鄭孟加，馬 萌，王永強，高 麗，曹 紅，李淑芹，李曉齊，鄭世軍

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物流行病學(xué)重點實驗室，北京 海淀 100193)

1995年，Okamura等從中毒休克的小鼠肝臟中分離到1種可以誘導(dǎo)Th細胞和NK細胞產(chǎn)生γ干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)的物質(zhì)，被稱為IFN-γ誘生因子(IFN-gamma-inducing factor,IGIF)[1]。1996年，Ushio等將其正式命名為白介素18(Interleukin-18,IL-18)[2]。IL-18是重要的免疫調(diào)節(jié)分子，通常以前體的狀態(tài)存在于細胞內(nèi)部，當(dāng)機體受到細菌或病毒刺激時，其前體會被炎性小體切割形成有活性的IL-18并釋放到胞外[3]，因此IL-18可以作為檢測炎性小體介導(dǎo)的細胞焦亡的重要指標(biāo)，也是檢測先天性免疫應(yīng)答炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)。雞IL-18與人和小鼠IL-18氨基酸同源性分別為34%和27%，目前國內(nèi)外用于檢測chIL-18的商品化單克隆抗體或試劑盒較為罕見。為此，本試驗制備了抗chIL-18單克隆抗體，為深入研究chIL-18的生物學(xué)功能及炎性小體細胞焦亡的檢測打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細菌種類、蛋白、細胞類型和實驗動物 pGEX-6p-1、pET-28a兩種質(zhì)粒，大腸埃希菌(E.coli)BL21/DH5α，標(biāo)簽蛋白His-IL-1、His-IFN-β、His-IL-10，骨髓瘤細胞SP2/0，均為本實驗室留存；6～8周齡BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2021—0006。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 限制性內(nèi)切酶，購自NEB公司；DNA膠回收試劑盒，購自Zymo公司；DNA連接酶和蛋白Marker,購自TaKaRa有限公司；Ni-NTA親和純化柱,購自德國Qiagen公司；凝膠Glutathione Sephrose 4B，購自GE Healthcare BioSciences AB公司；質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校徸员本┌氯R公司；鼠源抗His、GST單克隆抗體，購自Abmart公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，購自鼎國昌盛公司；弗氏完全/不完全佐劑、HAT、HT、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents鑒定試劑盒、DMEM粉劑、胎牛血清、DMSO和HEPES，均購自Cibco公司。凝膠成像分析儀，購自美國Alpha公司；96孔酶標(biāo)儀，購自TECAN公司；低溫冷凍高速離心機，購自Eppendorf公司。

1.3 chIL-18重組質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白表達 根據(jù)NCBI上發(fā)表的chIL-18的序列(GenBank ID：AJ277865.1)設(shè)計特異性引物：F1(5′-ATGAGCTGTGAAGAGATCGC-3′)、R1(5′-TCATAGGTTGTGCCTT-TCATTA-3′)，以感染沙門菌的雞脾細胞制備的cDNA為模板，擴增chIL-18基因；將擴增得到的特異性條帶回收后連接至T載體，并設(shè)計含有BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點的特異性引物F2(5′-GGATCCATGAGCTGTGAAGAGATCGC-3′)、R2(5′-CTCGA-GTCATAGGTTGTGCCTTTCAT-3′)，以測序正確的質(zhì)粒為模板對chIL-18基因進行擴增；利用雙酶切方法將chIL-18基因連接到pET-28a和pGEX-6p-1載體上，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α，隨后對重組質(zhì)粒進行PCR擴增和測序鑒定。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸埃希菌BL21中，加入IPTG對其進行誘導(dǎo)表達，對產(chǎn)生的蛋白進行SDS-PAGE和Western blot鑒定，隨后利用親和層析法純化鑒定正確的蛋白，高純度的2種蛋白分別用作小鼠免疫和陽性雜交瘤細胞篩選的抗原。

1.4 chIL-18單克隆抗體的制備與純化 免疫小鼠3次后，以間接ELISA方法檢測小鼠chIL-18陽性血清效價水平，效價足夠高的小鼠脾細胞可用來進行細胞融合。小鼠免疫程序參照參考文獻[4]進行，細胞融合、陽性雜交瘤篩選過程參照參考文獻[5]進行。單抗的大量制備與純化參照參考文獻[6]所述方法進行。

1.5 chIL-18單克隆抗體的鑒定

1.5.1 單克隆抗體亞型的鑒定 按Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents說明書測定單克隆抗體亞型。

1.5.2 單克隆抗體親和力的鑒定 利用間接ELISA方法測定單克隆抗體的親和力，以1 μg/mL重組蛋白GST-chIL-18為包被抗原，將待檢測的單克隆抗體加入其中，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，使用酶標(biāo)儀測定OD450處吸光值。數(shù)據(jù)的計算和分析參照參考文獻[7]的方法進行。

1.5.3 單克隆抗體交叉反應(yīng)性的鑒定 以原核系統(tǒng)表達的His-chIL-18、His-chIL-1、His-chIL-10、His-IFN-β蛋白為抗原，一抗以制備好的2株chIL-18單克隆抗體和His-tag單克隆抗體，二抗使用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG進行Western blot試驗，檢測單抗的交叉反應(yīng)性。

1.5.4 單克隆抗體抗原識別區(qū)域的鑒定 分別以chIL-18 N端第57位和第113位氨基酸為截點，構(gòu)建3個chIL-18的截短重組質(zhì)粒。以大腸埃希菌 BL21中誘導(dǎo)表達的截短蛋白為抗原，以制備的chIL-18單克隆抗體為一抗，使用Western blot方法鑒定2株單克隆抗體的氨基酸識別區(qū)域。

2 結(jié)果

2.1 chIL-18重組質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白表達 所構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定、基因測序，所得結(jié)果與預(yù)期一致(圖1A～1C)。重組質(zhì)粒在E.coliBL21中誘導(dǎo)表達后，經(jīng)SDS-PAGE分析(圖1D和1E)及Western blot鑒定(圖1F和1G)，確定His-chIL-18和GST-chIL-18重組蛋白均在預(yù)期目的蛋白大小處有表達。

圖1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與蛋白的表達

2.2 chIL-18單克隆抗體的制備與純化 免疫小鼠3次后，測定小鼠血清中chIL-18抗體效價達到1∶64 000。經(jīng)過細胞融合、陽性雜交瘤篩選、亞克隆等過程，篩選到2株穩(wěn)定分泌chIL-18蛋白抗體的雜交瘤細胞株，將其分別稱作2A7和2G5。將篩選的雜交瘤細胞注射進小鼠腹腔中，利用鹽析法和親和層析法對抽取后的腹水進行純化，得到高純度的單克隆抗體(圖2)。

圖2 單克隆抗體的純化

2.3 chIL-8單克隆抗體的鑒定

2.3.1 單克隆抗體亞型的鑒定 使用 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents 試劑盒檢測，結(jié)果顯示2株單克隆抗體的亞型均是IgG1型。

2.3.2 單克隆抗體親和力的鑒定 利用間接ELISA方法對單抗的親和力進行鑒定，結(jié)果顯示2A7和2G5的親和力解離常數(shù)(Kd)分別為4.4×10-12和2.06×10-10(圖3)，表明親和力良好。

圖3 單克隆抗體2A7(A)和2G5(B)親和力的鑒定

2.3.3 單克隆抗體交叉反應(yīng)性的鑒定 使用Western blot檢測方法測定單抗對原核系統(tǒng)表達的其他細胞因子識別情況，結(jié)果顯示2株單抗都能識別His-chIL-18，但是不識別帶有His標(biāo)簽的chIL-1、chIL-10、chIFN-β的蛋白，無交叉反應(yīng)性(圖4)。

圖4 單克隆抗體交叉反應(yīng)性的鑒定

2.3.4 單克隆抗體抗原識別區(qū)域的鑒定 抗原為mchIL-18截短蛋白，一抗為制備單克隆抗體，使用Western blot方法確定單克隆抗體的氨基酸識別區(qū)域。結(jié)果顯示，2A7和2G5分別識別mchIL-18蛋白N端的第57～113位和第114～169位氨基酸(圖5)。

圖5 單克隆抗體抗原識別區(qū)的鑒定

3 討論

人和小鼠IL-18成熟蛋白均由157個氨基酸組成，無信號肽和糖基化位點，它們之間氨基酸同源性為60%[8-9]。chIL-18基因位于第24號染色體上，成熟蛋白由169個氨基酸組成，與人和小鼠等哺乳動物相比肽鏈較長，其功能與人IL-18相似[10]。經(jīng)分析，chIL-18與人IL-18和小鼠IL-18氨基酸同源性僅分別為34%和28%，因此推測chIL-18抗體不能識別哺乳動物的IL-18蛋白。

獲得的2株雜交瘤均分泌高親合力抗體，而高親和力抗體識別不同抗原表位是制備夾心ELISA試劑盒的必備條件?？乖砦皇怯?～7個氨基酸組成的特殊化學(xué)基團[11]，為了鑒定單抗的抗原識別區(qū)，本試驗構(gòu)建了chIL-18的3個截短蛋白，分別為chIL-18的1～57 aa、58～113 aa和114～169 aa，結(jié)果表明這2株抗體可以識別不同的抗原表位，這為chIL-18雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立和深入研究家禽先天性免疫炎癥反應(yīng)提供了有價值的手段。