陳美先，卓清緣，柴民偉，王健松，王羚酈*（.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣州 50006；.北京大學(xué)深圳研究生院環(huán)境與能源學(xué)院，廣東 深圳 58055）

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2020年結(jié)直腸癌在全球的發(fā)病率排第三，病死率排第二[1]。目前西醫(yī)治療腫瘤以手術(shù)、放化療、分子靶向、內(nèi)分泌治療及一些新輔助治療等綜合治療為主[2-3]，但因其毒副作用大且預(yù)后差而具有一定的局限性。因此，在植物中尋找天然抗腫瘤活性物質(zhì)一直是抗腫瘤藥物研究的熱點。

木欖（Bruguiera gymnorrhiza）是紅樹科木欖屬植物，是一種傳統(tǒng)海洋藥用植物，已被《中國藥用植物志》《海洋藥物》《現(xiàn)代本草綱目》等中草藥專著收載。據(jù)記載，木欖的葉、胚軸、樹皮等部位均可入藥，主要功效有清熱解毒、止瀉、消炎、收斂、止血、截瘧等[4-6]。目前已有研究表明木欖胚軸中的一些化合物具有體外抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用[7]，但對其他腫瘤細(xì)胞是否具有生長抑制作用，未見相關(guān)報道，抗腫瘤的分子機制也尚未完全闡明。

細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡在人類組織的正常發(fā)育和平衡中發(fā)揮著重要作用，同時也與許多疾病狀態(tài)有關(guān)，包括癌癥[8]。中藥總黃酮提取物是一類潛在的抗腫瘤有效成分[9-11]。在前期研究中初步發(fā)現(xiàn)了木欖胚軸的總黃酮（total flavoniods fromBruguiera gymnorrhizahypocotyls，TFBH） 成分具有體外抗結(jié)腸癌活性。因此，本研究從木欖胚軸中提取、富集了總黃酮成分，首次探究TFBH對人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞增殖和遷移的影響，并結(jié)合細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡共同探究其作用機制，為進一步闡明木欖胚軸的抗腫瘤活性及其作用機制提供參考和依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29（武漢普諾賽生命科技有限公司）。采用含10%胎牛血清和含1%雙抗生素的McCoy’s 5A 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 試藥

TFBH：用10 倍量的70%乙醇在室溫下超聲提取1.0 kg 木欖胚軸干燥粉末，過濾后將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用適量的水將濃縮后的浸膏溶解，于D101 大孔樹脂上分離，分離條件為50%乙醇，低溫濃縮干燥后用二甲基亞砜（DMSO）制備成125 μg·μL－1的儲備液，置于4℃密封保存；以蘆丁為對照品，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法[12]測定TFBH 的總黃酮含量為83.02%。所用植物部位于2021年采于深圳福田紅樹林保護區(qū)，經(jīng)北京大學(xué)環(huán)境與能源學(xué)院柴民偉教授鑒定。

McCoy’s 5A 培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司）；雙抗生素（美國Thermo Fisher Scientific公司）；胎牛血清（德國PAN-Biotech 公司）；蘆?。℉PLC ≥98%）、D101 大孔吸附樹脂（上海源葉生物科技有限公司）；MTT（德國BioFroxx 公司）；DMSO（MP Biomedicals LLC.）；Hoechst 33258、Tris-甘氨酸-SDS-電泳緩沖液（Biosharp 生物科技有限公司）；細(xì)胞周期試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海貝博生物公司）；RIPA 裂解液、蛋白上樣緩沖液（5×）、無蛋白快速封閉液（5×）（上海雅酶生物科技有限公司）；無蛋白快速轉(zhuǎn)膜液（20×）（蘇州新賽美生物科技有限公司）；胰酶消化液、蛋白marker（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；PVDF 膜（美國Millipore 公司）；ECL 化學(xué)發(fā)光液、Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、β-actin 抗體、HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗（Affinity Biosciences LTD）。

1.3 儀器

多功能酶標(biāo)儀（型號Multiskan GO，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；BD LSRFortessa 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；熒光顯微鏡[型號BX53，奧林巴斯（中國）有限公司]；SDS-PAGE 電泳儀[型號EP300，韋克斯（北京）科技有限公司]；全自動化學(xué)曝光分析系統(tǒng)（型號COMPLEX2000，Bioworld 公司）。

2 方法

2.1 MTT 法檢測細(xì)胞增殖情況

取對數(shù)生長期的HT-29 細(xì)胞以合適的細(xì)胞密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24 h。棄去原培養(yǎng)基并加入含0.2%DMSO 的培養(yǎng)基和不同質(zhì)量濃度TFBH（25、50、100、200、250 μg·mL－1）的含藥培養(yǎng)基，每組6 個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h 和48 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化后，每孔加入20 μL MTT（PBS 稀釋至 5 mg·mL－1），置于恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h 后吸棄上清，每孔加150 μL 的DMSO 以溶解由活細(xì)胞代謝產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物，搖床上震蕩10 min，用多功能酶標(biāo)儀在570 nm 波長處檢測各孔的吸光度（A）。使用GraphPad 軟件計算細(xì)胞增殖抑制率及IC50值。

2.2 劃痕實驗

將HT-29 細(xì)胞以合適密度接種于6 孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度至90%左右，使用直尺和200 μL 槍頭在每個孔中進行輕微的直線劃痕，用PBS 清洗細(xì)胞碎片。根據(jù)給藥濃度分為3 組，以接近1 倍IC50值作為高劑量組（62.5 μg·mL－1），以接近4/5 倍IC50值作為中劑量組（50 μg·mL－1），以接近3/5 倍IC50值作為低劑量組（37.5 μg·mL－1）。加入含有TFBH 藥物（37.5、50、62.5 μg·mL－1）的完全培養(yǎng)基2 mL，對照組加入等體積的培養(yǎng)基，在顯微鏡下進行拍照，記錄細(xì)胞0 h、24 h 的遷移距離，用Image J軟件分析遷移能力，計算HT-29 細(xì)胞的遷移率。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

取對數(shù)生長期的HT-29 細(xì)胞消化并計數(shù)，接種于6 孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入質(zhì)量濃度分別為37.5、50、62.5 μg·mL－1的TFBH，對照組加入等體積的培養(yǎng)基，每組設(shè)3 個復(fù)孔，處理細(xì)胞24 h。胰酶消化細(xì)胞，計數(shù)，離心。用500 μL PBS 重懸細(xì)胞，緩慢滴加2 mL 預(yù)冷的無水乙醇固定細(xì)胞，4℃放置過夜。根據(jù)細(xì)胞周期試劑盒步驟進行染色，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。每組實驗重復(fù)3 次，Modfit 軟件分析細(xì)胞生長各期的所占比例。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

選取生長狀態(tài)良好的HT-29 細(xì)胞消化并計數(shù)，接種于6 孔板中，接種密度5×106個/孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入質(zhì)量濃度分別為37.5、50、62.5 μg·mL－1的TFBH，對照組加入等體積的培養(yǎng)基。作用24 h后使用無EDTA 的胰酶消化并收集細(xì)胞。按照Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒說明書操作細(xì)胞染色，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。每組實驗重復(fù)3次，F(xiàn)low Jo V10 軟件分析Annexin V-FITC 陽性細(xì)胞所占比例，即細(xì)胞凋亡率。

2.5 Hoechst 33258 染色觀察細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的HT-29 細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105個·mL－1的細(xì)胞懸液。將制備好的細(xì)胞懸液接種于加入細(xì)胞爬片的12 孔板，每孔1 mL，輕微晃動，使細(xì)胞均勻鋪在爬片上。24 h 后棄去原培養(yǎng)液，加入1 mL 質(zhì)量濃度分別為37.5、50、62.5 μg·mL－1的TFBH，對照組加入等體積的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)液，PBS 漂洗1 min×2 次；4%多聚甲醛固定15 min，PBS 漂洗3 min×2 次；每孔加入Hoechst 33258 染色劑30 μL，室溫條件下避光染色10 min。染色完畢，PBS 漂洗3 min×2 次。在紫外光340 nm 的波長處激發(fā)，顯微鏡下觀察不同組別的熒光強度情況。

2.6 Western blot

取對數(shù)生長期的HT-29 細(xì)胞，接種于6 孔板中，接種密度5×106個/孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入質(zhì)量濃度分別為37.5、50、62.5 μg·mL－1的TFBH，對照組加入等體積的培養(yǎng)基，處理24 h 后提取細(xì)胞總蛋白。將細(xì)胞置于冰上，加入RIPA 裂解液裂解30 min，12 000 r·min－1、4℃離心10 min。取上清液分裝于1.5 mL 離心管中，BCA 法測定蛋白濃度，蛋白變性后于－80℃保存。蛋白上樣后SDSPAGE 電泳，快速轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后快速封閉10 min；孵育一抗，4℃放置過夜，TBST 清洗10 min×3次；二抗室溫孵育1.5 h，TBST 清洗10 min×3次；ECL 化學(xué)發(fā)光，于全自動化學(xué)曝光分析系統(tǒng)內(nèi)進行曝光，分析各組蛋白表達情況。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0、GraphPad Prism 7.0、Image J 等軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，每組實驗重復(fù)3次，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，如滿足方差齊性用LSD分析，若不滿足方差齊性則用Dunnett T3 分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 TFBH 對HT-29 細(xì)胞增殖能力的影響

結(jié)果顯示，TFBH 對HT-29 細(xì)胞有生長抑制作用，呈時間和濃度依賴關(guān)系（見圖1）。TFBH作用于結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞12 h、24 h 和48 h 后的IC50值分別為（307.80±4.28）、（178.30±7.00）、（63.37±8.42）μg·mL－1，可見TFBH 對HT-29 細(xì)胞增殖抑制的最佳時間為48 h。在光學(xué)顯微鏡下觀察TFBH 作用HT-29 細(xì)胞48 h 后的細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果顯示隨著給藥濃度增大，細(xì)胞界限模糊，細(xì)胞皺縮變小的程度逐漸加深，見圖1。

圖1 TFBH 對HT-29 細(xì)胞增殖的影響（×100）Fig 1 Effect of TFBH on the proliferation of HT-29 cells（×100）

3.2 TFBH 對HT-29 細(xì)胞遷移率的影響

利用劃痕實驗檢測TFBH 是否抑制HT-29 細(xì)胞發(fā)生遷移，結(jié)果見圖2，細(xì)胞遷移率隨TFBH給藥濃度的增加而降低。與對照組比較，50、62.5 μg·mL－1TFBH 組的細(xì)胞遷移率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.001），可見TFBH 能夠抑制HT-29 細(xì)胞發(fā)生遷移。

圖2 TFBH 對HT-29 細(xì)胞遷移的抑制作用（×40）Fig 2 Inhibitory effect of TFBH on HT-29 cell migration（×40）

3.3 TFBH 對HT-29 細(xì)胞周期的影響

TFBH 對HT-29 細(xì)胞周期中各個時期所占比例的影響見圖3。結(jié)果顯示，與對照組相比，TFBH 給藥組的G0/G1期和G2/M 期的比例呈上升趨勢，S 期的比例呈下降趨勢，其中TFBH 62.5 μg·mL－1組的G0/G1期、S 期和G2/M 期與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。以上結(jié)果說明，TFBH 可誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞周期發(fā)生G0/G1期和G2/M 期阻滯。

圖3 TFBH 對HT-29 細(xì)胞周期的影響Fig 3 Effect of TFBH on cell cycle of HT-29 cells

3.4 TFBH 對HT-29 細(xì)胞凋亡率的影響

Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測結(jié)果如圖4所示。TFBH 給藥組均可誘導(dǎo)HT-29 細(xì)胞發(fā)生不同程度的凋亡。與對照組比較，TFBH 各給藥組的凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

圖4 TFBH 對結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞凋亡的影響Fig 4 Effect of TFBH on apoptosis of HT-29 cells

3.5 TFBH 對細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

Hoechst 33258 染色后在熒光顯微鏡下可觀察到活細(xì)胞細(xì)胞核呈彌散均勻的弱藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞核可見致密濃染的亮藍(lán)色熒光。結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞核形態(tài)較為一致，顯弱藍(lán)色熒光。與對照組相比，TFBH 各給藥組處理細(xì)胞后，均能觀察到亮藍(lán)色熒光的細(xì)胞核數(shù)量有所增加（見圖5），各組凋亡細(xì)胞核的熒光強度與TFBH 給藥濃度成正相關(guān)。

圖5 TFBH 對HT-29 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響（×200，×400）Fig 5 Effect of TFBH on morphological features of apoptosis of HT-29 cells（×200，×400）

3.6 TFBH 對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

如圖6所示，TFBH 各給藥組作用HT-29 細(xì)胞24 h 后，凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3 表達均有上調(diào)趨勢，Bcl-2 蛋白表達下調(diào)，并且存在濃度依賴性。與對照組相比，TFBH 各給藥組的cleaved caspase-3/caspase-3 以及50、62.5 μg·mL－1TFBH 組的Bax/Bcl-2、cleaved caspase-9/caspase-9 相對蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

圖6 TFBH 對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平的影響Fig 6 Effect of TFBH on the expression levels of cell apoptosis related proteins

3.7 TFBH 對PI3K/Akt 信號通路蛋白的影響

通過檢測PI3K/Akt 信號通路相關(guān)蛋白表達水平探究其是否參與TFBH 對細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果如圖7所示。與對照組相比，TFBH 處理24 h后，該通路關(guān)鍵蛋白p-PI3K 和p-Akt 的表達量顯著降低，TFBH 各給藥組的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 相對蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.001）。

圖7 TFBH 對PI3K/Akt 信號通路相關(guān)蛋白表達水平的影響Fig 7 Effect of TFBH on the expression levels of related proteins in the PI3K/Akt signaling pathway

4 討論

4.1 實驗方法分析

MTT 實驗證明TFBH 抑制HT-29 細(xì)胞增殖的最佳時間為48 h，而本研究在其他實驗中的藥物處理時間為24 h 的原因是，在實驗過程中，當(dāng)給藥處理時間為48 h 時，6 孔板中的中、高劑量組的貼壁細(xì)胞出現(xiàn)大片脫落，懸浮在培養(yǎng)液中，這種情況對細(xì)胞凋亡指標(biāo)的檢測會產(chǎn)生較大的影響和誤差；而當(dāng)處理時間為24 h 時，貼壁細(xì)胞發(fā)生脫落的情況較少、程度較輕，綜合流式細(xì)胞實驗的結(jié)果可以看出，給藥處理24 h 后，低、中、高劑量組的凋亡率與對照組間有明顯的差異，所以統(tǒng)一將給藥處理時間定為24 h。

4.2 實驗結(jié)果分析

本研究從細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡表型實驗評價TFBH 抑制HT-29 細(xì)胞增殖和遷移的主要作用。從實驗結(jié)果來看，TFBH 能明顯抑制HT-29 細(xì)胞增殖，但抑制HT-29 細(xì)胞的遷移能力相對較弱。TFBH 可以阻滯HT-29 細(xì)胞周期中的G0/G1期和G2/M 期，但僅高劑量組的作用效果較為明顯。本研究中的Hoechst 33258 細(xì)胞核染色和流式細(xì)胞術(shù)實驗共同證明了TFBH 各劑量組均可誘導(dǎo)HT-29 細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且提示在給藥時間為24 h 時，TFBH 主要誘導(dǎo)HT-29 細(xì)胞發(fā)生早期凋亡。以上結(jié)果表明，TFBH 誘導(dǎo)HT-29 細(xì)胞發(fā)生凋亡比阻滯其細(xì)胞周期的作用更為明顯。因此，本研究中機制探究的重點在于TFBH 如何誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞發(fā)生凋亡。

4.3 機制研究

PI3K/Akt 信號通路作為一個關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在控制細(xì)胞生長、增殖和凋亡中扮演著重要的角色。PI3K 激活后可以通過磷酸化Akt的thr308 位點激活A(yù)kt[13]。磷酸化Akt 通過調(diào)節(jié)Bcl-2 蛋白家族來控制細(xì)胞凋亡[14]?；罨腁kt 可以磷酸化Bad 蛋白的ser136 位點，導(dǎo)致Bcl-2 的釋放，與Bax 結(jié)合形成二聚體，或者磷酸化Bax 蛋白的ser184 位點，與Bcl-2 結(jié)合形成二聚體。因此，上述兩種由Akt 引起的Bcl-2 蛋白家族的磷酸化方式都可以起到抑制凋亡的作用[15-16]。另一方面，細(xì)胞凋亡是一種自主細(xì)胞程序性死亡，受外源途徑和內(nèi)源途徑控制，其中涉及線粒體的內(nèi)源途徑是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一[17]。Bcl-2 蛋白家族與線粒體凋亡途徑密切相關(guān)，是改變線粒體內(nèi)膜通透性的重要調(diào)控因子，稱為線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔[18]。根據(jù)細(xì)胞凋亡過程中不同的功能，Bcl-2 蛋白家族可分為促進細(xì)胞凋亡的Bax 蛋白亞家族和抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-2蛋白亞家族[19]，通過調(diào)節(jié)促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白的比例，特別是Bax/Bcl-2 的比例，可以促進或抑制凋亡。本研究表明，TFBH 可通過上調(diào)Bax/Bcl-2 的比例從而促進凋亡。

Caspase 是一個在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族。當(dāng)Bcl-2 蛋白家族誘發(fā)線粒體凋亡時，線粒體受損釋放細(xì)胞色素C，pro caspase-9 可以和細(xì)胞色素C 以及Apaf1 形成復(fù)合物，同時被激活。激活的caspase-9（cleaved caspase-9）可以激活細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶caspase-3，進一步激活后續(xù)的細(xì)胞凋亡信號[20]。Caspase-3 是細(xì)胞凋亡過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行分子之一，可以剪切細(xì)胞凋亡過程中的許多關(guān)鍵蛋白，例如PARP。Caspase-3 的激活需要從沒有活性的全長caspase-3，在asp28 和ser29 之間及asp175 和ser176 之間進行剪切，產(chǎn)生有活性的cleaved caspase-3。因此caspase-3 的激活常被作為細(xì)胞凋亡的一個重要指標(biāo)[21]。本研究結(jié)果顯示，TFBH 各給藥組中的cleaved caspase-9/caspase-9、cleaved caspase-3/caspase-3 相對蛋白表達上升，說明TFBH 很可能是通過caspase 級聯(lián)反應(yīng)激活caspase-9，然后激活caspase-3，從而促進細(xì)胞凋亡。

4.4 總結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)，TFBH 可以在體外抑制人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞的增殖和遷移。TFBH 能通過阻滯HT-29 細(xì)胞周期的G0/G1期和G2/M 期以及誘導(dǎo)HT-29 發(fā)生凋亡抑制細(xì)胞生長。TFBH 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機制與抑制PI3K/Akt 信號通路有關(guān)，通過上調(diào)Bax/Bcl-2、cleaved caspase-9/caspase-9以及cleaved caspase-3/caspase-3 的表達激活線粒體內(nèi)源性凋亡途徑并進一步激活caspase 級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。但本研究并未考察TFBH 對HT-29 細(xì)胞侵襲的作用，也沒有深入探究TFBH阻滯細(xì)胞周期的作用機制，這將成為今后研究的方向。另有研究表明，PI3K/Akt 與mTOR 蛋白的關(guān)系密切，PI3K/Akt/mTOR 通路同樣可以調(diào)控細(xì)胞凋亡，甚至是細(xì)胞自噬[22-25]。因此在今后的研究中，還可結(jié)合相關(guān)實驗證明TFBH 在抑制腫瘤生長過程中是否促進或抑制細(xì)胞發(fā)生自噬。