秦鴻楠，周 娟，李 琳，張勤文

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

喜馬拉雅旱獺(Himalayan marmot)屬嚙齒動(dòng)物，主要分布在我國(guó)西藏、甘肅、青海等地區(qū)。棲息于海拔2 500～5 200 m的高山草甸草原、高山草原等環(huán)境中[1-2]。旱獺為了適應(yīng)這種高原低氧環(huán)境，其形態(tài)學(xué)和生理學(xué)都發(fā)生了一定的適應(yīng)性變化。研究發(fā)現(xiàn)，處于不同海拔高度的喜馬拉雅旱獺，其心肌肌纖維都出現(xiàn)不同程度的紊亂和肌節(jié)模糊的現(xiàn)象[3-4]。馬嵋等[5]研究表明，新疆灰旱獺右心室肥厚指數(shù)、纖維化程度均高于SD大鼠。喜馬拉雅旱獺的紅細(xì)胞(Red blood cell,RBC)、紅細(xì)胞比容(Hematocrit value,HCT)和血紅蛋白含量隨海拔增加逐漸增加，從而提高氧氣的利用率[4]。賈榮莉[6]研究發(fā)現(xiàn)，喜馬拉雅旱獺具有肺泡中毛細(xì)血管豐富、支氣管上皮存在杯狀細(xì)胞等特點(diǎn)。

骨骼肌是哺乳動(dòng)物軀體運(yùn)動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。對(duì)于肌肉組織學(xué)特性的研究表明，可以根據(jù)肌纖維直徑和肌纖維表面積密度來(lái)判定肌肉品質(zhì)，肌纖維直徑越小，肉質(zhì)越好；影響肌纖維粗細(xì)的因素有很多，如品種、營(yíng)養(yǎng)狀況和年齡等[7-8]。在有關(guān)高原牦牛的研究中發(fā)現(xiàn)，與平原黃牛相比，大通牦牛骨骼肌肌纖維直徑細(xì)，而表面積密度大[9]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著海拔的升高，大通牦牛骨骼肌肌纖維直徑隨著年齡的增長(zhǎng)逐漸增大，肌纖維表面積密度也隨之增加[10]。葉于聰?shù)萚11]研究表明，急進(jìn)高原大鼠的心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，線粒體變形腫脹，基質(zhì)密度下降，嵴出現(xiàn)不同程度的溶解或缺損等；因低氧引起急進(jìn)大鼠心肌線粒體變形，使心肌細(xì)胞內(nèi)腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine triphosphate,ATP)合成減少，能量代謝受到影響，從而引起細(xì)胞內(nèi)外水腫甚至造成心肌細(xì)胞壞死，而旱獺心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)正常，表明喜馬拉雅旱獺對(duì)高原低氧環(huán)境有良好的適應(yīng)性。目前對(duì)于旱獺骨骼肌低氧適應(yīng)的組織學(xué)特點(diǎn)報(bào)道較少，因此本試驗(yàn)以喜馬拉雅旱獺為研究對(duì)象，以SD大鼠為對(duì)照，采用蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色、免疫組織化學(xué)和電鏡技術(shù)，對(duì)旱獺骨骼肌的組織學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行觀測(cè)和分析，探討旱獺骨骼肌組織低氧適應(yīng)的組織學(xué)特點(diǎn)，旨在闡明旱獺骨骼肌的組織學(xué)特點(diǎn)和對(duì)高原低氧環(huán)境適應(yīng)的特點(diǎn)，進(jìn)一步為高原醫(yī)學(xué)研究提供理論依據(jù)，并為高原獸醫(yī)研究積累資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 兔抗鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)多克隆抗體、CD34多克隆抗體、檸檬酸鹽緩沖液和DAB顯色劑，均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；胎牛血清，購(gòu)自北京科瑞泰科技有限公司。

1.2 主要儀器 脫水機(jī)(Donatello)，購(gòu)自DIAPATH公司；包埋機(jī)(JB-P5)和凍臺(tái)(JB-L5)，均購(gòu)自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(jī)(RM2016)和超薄切片機(jī)(LKB-2188)，均購(gòu)自上海徠卡儀器有限公司；組織攤片機(jī)(KD-P)，購(gòu)自浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；烤箱(DHG-9140A)，購(gòu)自上?；厶﹥x器制造有限公司；脫色搖床(TSY-B)、渦旋混合器(MX-F)和組化筆(WG1066-1)，均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；正置熒光顯微鏡(Nikon Eclipse C1)、透射電鏡(JEM-2000EX)和成像系統(tǒng)(Nikon DS-U3)，均購(gòu)自日本尼康公司。

1.3 動(dòng)物和處理 選取青海省地方病預(yù)防控制所飼養(yǎng)的成年喜馬拉雅旱獺5只和SD大鼠5只，臨床健康，不計(jì)性別。喜馬拉雅旱獺、SD大鼠均于現(xiàn)場(chǎng)屠宰后立即取其腓腸肌，一部分用4%多聚甲醛固定，用于H.E.染色和免疫組織化學(xué)染色；一部分用2.5%戊二醛固定，用于電鏡指標(biāo)的測(cè)定。

1.4 肌纖維直徑和肌纖維表面積密度測(cè)量 常規(guī)石蠟切片，H.E.染色。用Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng)直接測(cè)量肌纖維直徑，并按照張勤文等[12]報(bào)道的方法測(cè)算出肌纖維表面積密度。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 切片常規(guī)脫蠟至水；PBS沖洗；將切片放入檸檬酸鹽緩沖液中修復(fù)抗原，冷卻至室溫；PBS沖洗，滴加3%H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性并室溫孵育；PBS沖洗，滴加5%的胎牛血清封閉液，不洗；分別滴加兔抗鼠VEGF和CD34多克隆抗體，4 ℃過(guò)夜；PBS沖洗，滴加生物素化山羊抗兔工作液(1∶200)稀釋；PBS沖洗，滴加試劑SABC室溫孵育；PBS沖洗后DAB顯色劑顯色，待有陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)且背景淡時(shí)用蒸餾水終止反應(yīng)；用酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。VEGF陽(yáng)性表達(dá)胞漿著色為棕黃色顆粒，用Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng)直接測(cè)量VEGF在單位面積內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)量，按張勤文等[12]報(bào)道的方法測(cè)算出單位面積內(nèi)肌纖維數(shù)量，以陽(yáng)性表達(dá)量/單位面積內(nèi)肌纖維數(shù)量，所得比值作為VEGF在單位面積內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)率。根據(jù)Weidner等[13]校正方法將染色的任一細(xì)胞或細(xì)胞叢作為一微血管，先在低倍鏡下觀察切片全部視野并確定微血管密度最高區(qū)域，后在高倍鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的微血管數(shù)，取其平均值作為該樣本的微血管密度(Microvascular density,MVD)。

1.6 電鏡指標(biāo)觀測(cè) 將已處理好的樣品制成70 nm超薄切片，切片用醋酸鈾和枸櫞酸鉛進(jìn)行雙重染色。在JEM-2000EX透射電鏡下觀察，隨機(jī)拍攝并在透射電鏡放大10 000倍后，進(jìn)行照片掃描入電腦。參照鄭富盛[14]的相關(guān)計(jì)算方法，采用方格測(cè)量系統(tǒng)，測(cè)算出線粒體的基本參數(shù)。按立體學(xué)公式[15]計(jì)算出線粒體的平均截面積(Ax)、平均體積(V)、體積密度(Vv)、面數(shù)密度(NA)等各結(jié)構(gòu)參數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 通過(guò)SPSS 23.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示。以P<0.05作為差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌肌纖維直徑和肌纖維表面積密度比較 由表1和圖1～2可知，喜馬拉雅旱獺的肌纖維直徑小于SD大鼠，且差異極顯著(P<0.01)，喜馬拉雅旱獺的肌纖維表面積密度大于SD大鼠，且差異顯著(P<0.05)。

圖1 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌肌纖維直徑(A)和肌纖維表面積密度(B)的比較

表1 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌肌纖維直徑和肌纖維表面積密度的比較

H.E.染色時(shí)細(xì)胞核呈藍(lán)色，肌纖維呈粉紅色。由圖2可知，喜馬拉雅旱獺骨骼肌肌纖維排列致密、規(guī)則且肌纖維較細(xì)，SD大鼠骨骼肌肌纖維排列較疏松。

圖2 喜馬拉雅旱獺(A)和SD大鼠(B)骨骼肌的顯微結(jié)構(gòu)(H.E.染色，400×)

2.2 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌中VEGF和MVD比較 由表2和圖3可知，喜馬拉雅旱獺骨骼肌中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率和MVD均高于SD大鼠，且差異均極顯著(P<0.01)。

圖3 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌中VEGF和MVD的比較

表2 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌中VEGF和MVD的比較

免疫組化染色中棕黃色即為陽(yáng)性表達(dá)，通過(guò)棕黃色的深淺可判斷VEGF的表達(dá)量，CD34標(biāo)記的棕黃色為微血管內(nèi)皮細(xì)胞。由圖4可知，喜馬拉雅旱獺VEGF、MVD陽(yáng)性表達(dá)量均高于SD大鼠。

圖4 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌的免疫組化染色(400×)

2.3 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體的平均截面積、平均體積、體積密度和面數(shù)密度比較 由表3和圖5可知，喜馬拉雅旱獺骨骼肌線粒體平均截面積和平均體積均小于SD大鼠且差異極顯著(P<0.01)；喜馬拉雅旱獺骨骼肌細(xì)胞線粒體的體積密度和面數(shù)密度均大于SD大鼠且差異極顯著(P<0.01)。

圖5 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體的平均截面積、平均體積、體積密度和面數(shù)密度的比較

表3 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體的平均截面積、平均體積、體積密度和面數(shù)密度的比較

由圖6可知，喜馬拉雅旱獺與SD大鼠線粒體結(jié)構(gòu)均完整規(guī)則，喜馬拉雅旱獺線粒體排列緊湊，SD大鼠線粒體排列疏松；喜馬拉雅旱獺骨骼肌線粒體表現(xiàn)出體積小、數(shù)量多的特點(diǎn)。

圖6 喜馬拉雅旱獺(A)與SD大鼠(B)骨骼肌細(xì)胞線粒體分布情況(10 000×)

3 討論

骨骼肌在機(jī)體運(yùn)動(dòng)過(guò)程中有著很重要的作用，衡量骨骼肌組織學(xué)特性主要有2個(gè)重要指標(biāo)：肌纖維直徑和肌纖維表面積密度。有研究顯示，在低氧環(huán)境下，牦牛的肌纖維直徑較棗北黃牛細(xì)[9]。這與本試驗(yàn)中喜馬拉雅旱獺肌纖維直徑比SD大鼠細(xì)一致。肌纖維表面積密度是根據(jù)肌纖維數(shù)得到的，每個(gè)肌纖維就是1個(gè)肌細(xì)胞。低氧會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物骨骼肌受損，因此骨骼肌細(xì)胞通過(guò)不斷增生和促進(jìn)骨骼肌肌纖維生成來(lái)達(dá)到適應(yīng)低氧的目的。有研究表明，在單純?nèi)毖鯐r(shí)，骨骼肌細(xì)胞會(huì)發(fā)生增殖并在第21天達(dá)到最高峰，持續(xù)低氧28 d骨骼肌細(xì)胞增殖情況逐漸下降，這可能是骨骼肌開(kāi)始適應(yīng)低氧環(huán)境的表現(xiàn)[16]。在本試驗(yàn)中，喜馬拉雅旱獺骨骼肌肌纖維表面積密度比SD大鼠大，這可能是因?yàn)橄柴R拉雅旱獺長(zhǎng)期生活在高原低氧環(huán)境中，其骨骼肌肌纖維受到環(huán)境影響逐漸變細(xì)，從而使肌纖維表面積密度增大，以達(dá)到適應(yīng)高原環(huán)境的目的。

在低氧條件下，骨骼肌毛細(xì)血管的增生可以縮短氧從毛細(xì)血管向組織彌散的距離，進(jìn)一步提高了組織供氧量，是組織與細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)，引起血管增生的主要原因是VEGF的高表達(dá)，而血管增生會(huì)導(dǎo)致MVD發(fā)生變化[17]。VEGF的高表達(dá)與機(jī)體在缺氧時(shí)產(chǎn)生低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor,HIF)密切相關(guān)，其包括HIF-1α和HIF-1β，HIF-1α參與組織細(xì)胞缺氧的反應(yīng)。在缺氧時(shí)大量的HIF-1α表達(dá)可導(dǎo)致VEGF反轉(zhuǎn)錄水平上升而大量表達(dá)[18]。朱世海等[19]研究發(fā)現(xiàn)，高原鼢鼠的MVD和VEGF顯著高于SD大鼠，高原鼢鼠通過(guò)MVD和VEGF的高表達(dá)特征來(lái)適應(yīng)高二氧化碳的洞道生活。本試驗(yàn)中喜馬拉雅旱獺骨骼肌中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率和MVD比SD大鼠高，說(shuō)明喜馬拉雅旱獺對(duì)低氧環(huán)境已經(jīng)具有良好的適應(yīng)性。

線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)的場(chǎng)所，也是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和ATP形成的重要場(chǎng)所。細(xì)胞氧化磷酸化和ATP形成重要部位是線粒體的內(nèi)膜與嵴。有研究表明，低氧時(shí)線粒體會(huì)發(fā)生變形腫脹，嵴出現(xiàn)不同程度的斷裂損傷，從而減少氧化磷酸化和ATP形成[20]。線粒體形態(tài)的完整才能保證其正常功能，缺氧時(shí)機(jī)體通過(guò)增加線粒體的數(shù)目和面積從而加強(qiáng)對(duì)氧的利用。齊新章[21]研究表明，高原鼢鼠與高原鼠兔心肌組織對(duì)氧的攝取和利用能力較強(qiáng)，這與其心肌中線粒體面密度、面數(shù)密度大有關(guān)，心肌中線粒體通過(guò)增加線粒體數(shù)目和面數(shù)密度來(lái)提高機(jī)體對(duì)氧的攝取與利用。本試驗(yàn)中喜馬拉雅旱獺骨骼肌線粒體的平均截面積和平均體積均小于SD大鼠；旱獺骨骼肌線粒體的體積密度和面數(shù)密度均大于SD大鼠。所以線粒體結(jié)構(gòu)的特殊性可以使喜馬拉雅旱獺更好地適應(yīng)低氧環(huán)境。

綜上所述，喜馬拉雅旱獺骨骼肌顯微結(jié)構(gòu)的特殊性，是其適應(yīng)高原低壓低氧環(huán)境的組織學(xué)基礎(chǔ)，喜馬拉雅旱獺骨骼肌結(jié)構(gòu)特點(diǎn)說(shuō)明其對(duì)高原環(huán)境存在良好的適應(yīng)性，主要表現(xiàn)為骨骼肌的肌纖維直徑細(xì)，肌纖維表面積密度大，VEGF大量表達(dá)，MVD大，線粒體體積密度和面數(shù)密度高。