期間被引入戰(zhàn)場(chǎng)后，又多次被用于各種沖突和恐怖襲擊［1-2］。盡管目前存在毒性更強(qiáng)的化學(xué)戰(zhàn)劑，但是SM 具有易于工業(yè)化生產(chǎn)、難以預(yù)防和治療的特點(diǎn)，仍然具有較大的軍事威脅。肺是SM 損傷的主要靶器官之一，急性肺損傷是導(dǎo)致SM 中毒患者死亡的主要原因之一［3-4］。研究者們認(rèn)為氧化應(yīng)激是SM 中毒的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［5-6］。研究表明，炎癥因子如IL-1β、IL-6和TNF-α 等與SM 引起的肺損傷密切相關(guān)［7-9］。SM中毒的機(jī)制尚未完全闡明，目前還沒有特效治療藥物，以對(duì)癥治療為主。基于SM 的軍事威脅和毒性特點(diǎn)，推進(jìn)SM 中毒機(jī)制的研究、尋找新型有效的治療藥物具有重要意義。

虎杖苷（polydatin，PD）是一種白藜蘆醇的苷類衍生物，從傳統(tǒng)中藥虎杖（Polygonum cuspidatumSieb）的根部分離得到。PD 分布廣泛，存在于許多常見的食品中，如葡萄、葡萄酒及花生等。研究表明PD 具有抗氧化和抗炎活性，能發(fā)揮對(duì)腎臟、肝臟和肺功能的保護(hù)作用［10-12］，可作用于多個(gè)系統(tǒng)且不良反應(yīng)小，具有巨大的應(yīng)用潛力。Shu 等［13］研究發(fā)現(xiàn)PD 可阻斷磷脂酶A2 的活性，下調(diào)分泌型磷脂酶A2 ⅡA mRNA 的表達(dá)，改善內(nèi)毒素休克大鼠的急性肺損傷。王方巖等［14］觀察到PD 可通過降低超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量來(lái)減輕缺血/再灌注引起的肺損傷?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中未見PD 對(duì)SM 所致肺損傷作用的相關(guān)報(bào)道。本研究以雄性ICR 小鼠為研究對(duì)象，建立SM肺損傷模型，探究PD 對(duì)SM 肺損傷的改善作用，并初步探索其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組與造模ICR 小鼠（雄性，6～8 周齡，體重25～30 g）由昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司［生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0006］提供。小鼠在12 h 光照/12 h 黑暗循環(huán)、室溫（20±2）℃、自由進(jìn)食和飲水的條件下飼養(yǎng)1周后使用。在存活率實(shí)驗(yàn)中，將小鼠隨機(jī)分為6 組（n＝15）：對(duì)照（Ctrl）組、SM 組、PD 低劑量（SM＋PD100）組、PD 中劑量（SM＋PD200）組、PD 高劑量（SM＋PD400）組和陽(yáng)性對(duì)照藥N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）治療（SM＋NAC）組。SM 以40 mg/kg 的劑量皮下注射給藥。在SM 暴露30 min 后，SM＋PD100、SM＋PD200、SM＋PD400 組分別以100、200、400 mg/kg PD 每天灌胃給藥1 次，持續(xù)給藥7 d。SM＋NAC 組在SM 暴露30 min 后，以200 mg/kg 的劑量每天灌胃給藥1 次，持續(xù)給藥7 d。連續(xù)觀察14 d，每天按時(shí)記錄小鼠的存活情況。

在除存活率外的其他實(shí)驗(yàn)中，小鼠被隨機(jī)分為4 組（n＝15）：Ctrl 組、SM 組、SM＋PD200 組和SM＋NAC 組。SM 以30 mg/kg 的劑量皮下注射給藥。PD 在SM 暴露30 min 后，以200 mg/kg（SM＋PD200 組）的劑量每天灌胃給藥1 次，持續(xù)給藥5 d。SM＋NAC 組在SM 暴露30 min 后，以200 mg/kg的劑量每天灌胃給藥1 次，持續(xù)給藥5 d。于第1、3、5、7、10 天處死小鼠，取各組小鼠肺組織制作H-E切片進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。另取一批小鼠隨機(jī)分為上述4 組（n＝15），處理同前，持續(xù)給藥5 d 后處死小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑SM（純品）由軍事科學(xué)院防化研究院提供；PD（純度為95%）和NAC（純度為99%）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，貨號(hào)分別為15721-25G 和A9165。

1.3 肺組織病理學(xué)觀察處死小鼠后，取左側(cè)最大葉肺組織，在4%多聚甲醛組織固定液中固定24 h，按順序放入梯度乙醇和二甲苯溶液中脫水（75%乙醇4 h → 85%乙醇2 h → 90%乙醇2 h →95%乙醇1 h → 無(wú)水乙醇Ⅰ 30 min → 無(wú)水乙醇Ⅱ30 min → 二甲苯Ⅰ 10 min → 二甲苯Ⅱ 10 min），透明處理后將肺組織浸蠟包埋并切成5 μm 厚的切片，H-E 染色。規(guī)避分組信息后邀請(qǐng)上海市肺科醫(yī)院謝惠康副主任醫(yī)師和高彩霞、張偉2 位中級(jí)技師根據(jù)肺水腫、肺出血、肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡壁結(jié)構(gòu)、支氣管結(jié)構(gòu)和病變面積等情況對(duì)H-E 切片進(jìn)行評(píng)分：未見任何病變記為0 分；病理改變輕微、病變面積≤25%記為1 分；病理改變輕度、病變面積＞25%～50%記為2 分；病理改變中度、病變面積＞50%～75%記為3 分；病理改變重度、病變面積＞75%記為4 分。

1.4 肺濕重/干重（W/D）比值檢測(cè)將小鼠的肺組織完整取出，用吸水紙擦掉肺表面殘余的血漬后稱量，記為濕重（W）。將肺組織在70 ℃烘箱中干燥72 h 后稱量，記為干重（D），計(jì)算W/D 比值。

1.5 肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）蛋白濃度檢測(cè)小鼠末次給藥后，腹腔注射10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，固定小鼠后打開腹腔，剪斷兩側(cè)腹主動(dòng)脈進(jìn)行放血，鈍性分離出小鼠氣管，通過氣管將1 mL 預(yù)冷的生理鹽水緩緩注入小鼠肺中，然后緩慢回抽，循環(huán)3 次，最后回抽600 μL 生理鹽水。將獲得的BALF 離心（4 ℃，400×g，15 min），收集上清，于－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 氧化應(yīng)激指標(biāo)與炎癥因子檢測(cè)采用SOD活性檢測(cè)試劑盒（WST-8 法）檢測(cè)小鼠肺組織中SOD 活性，用脂質(zhì)氧化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MDA 含量，用過氧化氫（H2O2）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)H2O2含量。以上試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為S0103、S0131S、S0038。還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量檢測(cè)試劑盒與髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，貨號(hào)分別為A006-2-1、A044-1-1。所有檢測(cè)步驟均依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

采用IL-1β ELISA 試劑盒檢測(cè)小鼠肺組織中IL-1β 水 平，IL-6 ELISA 試 劑 盒 檢 測(cè)IL-6 水 平，TNF-α ELISA 試劑盒檢測(cè)TNF-α 水平，以上試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D 公司，貨號(hào)分別為SMLB00C、SM6000B、SMTA00B。所有檢測(cè)步驟均依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)將組織放入含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)P0013D）中剪碎，在預(yù)冷的組織研磨儀上勻漿至沒有肉眼可見的組織塊，離心（4 ℃，13 000×g，20 min）后將上清小心轉(zhuǎn)移到新的EP 管中。依據(jù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)DE201-01）的說明書提取細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白。采用BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)P0012S）測(cè)定蛋白濃度。將蛋白（40 μg）上樣于12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF 膜（美國(guó)Millipore 公司，貨號(hào)ISEQ00010）。用5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST（TBS購(gòu)自武漢塞維爾生物科技公司，貨號(hào)G0001-2L；吐溫購(gòu)自上海博光生物科技有限公司，貨號(hào)BLSJ-0763）洗膜后用相應(yīng)一抗在4 ℃孵育過夜，洗膜后放入HRP 標(biāo)記的二抗（1 ∶3 000 TBST 稀釋）中在室溫下孵育1 h，TBST 清洗，經(jīng)化學(xué)發(fā)光法得到條帶。GAPDH、β-微管蛋白（β-tubulin）、核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）、NAD(P)H:醌氧化還原酶（NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1）、Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、NF-κB p65 總 蛋白抗體均購(gòu)自Proteintech 中國(guó)公司，貨號(hào)分別為60004-1-Ig、11224-1-AP、16396-1-AP、11451-1-AP、19811-1-AP、10745-1-AP；TATA 盒 結(jié) 合 蛋白（TATA box binding protein，TBP）、 沉 默 信息調(diào)節(jié)因子1（silencing information regulator 1，SIRT1）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）抗體均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為AF5321、AF0282、AF1333；磷酸 化NF-κB p65 抗 體 購(gòu) 自 美 國(guó)CST 公 司，貨 號(hào)3039；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔/鼠抗體購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)為A0208、A0216。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用GraphPad Prism 9 軟件進(jìn)行分析和繪圖。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多樣本均數(shù)兩兩之間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，存活率的比較采用log-rank 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 PD 可以提高SM染毒小鼠的存活率，改善SM所致肺損傷如圖1 所示，Ctrl 組無(wú)小鼠死亡，SM組小鼠存活率為11.33%（與Ctrl 組比較，P＜0.01）；與SM 組相比，SM＋NAC 組小鼠與SM＋PD400組小鼠存活率均提升至26.84%（P均＜0.05）；SM＋PD200 組小鼠存活率提高至48.62%（與SM 組相比，P＜0.01；與SM＋NAC 組相比，P＜0.05）；SM＋PD100 組小鼠存活率與SM 組相比無(wú)明顯提升（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，PD 可以提高SM 染毒小鼠的存活率，且PD 最佳給藥劑量為200 mg/kg，選用此劑量進(jìn)行后續(xù)PD 作用評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。

圖1 PD 處理對(duì)SM 染毒小鼠存活率的影響Fig 1 Effect of PD on survival rate of SM-exposed mice

H-E 染色觀察PD 對(duì)SM 所致肺損傷的影響，結(jié)果如圖2、3 所示，Ctrl 組小鼠肺組織形態(tài)正常，肺泡和支氣管結(jié)構(gòu)完整；SM 組小鼠肺損傷先加重后減輕，在SM 暴露后的第5 天肺組織損傷最為嚴(yán)重（評(píng)分與Ctrl 組比較，P＜0.01），可見明顯的支氣管結(jié)構(gòu)破壞和肺間隔增厚，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加；與SM 組相比，SM＋NAC 組小鼠肺損傷程度有輕微改善，肺泡腔內(nèi)有部分炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見少量出血和肺間隔增厚，支氣管結(jié)構(gòu)輕微破壞；SM＋PD200 組小鼠肺損傷有明顯緩解（第5 天評(píng)分與SM 組比較，P＜0.05），肺泡腔僅有少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和滲出物，偶見支氣管結(jié)構(gòu)輕微破壞。結(jié)果表明PD 和NAC 對(duì)SM 所致肺損傷均具有一定的保護(hù)作用，且前者效果優(yōu)于后者。

圖2 各組小鼠肺組織病理變化Fig 2 Histopathological changes of lung issues in mice in each group

圖3 各組小鼠肺組織病理?yè)p傷評(píng)分Fig 3 Histopathological injury scores of lung tissues in mice in each group

通過小鼠肺W/D 比值和BALF 蛋白濃度來(lái)評(píng)判肺損傷程度（n＝5）。Ctrl 組W/D 比值為4.22±0.22，BALF 蛋白濃度為（349.90±110.14）μg/mL。與Ctrl 組相比，SM 組小鼠W/D 比值（4.91±0.16）和BALF 蛋 白 濃 度［（869.23±73.85）μg/mL］升高（P＜0.01），提示SM 可引起肺組織損傷。采用PD200 干預(yù)可降低W/D 比值（4.44±0.23）和BALF 蛋白濃度［（545.67±64.28）μg/mL］（與SM組相比，P＜0.05 或P＜0.01），采用NAC 干預(yù)不能降低W/D 比值（4.67±0.26；與SM 組相比，P＞0.05）但可降低BALF蛋白濃度［（645.77±127.46）μg/mL，與SM 組相比，P＜0.05］，提示PD 和NAC 可降低SM 染毒小鼠的肺水腫，對(duì)SM 所致肺損傷具有保護(hù)作用，且PD 的作用效果優(yōu)于NAC。

2.2 PD 可以降低SM染毒小鼠的氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)水平如圖4 所示，與Ctrl 組相比，SM 組小鼠肺組織中MDA 含量、H2O2含量及MPO 活性均升高（P均＜0.01），GSH 含量、SOD 活性均降低（P均＜0.01）；NAC 處理可提高GSH 含量和SOD 活性（與SM 組相比，P均＜0.05）；PD200 處理后可降低MDA 含量、H2O2含量及MPO 活性（與SM 組相比，P＜0.05 或P＜0.01），提高GSH 含量、SOD活性（與SM 組相比，P均＜0.01）。結(jié)果表明PD和NAC 可以不同程度地改善SM 引起的氧化應(yīng)激。

圖4 各組小鼠肺組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Fig 4 Results of oxidative stress indexes in lung tissues of mice in each group

2.3 PD 可上調(diào)SM染毒小鼠SIRT1蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)移，上調(diào)HO-1和NQO1蛋白的表達(dá)如圖5A 所示，與Ctrl 組相比，SM 組SIRT1蛋白的表達(dá)水平下降（P＜0.01）。與SM 組相比，SM＋PD200 組和SM＋NAC 組SIRT1 蛋白的表達(dá)水平均有所上升（P＜0.01，P＜0.05），證明PD和NAC 都可能通過激活SIRT1 蛋白來(lái)發(fā)揮其保護(hù)作用。如圖5B、5C 所示，各組細(xì)胞胞質(zhì)的Nrf2 總蛋白水平?jīng)]有明顯變化，但SM＋PD200 組和SM＋NAC 組Nrf2 蛋白的核轉(zhuǎn)移與SM 組相比增加（P＜0.01，P＜0.05）。如圖6所示，與SM組相比，SM＋PD200 組HO-1 和NQO1 蛋白的表達(dá)水平增加（P＜0.05 或P＜0.01），SM＋NAC 組的HO-1 蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.05），且SM＋PD200 組的變化均較SM＋NAC 組更為顯著。結(jié)果表明PD 可能通過激活SIRT1 蛋白的表達(dá)來(lái)調(diào)控Nrf2 及其下游蛋白發(fā)揮抗氧化作用。

圖5 各組小鼠肺組織中SIRT1 與Nrf2 蛋白的表達(dá)Fig 5 Protein expression of SIRT1 and Nrf2 in lung tissues of mice in each group

圖6 各組小鼠肺組織中HO-1 和NQO1 蛋白的表達(dá)Fig 6 Protein expression of HO-1 and NQO1 in lung tissues of mice in each group

2.4 PD 可降低SM染毒小鼠炎癥因子水平通過ELISA 試劑盒檢測(cè)小鼠肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的水平變化，結(jié)果如圖7 所示。與Ctrl組相比，SM 組TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達(dá)水平均升高（P均＜0.01），提示SM 作用后可引起肺組織的炎癥反應(yīng)；PD或NAC處理降低了TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平 （與SM 組相比，P均＜0.05）。SM＋PD200組IL-6 水平較SM 組降低（P＜0.05），SM＋NAC 組IL-6 水平降低不明顯。結(jié)果說明PD 可以降低SM 染毒小鼠肺組織內(nèi)的炎癥水平，改善小鼠SM肺損傷。

圖7 各組小鼠肺組織中炎癥因子的檢測(cè)結(jié)果Fig 7 Results of inflammatory factors in lung tissues of mice in each group

2.5 PD 可降低SM染毒小鼠TLR4蛋白、NF-κB p65總蛋白表達(dá)及NF-κB p65磷酸化水平如圖8所示，與Ctrl 組相比，SM 組小鼠肺組織中TLR4 蛋白和NF-κB p65 總蛋白表達(dá)及NF-κB 磷酸化水平升高（P＜0.01）；與SM 組相比，PD 或NAC 處理后NFκB p65 總蛋白及其磷酸化水平降低（P＜0.01 或P＜0.05），SM＋NAC 組TLR4 蛋白水平下降不明顯。結(jié)果表明PD 可能通過TLR4/NF-κB 通路來(lái)抑制SM所致的炎癥反應(yīng)。

圖8 各組小鼠肺組織中TLR4、NF-κB p65 和磷酸化NF-κB p65 蛋白的表達(dá)Fig 8 Protein expression of TLR4, NF-κB p65 and phosphorylated NF-κB p65 in lung tissues of mice in each group

3 討 論

在SM 暴露模型選擇上，研究者們根據(jù)研究目的選擇了不同的染毒方式［15-20］，或?qū)M 制成氣溶膠對(duì)眼、皮膚和呼吸系統(tǒng)進(jìn)行直接染毒，或?qū)⒁簯B(tài)SM 直接滴注到氣管進(jìn)行染毒，或通過皮下、腹腔或靜脈注射的方式進(jìn)行染毒，或通過皮膚涂抹進(jìn)行染毒，以這些方式進(jìn)行SM 染毒均可引起肺損傷。本實(shí)驗(yàn)選擇皮下注射SM 為染毒模型，主要原因是我們認(rèn)為皮膚暴露可能是SM 中毒更主要的威脅方式，因?yàn)楹团宕鞣蓝久婢呦啾燃皶r(shí)穿戴好全身防護(hù)服的難度更大、更難以實(shí)現(xiàn)。由于受實(shí)驗(yàn)條件限制，僅能實(shí)現(xiàn)皮膚涂抹和皮下注射2 種方式進(jìn)行SM 皮膚暴露，我們認(rèn)為皮下注射可以更好地保證動(dòng)物染毒劑量的一致性。

目前還沒有針對(duì)SM 損傷的特效治療藥物，減少SM 所致?lián)p傷的最好方法是在2 min 內(nèi)對(duì)暴露部位進(jìn)行去污處理，否則SM 被吸收將造成機(jī)體損傷。目前對(duì)于SM 損傷主要采用支持性療法，如抗生素治療和皮膚燒傷護(hù)理等［21］。NAC 也可以通過多種機(jī)制減輕SM 損傷，具有較好的效果［22-23］，因此本研究選用NAC 作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。本實(shí)驗(yàn)中首先觀察了PD 對(duì)于SM 肺損傷的作用，結(jié)果表明PD 可以提高SM 染毒小鼠的生存率、降低SM 染毒小鼠肺W/D 比值和BALF 蛋白濃度，這與其他PD 對(duì)肺損傷保護(hù)作用的報(bào)道［24-25］一致；NAC 也可緩解SM 所致肺損傷，但整體效果不及PD。

氧化應(yīng)激是SM 肺損傷的起始和關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，SM 及其類似物能與各種細(xì)胞成分和低分子量代謝物反應(yīng)，形成單功能和雙功能加合物，最終導(dǎo)致活性氧過量產(chǎn)生、脂質(zhì)過氧化、抗氧化體系失活等［26-27］。MPO 可以將H2O2轉(zhuǎn)化為更高活性的次氯酸；MDA 含量高低用以評(píng)價(jià)細(xì)胞質(zhì)膜的受損程度；GSH 和SOD 是重要的抗氧化劑，同時(shí)也是SM的靶標(biāo)分子，SM 可以使它們耗損從而加重氧化應(yīng)激水平，導(dǎo)致毒性效應(yīng)［28-30］。Liu 等［31］證明PD 可以通過抑制MPO 和MDA 的水平提高SOD 活性，抑制大鼠特發(fā)性肺纖維化。Fu 等［32］發(fā)現(xiàn)PD 可以提高谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）和SOD 的活性，緩解百草枯對(duì)人胚胎肺成纖維細(xì)胞造成的損傷。在本研究中，SM 組小鼠肺組織MDA 含量、H2O2含量和MPO 活性均高于Ctrl 組，而SOD 活性、GSH 含量均低于Ctrl 組；與SM 組比較，PD 組MDA 含量、H2O2含量和MPO 活性降低，SOD 活性、GSH 含量升高。本研究結(jié)果表明PD 可以通過降低氧化酶水平，提高抗氧化酶活性來(lái)抑制SM 所致肺損傷的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

Sirtuin 家族是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD＋）依賴的組蛋白去乙?；讣易?，其生物學(xué)功能多樣。SIRT1 作為Sirtuin 家族的重要成員之一，主要負(fù)責(zé)調(diào)控機(jī)體氧化應(yīng)激與能量代謝等多條信號(hào)通路［33］。Nrf2 是抗氧化應(yīng)激通路中發(fā)揮抗氧化作用的關(guān)鍵分子，通常情況下與特異性抑制受體Keap1相結(jié)合，大部分以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中；當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)會(huì)導(dǎo)致Nrf2 與Keap1 解離，解離的Nrf2向核轉(zhuǎn)移并激活其下游通路蛋白的表達(dá)，以此來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化應(yīng)激［6］。研究表明，PD 可以特異性激活SIRT1 蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)SIRT1/Nrf2通路發(fā)揮抗氧化作用［34-35］。Meng 等［5］還發(fā)現(xiàn)Nrf2與其下游抗氧化蛋白HO-1 和NQO1 均參與了SM肺損傷的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SM 染毒小鼠肺組織的SIRT1 蛋白下調(diào)，Nrf2 少量入核。PD 可提升SM 染毒小鼠肺組織中SIRT1 蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Nrf2 入核，上調(diào)HO-1 和NQO1 蛋白的表達(dá)，從而減輕SM 的損傷作用，提示PD 在SM 染毒后可能通過調(diào)節(jié)SIRT1/Nrf2 通路改善SM 引起的肺損傷。

炎癥反應(yīng)也是SM 繼發(fā)性損傷的重要標(biāo)志之一。SM 引 起 的 肺 損 傷 會(huì) 導(dǎo) 致TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等炎癥因子大量釋放和炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)［36-37］。TLR4 是Toll 樣受體家族的成員之一，主要在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮 作 用［38］。NF-κB 是TLR4 通 路 激 活 炎 癥 反 應(yīng)的下游關(guān)鍵分子，細(xì)胞應(yīng)激可導(dǎo)致TLR4 蛋白表達(dá)提高，從而激活下游NF-κB 通路［39］。NF-κB p65 是NF-κB 家族的成員之一，其表達(dá)和磷酸化可間接反映NF-κB 的活性［40-41］。研究表明SM 可以增加肺組織中TLR4 的表達(dá)［42］，PD 可以通過TLR4-MyD88-NF-κB 通路保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷［24］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SM 暴露小鼠肺組織中TLR4、NF-κB p65 及磷酸化NF-κB 水平升高，PD 處理可逆轉(zhuǎn)上述變化，表明PD 可能通過調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB 通路對(duì)SM 誘導(dǎo)的肺損傷產(chǎn)生抗炎作用。

綜上所述，本研究首次明確了PD 對(duì)SM 肺損傷具有改善作用，初步闡明PD 治療SM 肺損傷的機(jī)制主要與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)，為今后PD 治療SM 肺損傷的臨床研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。