陸 靜，吳敬澤，冀 煜，王文龍，高珍珍

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

寄生蟲玻片標本是寄生蟲學中研究寄生蟲微觀內(nèi)部結(jié)構(gòu)的重要方法，用以補充自然狀態(tài)下觀察的不足，好的玻片標本也可以長期保存，具有重要的研究價值[1]。自然狀態(tài)下觀察，不易看清寄生蟲的微細結(jié)構(gòu)，因此，染色是玻片制作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，決定著玻片標本的質(zhì)量。蟲體內(nèi)不同組織的細胞組成和化學成分不同，對不同染料的親和力也不同，經(jīng)不同染色方法可以呈現(xiàn)其內(nèi)部不同細胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。最佳效果是經(jīng)過染色后蟲體不同部位、不同組織間呈現(xiàn)出一定的顏色差異，這樣才有利于更清晰地觀察和區(qū)分不同器官和組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)[2]。

本試驗分別用蘇木素染色法和硼砂卡紅染色法對肝片吸蟲、胰闊盤吸蟲、鹿前后盤吸蟲、土耳其斯坦東畢吸蟲這4種吸蟲進行染色觀察比較，對傳統(tǒng)制作方法[3-6]的不足之處加以改進，對4種吸蟲永久性玻片標本制作方法進行探索，力求找到最適合這4種吸蟲的染色條件，建立簡便快捷、層次分明、辨識度高、效果良好的吸蟲玻片標本染色方法。

1 材料與方法

1.1 材料 本試驗所需吸蟲，取自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院寄生蟲標本室保存的吸蟲標本。

1.2 主要試劑 丁香油，購自福晨(天津)化學試劑有限公司；甲醇，購自天津永晟精細化工有限公司；乙醇、醋酸，均購自天津新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)科茂化學試劑有限公司；蘇木素、卡紅，均購自Sigma-aldrich；中性樹膠、鹽酸、硼砂、硫酸鋁鉀，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器 玻片掃描儀，蔡司遠東有限公司，Axio Scan.Z1；顯微鏡，蔡司遠東有限公司，PRIMOSTAR；水浴鍋，金壇市鑫鑫實驗儀器有限公司，HH-1；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司，DHP-9011；天平，上海佑科儀器儀表有限公司，YP5002。

1.4 試劑配制 蘇木素染液配制：蘇木素2.5 g，100%乙醇25 mL，鉀明礬2.5 g，氧化汞1.2 g，冰乙酸20 mL，蒸餾水500 mL。先將蘇木素溶于乙醇中(稍加熱)，將預先已溶解明礬的蒸餾水加入蘇木素乙醇液中，然后將其加熱使溶液盡快沸騰后，將火焰熄滅，慢慢加入氧化汞，防止溶液濺出，再煮沸2 min后將燒瓶立即浸入冷水中。當染液冷卻后，加入冰乙酸，室溫保存，用前過濾[7]。

硼砂卡紅染色液配制：將硼砂研磨后制備成4%硼砂水溶液，取100 mL該溶液加入1 g研磨充分的卡紅，在水浴鍋中加熱至卡紅完全溶解后，再加入70%乙醇100 mL，經(jīng)過24 h后，將硼砂卡紅染色液過濾后放入棕色瓶中備用[8]。

1%酸酒精配制：將1 mL鹽酸溶于99 mL 70%乙醇中。

巴氏液配制：將8 g氯化鈉溶于30 mL福爾馬林中，加蒸餾水至1 000 mL。

1.5 蘇木素染色方法

1.5.1 染色 將固定于巴氏液中的蟲體取出，用自來水反復沖洗45 min，將蟲體置于平皿中晃動，并不停換水，過程中動作一定要輕，以防蟲體損壞，再用蒸餾水迅速沖洗數(shù)次，將清洗好的蟲體置于蘇木素染液中12 h。

1.5.2 脫水 染色后的蟲體分別移入30%、40%、50%、60%和70%乙醇中脫水各1 h，用酸酒精褪色20 min，取出后放入70%乙醇中沖洗，洗去蟲體周圍浮色，然后將蟲體分別移入各濃度梯度乙醇(80%、90%、95%和100%)中繼續(xù)脫水各1 h[9-10]。

1.5.3 透明 將無水乙醇中的蟲體挑出后，移入無水乙醇和丁香油原液比例為1∶1的透明液中透明(肝片吸蟲和胰闊盤吸蟲1 h,鹿前后盤吸蟲和土耳其斯坦東畢吸蟲30 min)，再用丁香油原液各透明1 h。

1.5.4 封片 用挑蟲針輕輕挑取透明后的蟲體放在已洗凈的載玻片上，距離磨砂面約2.5 cm處，用挑蟲針調(diào)整蟲體，使蟲體盡量平直，然后在蟲體處滴加適量中性樹膠，用蓋玻片封片，將制備好的玻片平放在載玻片架上，將其放入37 ℃溫箱中直至排凈氣泡，取出后室溫陰干。

1.6 硼砂卡紅染色方法

1.6.1 染色 沖洗蟲體的步驟同1.5.1。將清洗好的蟲體置于硼砂卡紅染液中染色(肝片吸蟲和胰闊盤吸蟲24 h，鹿前后盤吸蟲18 h，土耳其斯坦東畢吸蟲12 h)。

1.6.2 脫水 染色后的蟲體在30%、40%、50%、60%和70%的乙醇中分別脫水(鹿前后盤吸蟲和土耳其斯坦東畢吸蟲45 min，肝片吸蟲和胰闊盤吸蟲1 h)，移入酸酒精中脫色30 s，取出蟲體放入70%乙醇中沖洗，洗去蟲體周圍浮色，然后將蟲體移入各級乙醇(80%、90%、95%和100%)中繼續(xù)脫水45 min。

1.6.3 透明 同1.5.3。

1.6.4 封片 同1.5.4。

2 結(jié)果

2.1 肝片吸蟲蘇木素染色方法 肝片吸蟲蘇木素染色鏡檢為紫黃色，柳葉狀，子宮黃染、結(jié)構(gòu)完整、立體感強，其內(nèi)部充滿大量黑染的蟲卵，蟲卵的形狀和走向清晰可見(圖1A)。卵巢為深紫色，與卵黃腺、中段腸管、卵模界限清晰，易于分辨(圖1B)?？谖P和蟲體前端腸管結(jié)構(gòu)清晰(圖1C)。雄莖囊和貯精囊結(jié)構(gòu)清晰，染色后顏色不同，易于分辨(圖1D)。

圖1 肝片吸蟲蘇木素染色

2.2 肝片吸蟲硼砂卡紅染色方法 肝片吸蟲硼砂卡紅染色鏡檢為紅黃色，柳葉狀，子宮黑染、結(jié)構(gòu)完整、立體感強，其內(nèi)部充滿大量蟲卵，蟲卵不易觀察(圖2A)。卵巢為粉色，與卵黃腺、中段腸管、卵模界限不清晰，不易分辨(圖2B)?？谖P和蟲體前端腸管結(jié)構(gòu)清晰(圖2C)。雄莖囊和貯精囊結(jié)構(gòu)模糊(圖2D)。

圖2 肝片吸蟲硼砂卡紅染色

2.3 胰闊盤吸蟲蘇木素染色方法 胰闊盤吸蟲蘇木素染色鏡檢為紫褐色，口吸盤和腹吸盤黃染，結(jié)構(gòu)清楚(圖3A)。子宮盤曲于蟲體后部，內(nèi)充滿蟲卵，子宮染色后顏色的深淺可以判斷蟲卵的成熟度和子宮的走向；卵黃腺褐色，位于蟲體中部兩側(cè)，與子宮染色不同，易于分辨(圖3B)。卵巢和睪丸深褐色(圖3C)。雄莖囊黃染呈長管狀，位于腹吸盤前方，雄莖囊內(nèi)的貯精囊、前列腺等組織器官結(jié)構(gòu)層次清晰；咽、食道和盲腸之間邊界清晰，易看清各部結(jié)構(gòu)；生殖孔開口于腸管分支的后方，蟲卵從此口排出(圖3D)。

圖3 胰闊盤吸蟲蘇木素染色

2.4 胰闊盤吸蟲硼砂卡紅染色方法 胰闊盤吸蟲硼砂卡紅染色鏡檢為紅色，口吸盤和腹吸盤紅染，結(jié)構(gòu)清楚(圖4A)。子宮盤曲于蟲體后部，內(nèi)充滿蟲卵，子宮染色后顏色的深淺可以判斷蟲卵的成熟度和子宮的走向；卵黃腺褐色，位于蟲體中部兩側(cè)，與子宮染色不同，易于分辨(圖4B)。卵巢和睪丸深紅色(圖4C)。腸管、雄莖囊、貯精囊、前列腺、生殖孔等組織器官粉染，之間邊界不清晰，不易看清各部結(jié)構(gòu)(圖4D)。

圖4 胰闊盤吸蟲硼砂卡紅染色

2.5 鹿前后盤吸蟲蘇木素染色方法 鹿前后盤吸蟲蘇木素染色鏡檢為紫紅色，蟲體內(nèi)部器官色差大(圖5A)?？谖P、食道和腸管與周圍其他組織器官邊界清晰；生殖孔結(jié)構(gòu)清晰(圖5B)。2個橢圓形睪丸前后排列于蟲體中部，呈紫色(圖5C)。紫色的卵巢顏色較深，和淡紫色的卵黃腺易于區(qū)分(圖5D)。

圖5 鹿前后盤吸蟲蘇木素染色

2.6 鹿前后盤吸蟲硼砂卡紅染色方法 鹿前后盤吸蟲硼砂卡紅染色鏡檢為黃色，蟲體內(nèi)部器官色差不大(圖6A)。口吸盤、食道和腸管輪廓清晰；生殖孔結(jié)構(gòu)不清晰(圖6B)。2個橢圓形睪丸前后排列于蟲體中部(圖6C)。卵巢、卵黃腺模糊，不易區(qū)分(圖6D)。

圖6 鹿前后盤吸蟲硼砂卡紅染色

2.7 土耳其斯坦東畢吸蟲蘇木素染色方法 土耳其斯坦東畢吸蟲蘇木素染色鏡檢為紫色(圖7A)。睪丸呈橢圓形，78～80個，蘇木素染色后為深紫色，與周圍其他組織器官界限分明，立體感強，易于觀察(圖7B)。抱雌溝結(jié)構(gòu)分明，雌蟲在抱雌溝內(nèi)顏色與其不同，易于分辨(圖7C)。清晰可見食道在腹吸盤前方分為2條腸支(圖7D)。

2.8 土耳其斯坦東畢吸蟲硼砂卡紅染色方法 土耳其斯坦東畢吸蟲硼砂卡紅染色鏡檢為粉色，口吸盤和腹吸盤清晰可見(圖8A)。睪丸染色后顏色與周圍組織相同，不易分辨(圖8B)。腹吸盤開始至蟲體后端的兩側(cè)體壁向腹面卷曲形成“抱雌溝”，抱雌溝結(jié)構(gòu)清晰(圖8C)?？梢娛车涝诟刮P前方分為2條腸支(圖8D)。

圖8 土耳其斯坦東畢吸蟲硼砂卡紅染色

3 討論

吸蟲除分體吸蟲外，皆雌雄同體[11]。吸蟲主要的形態(tài)構(gòu)造包括口吸盤、腹吸盤、生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)[12-13]。形態(tài)學檢驗仍然是臨床實驗室最快捷簡便、經(jīng)濟實用的常規(guī)檢驗方法，染色是形態(tài)學檢驗常用方法之一[14]。吸蟲永久玻片標本制作方法的文獻報道很少，經(jīng)查閱其他染色方法的文獻，蘇木素是一種比較常見的堿性、永久性染色劑。本試驗發(fā)現(xiàn)蘇木素染液滲透與著色能力強，需要較長時間脫色，且染色后的組織器官明顯，蟲體清晰。硼砂卡紅染液滲透性不強，染色能力較弱，顏色均勻。

染色是一個復雜的過程，染色的效果和染色時間長短需依據(jù)染劑對組織的染色作用、實驗室溫度、蟲體大小、厚薄、固定液的選擇、染液放置的時間長短等因素進行調(diào)節(jié)[15]。較大的蟲體可適當延長染色時間，使其充分染色、均勻染色，與此同時脫水和透明時間也要相應延長，試驗證明延長脫水和透明時間對標本染色沒有不良影響。組織脫水時應逐步進行，通過逐級提高乙醇濃度將水分脫凈，該過程不能操之過急，否則會引起組織強烈收縮，使蟲體發(fā)生變形。在本試驗過程中就出現(xiàn)了標本表面有層霧狀膜的現(xiàn)象，原因主要是脫水、透明等步驟不夠徹底。如果出現(xiàn)這種現(xiàn)象，必須立即更換100%乙醇脫水，繼續(xù)透明。

本試驗結(jié)果表明，同一種蟲體蘇木素染色方法較硼砂卡紅染色方法用時短，蘇木素染色4種吸蟲的效果更佳。對于個別大且厚的吸蟲，染色時間和透明時間可以延長。