王桂華，王妮拉，陽帆帆，宋穎輝，柴琴*（.南華大學(xué)附屬長沙中心醫(yī)院，長沙 40004；.福州肺科醫(yī)院，福州 50008；.湖南省人民醫(yī)院，長沙 40000）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma） 主要見于北非、中東和亞洲，尤其是我國的華南地區(qū)[1]。在臨床上，大多數(shù)鼻咽癌都是低分化鱗狀細胞癌或未分化癌[2]。鼻咽癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且鼻咽部結(jié)構(gòu)復(fù)雜難以手術(shù)，因此化學(xué)治療和放射治療已成為鼻咽癌治療的主要方法，且放射治療是首選[3]。近年來隨著免疫治療的出現(xiàn)和發(fā)展，其逐漸成為復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性鼻咽癌的一種可選治療手段。此外，放射治療已經(jīng)被證實能通過DNA 損傷和旁路效應(yīng)激活免疫系統(tǒng)，從而提高免疫治療療效[4-5]。放射治療可以單獨應(yīng)用、聯(lián)合化療、聯(lián)合靶向治療以及聯(lián)合免疫治療等手段抗腫瘤，表明放射治療在鼻咽癌的治療中起著至關(guān)重要的作用。雖然放射治療技術(shù)在最近幾年得到了極大的改善，特別是調(diào)強放射治療（intensity-modulated radiation therapy，IMRT）技術(shù)的應(yīng)用[6]，但仍然存在一定的瓶頸，腫瘤細胞的輻射抗性是造成鼻咽癌局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的主要原因[7]。因此，迫切需要探索提高放射治療敏感性的新藥物，從而提高患者的生存期。

引起鼻咽癌輻射抗性的機制非常復(fù)雜，其中最主要的是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducers and activators of transcription 3，Stat3）的異常激活。已證實Stat3 信號通路的持續(xù)激活涉及腫瘤促進活動中的細胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成、宿主免疫逃避和對細胞凋亡的抵抗[8-9]。Stat3被持續(xù)激活并在鼻咽癌細胞的細胞核中表達[10]。最近，有報道稱Stat3 抑制劑Stattic 增強了鼻咽癌的輻射敏感性[11]。Stat3 抑制劑似乎是鼻咽癌細胞輻射敏感性的一種重要靶向抑制劑。

吳茱萸堿（evodiamine，EVO）是從蕓香科植物吳茱萸中提取出的活性生物堿，具有多重藥理作用，包括抗炎、降壓、鎮(zhèn)痛、抗過敏等[12]。同時，EVO 具有抗前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤和結(jié)腸癌等活性[13]。然而，EVO 在鼻咽癌中對輻射敏感性的影響和潛在機制仍不清楚。本研究以鼻咽癌細胞5-8F 和6-10B 為對象，探討EVO 對鼻咽癌細胞的輻射敏感性影響及其作用機制，從而為鼻咽癌放射治療提供新的增敏藥物。

1 材料與方法

1.1 細胞系

鼻咽癌細胞系5-8F 和6-10B 從湘雅醫(yī)學(xué)院細胞庫獲得[14]。鼻咽癌細胞在含有10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基中生長。所有培養(yǎng)基均添加100 U·mL－1青霉素/鏈霉素，細胞在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試藥

EVO（上海愛必信生物科技有限公司），CCK-8 試劑盒（日本熊本同仁化學(xué)研究所），AnnexinV/FITC 檢測試劑盒（北京佳美生物科技有限公司）。

1.3 細胞照射

細胞按分組在6 MV X 線（Varian Accelerator 600 C）室溫下在0～8 Gy 內(nèi)分別照射，受照射的細胞與其他實驗組平行運輸，劑量率：250 MU·min－1，照射射野：15 cm×15 cm，源皮距：100 cm。所有平板在再次照射時均涂上一層補償膠。

1.4 CCK-8 檢測細胞增殖

將指數(shù)生長期收集的鼻咽癌細胞接種在96孔板中，每孔密度為5000 個細胞，分為對照組（0.1%DMSO）或EVO 組（不同濃度），每組設(shè)置5 個孔。EVO 組用EVO 處理細胞24 h、48 h 或72 h 每孔加入10 μL CCK-8 試劑，并將細胞繼續(xù)培養(yǎng)3 h，用酶標儀在450 nm 處測量吸光度（A）值，每組實驗重復(fù)3 次。

1.5 克隆集落形成實驗檢測細胞存活率

將細胞重新計數(shù)、接種到6 孔板上，密度為每孔500 個細胞，加2 mL 培養(yǎng)基培養(yǎng)，待培養(yǎng)24 h 后進行分組，實驗分為對照組、EVO 組（5 μmol·L－1）、照射組（2、4、6、8 Gy）以及EVO 聯(lián)合照射組。培養(yǎng)48 h 后棄去培養(yǎng)基，加入不含藥物的新鮮培養(yǎng)基，細胞繼續(xù)培養(yǎng)12 d 后，用甲醇固定細胞、Giemsa 染色，計算細胞數(shù)超過50 個的集落視為克隆存活。每組實驗重復(fù)3 次。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡

對照組、EVO 組（5 μmol·L－1）、照射組（6 Gy）及EVO 聯(lián)合照射組培養(yǎng)24 h 后，收集并固定在70%乙醇中，4 ℃保存24 h。移去固定液后，細胞用含5 μmol·L－1PI 和50 μmol·L－1RNase 溶液（Sigma Aldrich 試劑）染色，在室溫條件下避光固定30 min。然后使用FACSuite 分析軟件（BD 生物科學(xué)）對細胞周期分布進行精確分析，對細胞周期不同階段的細胞百分比進行統(tǒng)計和比較。每組實驗重復(fù)3 次。細胞分組及處理方法同前，然后用0.25%胰蛋白酶消化、收集，冰PBS 洗滌2 次，用300 μL Binding Buffer 重懸，加入5 μL Annexin-V 和5 μL PI 避光染色15 min，在上機分析前加入200 μL Binding Buffer 重懸，使用FACSuite 分析軟件對細胞凋亡情況進行分析，每組實驗重復(fù)3 次。

1.7 流式細胞術(shù)檢測活性氧

使用活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒檢測細胞ROS 水平，使用FACSuite分析軟件分析ROS 水平，每組實驗重復(fù)3 次。

1.8 Western blot 法檢測蛋白表達程度

首先加入細胞裂解液提取所有細胞蛋白，然后使用Micro BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，將總蛋白質(zhì)（20 μg）上樣到每個樣孔中。使用以下抗體和稀釋液用作上樣對照：抗stat3 抗體（1∶1000）、抗磷酸化stat3 抗體（1∶1000），抗GAPDH 抗體（1∶2000）。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

每組數(shù)據(jù)均經(jīng)過3 次獨立重復(fù)實驗后得出，實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差表示，用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 進行數(shù)據(jù)分析。采用單因素方差分析對各組之間的差異進行統(tǒng)計顯著性檢驗，P≤0.05 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。圖表使用GraphPad Prism 5 軟件生成，放射生物學(xué)參數(shù)用Sigmaplot 10.0 軟件線性二次方程計算模型，輻療增敏比（SER）D0/Dq由照射的細胞與EVO 聯(lián)合照射的細胞計算得出。

2 結(jié)果

2.1 EVO 對鼻咽癌細胞的抑制作用

用不同濃度的EVO（0～20 μmol·L－1）處理5-8F 和6-10B 細胞，分別培養(yǎng)24、48 和72 h，用CCK-8 測定細胞活力，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，該藥物對5-8F 和6-10B 細胞的增殖具有顯著的抑制作用，且呈時間依賴性。根據(jù)細胞增殖抑制實驗，EVO 濃度為5 μmol·L－1、培養(yǎng)48 h 的細胞更接近IC20值，選擇該濃度進行后續(xù)實驗，以驗證EVO對鼻咽癌細胞輻射敏感性的影響和機制。5-8F 細胞24、48、72 h 的IC50值分別為（49.648±8.394）、（9.378±2.569）、（5.297±1.476）μmol·L－1；6-10B細胞24、48、72 h 的IC50值分別為（73.667±10.285）、（15.289±3.648）、（7.676±2.574）μmol·L－1。

圖1 不同濃度EVO 對鼻咽癌細胞的抑制率Fig 1 Inhibitory rate of different concentrations of EVO on NPC cells

2.2 EVO 對鼻咽癌細胞輻射敏感性的影響

與對照組相比，5-8F 細胞照射組的存活率有所下降（見圖2A）。此外，在該細胞系中，EVO 聯(lián)合照射組較照射組細胞存活率顯著下降（P＜0.05）。在6-10B 細胞系也顯示出同樣的下降趨勢（見圖2B）。這些結(jié)果表明，EVO 可以增強對照射引起的細胞克隆形成的抑制作用，導(dǎo)致5-8F 和6-10B 細胞的輻射敏感性增加。5 μmol·L－1EVO 在5-8F 和6-10B 細胞上的D0計算的SER 分別為1.24 和1.35，5 μmol·L－1EVO在5-8F 和6-10B 細胞上的Dq計算的SER 分別為2.26 和1.60。

圖2 不同照射劑量對鼻咽癌細胞存活率的影響Fig 2 Effect of different irradiation doses on the survival rate of NPC cells

2.3 EVO 對鼻咽癌細胞周期分布的影響

一般認為細胞周期分布會影響細胞的輻射敏感性，而G2/M 期是對照射最敏感的細胞周期[15]。PI染色結(jié)果表明，與照射組相比，EVO 可誘導(dǎo)鼻咽癌細胞抑制在G2/M 期、EVO 聯(lián)合照射可能會將更多鼻咽癌細胞阻滯在G2/M 期（P＜0.05）（見圖3）。

圖3 EVO 對鼻咽癌細胞周期分布的影響（*P＜0.05）Fig 3 Effect of EVO on the distribution of NPC cell cycle（*P＜0.05）

2.4 EVO 對鼻咽癌細胞凋亡的影響

細胞凋亡是照射后引起細胞死亡的主要形式，暴露于照射后的細胞凋亡是評估輻射敏感性的重要指標[16]。PI/FITC-Annexin V 染色對細胞凋亡的分析表明，與EVO 組及照射組相比，EVO 可誘導(dǎo)鼻咽癌細胞凋亡，而EVO 聯(lián)合照射可誘導(dǎo)更多細胞凋亡（P＜0.05）（見圖4）。

圖4 EVO 對鼻咽癌細胞凋亡的影響（*P＜0.05）Fig 4 Effect of EVO on apoptosis of NPC cells（*P＜0.05）

2.5 EVO 對鼻咽癌細胞ROS 水平的影響

照射通過誘導(dǎo)ROS 激活內(nèi)源性細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細胞凋亡[16]，ROS 的量可以部分反映照射引起的細胞死亡程度。ROS 水平檢測顯示EVO 可以增加ROS 的產(chǎn)生，EVO 聯(lián)合照射較EVO 組或照射組增加更多的ROS 產(chǎn)生（P＜0.05）（見圖5）。這些結(jié)果表明EVO 和照射對ROS 的產(chǎn)生具有協(xié)同作用。

圖5 EVO 增強X 線照射誘導(dǎo)鼻咽癌細胞ROS 的表達水平（*P＜0.05）Fig 5 EVO enhances the expression level of ROS in NPC cells induced by X-ray irradiation（*P＜0.05）

2.6 EVO 對X 線照射后Stast3 的活化程度的影響

采用Western blot 分析EVO 聯(lián)合照射后鼻咽癌細胞信號通路分子的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Stat3 在24 h 后被單劑量6 Gy 照射激活。EVO 可以下調(diào)5-8F 細胞和6-10B 細胞中的磷酸化-Stat3 的表達。此外，EVO 可以降低鼻咽癌細胞中X 線照射后Stat3 的活化程度（見圖6）。

圖6 X 線照射后鼻咽癌細胞Stast3 的活化程度（*P＜0.05）Fig 6 Activation of Stat3 in NPC cells after X-ray irradiation（*P＜0.05）

3 討論

輻射抗性是晚期鼻咽癌預(yù)后不良的主要原因[2]，輻射增敏劑已被廣泛探索以證明其在臨床鼻咽癌中的應(yīng)用價值。在本研究中，EVO 可抑制5-8F 和6-10B 細胞增殖，誘導(dǎo)細胞周期阻滯在G2/M 期，EVO 增強了鼻咽癌細胞的輻射敏感性。

評估細胞存活最可靠方法之一是克隆集落形成實驗，這是檢測輻射敏感性的金標準[17]。本研究顯示，EVO 聯(lián)合照射組較照射組的細胞存活分數(shù)顯著降低，因此，EVO 可能會對鼻咽癌細胞具有輻射增敏作用。多項研究表明EVO 可以增強各種腫瘤細胞的輻射敏感性[18-19]。EVO 通過下調(diào)Her-2/AKT/Bcl-2 信號增強食管鱗狀細胞癌Eca-109 細胞和胃癌BGC-823 細胞的輻射敏感性[20]，這表明EVO 的放射增敏作用可能在許多類型的癌癥中普遍存在，其在包括鼻咽癌在內(nèi)的癌癥中的機制值得廣泛研究。腫瘤輻射敏感性與許多因素有關(guān)，包括腫瘤微環(huán)境、細胞凋亡、細胞周期調(diào)控和DNA 修復(fù)功能障礙[21]。細胞凋亡是照射后細胞死亡的重要機制，并且凋亡與腫瘤輻射敏感性成顯著正相關(guān)[16]。本研究中，EVO 聯(lián)合照射組細胞的凋亡率較單純照射組顯著增加，說明其對鼻咽癌細胞具有潛在的放射增敏作用，具體相關(guān)機制有待進一步研究。G2/M 期細胞對放射最敏感，而S 期細胞則具有放射抗性[15]。本研究表明，小劑量單獨照射可以誘導(dǎo)鼻咽癌細胞進入G2/M 期，且EVO 聯(lián)合照射可誘導(dǎo)更多鼻咽癌細胞阻滯于G2/M 期，這可能是另一個潛在放射增敏作用機制。此外，ROS 也是公認的輻射敏感性指標。一般認為，照射誘導(dǎo)的ROS 的產(chǎn)生與照射后細胞的損傷直接相關(guān)[22]。關(guān)于EVO 與ROS 的關(guān)系的研究較多，但EVO 是增加還是減少ROS，目前還沒有一致的結(jié)論[23-24]。在本研究中，與對照組相比，單獨應(yīng)用EVO 可以顯著增加ROS 的產(chǎn)生，與照射組或EVO 組相比，EVO 預(yù)處理后照射組使鼻咽癌細胞ROS 的產(chǎn)生顯著增加。

值得注意的是，照射后會觸發(fā)一系列促生存信號通路，從而導(dǎo)致細胞輻射抗性。以往的研究已明確了照射可以激活肺癌細胞中的NF-κB 和P38/MAPK 信號通路[25]。此外，我們在鼻咽癌細胞中發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，即P-Stat3 在照射后表達上調(diào)。有大量研究表明EVO 可以減少Stat3 的激活[26-27]，因此，本研究探討了EVO 聯(lián)合照射治療是否可以減少照射對信號通路的激活，發(fā)現(xiàn)單獨應(yīng)用EVO 可以顯著降低P-Stat3 的表達，聯(lián)合照射可以抵消照射對Stat3 的激活，這與其他研究一致。推測EVO 可能通過減少照射后促生存信號通路的激活來發(fā)揮放射增敏作用。

總之，EVO 可抑制鼻咽癌細胞增殖并誘導(dǎo)細胞周期阻滯于G2/M 期，且EVO 增強了鼻咽癌細胞的輻射敏感性?；诒狙芯康陌l(fā)現(xiàn)，EVO 有望開發(fā)成為放射增敏劑的重要藥物之一。但本研究仍存在不足之處，具體EVO 的放射增敏機制還有待進一步探討，包括其相關(guān)分子機制及信號傳導(dǎo)通路等。