劉亞芹，王 輝，楊霽虹，周漢琛，黃建琴，雷攀登

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，安徽 黃山 245000

祁門紅茶色澤烏潤、香氣馥郁、滋味甜醇，是我國十大名茶之一[1]。祁門紅茶的風(fēng)味形成與工藝密切相關(guān)，其初制工藝為萎凋、揉捻、發(fā)酵和干燥，其中發(fā)酵是紅茶色香味等品質(zhì)形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[2]。發(fā)酵是高溫高濕下利用酶促作用使多酚類物質(zhì)氧化及香氣前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而達到紅茶紅湯紅葉、甜香鮮醇的品質(zhì)特征[3]。因此，探索祁門紅茶發(fā)酵過程中關(guān)鍵滋味成分變化，是了解祁門紅茶品質(zhì)形成的重要途徑。目前認為影響紅茶滋味的主要物質(zhì)有多酚類、氨基酸、咖啡堿、糖類和果膠物質(zhì)等[1]；其中，在發(fā)酵過程中兒茶素是生化反應(yīng)主體物質(zhì)，而茶黃素是重要指標，對紅茶茶湯醇厚度、鮮爽度及湯色亮度起著重要作用[4-6]。

紅茶的發(fā)酵程度受多方面因素影響，主要基于人工經(jīng)驗來判斷，缺乏客觀性與科學(xué)性。目前，針對紅茶發(fā)酵在適度判別方法等方面得到廣泛研究。錢園鳳[7]基于EGCG含量、Hab值建立決策樹模型及顏玲[8]利用近紅外光譜技術(shù)建立判別模型及YANG[9]根據(jù)高光譜和化學(xué)計量建立RF模型等，都有較好的預(yù)測效果。有學(xué)者認為，發(fā)酵葉葉色、湯色的色差Lab值和圖像RGB值的變化可以作為紅茶適度發(fā)酵判別的方法[10-12]。何華鋒[13]根據(jù)發(fā)酵過程中香氣的變化進行工夫紅茶發(fā)酵適度的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)5個單萜類香氣組分與發(fā)酵適度相關(guān)性較顯著。關(guān)于滋味成分與發(fā)酵適度的相關(guān)性也有相關(guān)研究。據(jù)研究，茶黃素可作為發(fā)酵程度的判斷指標，茶黃素含量最高點即為發(fā)酵最適點[11,14]。桂安輝等[15]基于動態(tài)聚類分析認為，紅茶發(fā)酵過程中兒茶素、茶黃素含量有變化規(guī)律，可作為發(fā)酵適度判別依據(jù)之一。

本研究擬通過感官審評判定不同紅茶在制樣品的發(fā)酵程度，對滋味成分氨基酸、兒茶素、咖啡堿、茶黃素進行測定，利用Dot值、OPLSDA模型和VIP值綜合分析出區(qū)別紅茶發(fā)酵程度的關(guān)鍵滋味成分。通過試驗研究，以期為紅茶適度發(fā)酵提供一個理論指標及參數(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

祁門紅茶樣品制備所用茶樹品種為舒茶早（C. sinensis var. sinensis. cv Shuchazao）和鳧早2 號（C. sinensis var. sinensis. cv Fuzao 2），來自安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗基地的五年生茶樹。鮮葉采摘時間2021年4月13日，采摘標準以一芽二葉初展為主，鮮葉重量約10 kg。沒食子酸、咖啡堿、4種茶黃素、8種兒茶素標準品，上海源葉生物公司；茶氨酸標準品，北京百靈威科技有限公司；15種游離氨基酸標準品，德國Sykam公司。

1.2 儀器與設(shè)備

35型揉捻機和碧螺春烘干機，均為浙江上洋茶葉機械有限公司；C18色譜柱（1.9 μm，2.1*100 mm），美國沃特世科技有限公司；UltiMate 3000超高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；S-433D氨基酸分析儀，德國Sykam公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵樣制備

發(fā)酵室溫度25℃，相對濕度90% RH。發(fā)酵前 90 min，每 30 min 取樣 1 次，之后每 15 min取樣一次，直至195 min，共計取樣11次。取樣后進行干燥，磨粉后-80℃保存。

1.3.2 感官審評

參考國家標準GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》[16]，由經(jīng)過培訓(xùn)且有高級評茶員及以上資質(zhì)的5名人員組成審評小組，對不同發(fā)酵程度樣品的滋味從青澀感與醇厚度兩方面進行評價及判定。

1.3.3 茶黃素含量測定

前處理：稱取0.2 g茶樣，加入70%甲醇溶液5 mL，70℃水浴中浸提10 min，冷卻至室溫，3500 r/min 離心 10 min，上清液轉(zhuǎn)移至 10 mL 容量瓶。殘渣用70%甲醇溶液按以上操作重復(fù)提取一次，合并提取液定容至10 mL，搖勻。取上述提取液5 mL置于10 mL容量瓶中，用EDTA-抗壞血酸溶液定容，搖勻，過0.45 μm濾膜，待測。

檢測條件：C18色譜柱，流動相：乙腈（20%），2%乙 酸（80%）； 流 速：0.2 mL/min，停止時間15 min。進樣量5 μL；檢測波長：380 nm；柱溫：35℃。

1.3.4 兒茶素、沒食子酸和咖啡堿含量測定

兒茶素、沒食子酸前處理：稱取0.2 g茶樣，加 0.9 g 氯化鎂及60 mL沸水，沸水浸提20 min，浸提完畢后趁熱減壓過濾，濾液移入100 mL容量瓶中，冷卻后，用水定容，混勻，過膜，待測。

咖啡堿前處理：稱取0.2 g茶樣，加入5 mL沸水，70℃水浴浸提10 min，浸提后冷卻至室溫，3500 r/min 離心 10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至 10 mL容量瓶。殘渣再重復(fù)提取一次，定容至10 mL容量瓶中，搖勻，過0.45 μm濾膜，待測。

檢測條件：C18色譜柱，流動相：A相：2%乙酸；B相：乙腈。梯度洗脫條件：0 ～ 3 min（95%A），3 ～ 5 min（80%A），5 ～ 18 min（95%A），流速：0.2 mL/min。進樣量 5 μL；檢測波長：278 nm；柱溫：35℃。

1.3.5 氨基酸含量測定

前處理：隨機稱取0.25 g磨碎茶樣（約40目），裝入茶包中，茶包封口后置于具塞25 mL三角瓶中，加8 mL沸水，90℃水浴8 min，倒出至25 mL容量瓶中，重復(fù)提取3次，定容至25 mL。每個樣品平行提取3次。提取液稀釋200倍，過0.45 μm濾膜，待測。

采用氨基酸分析儀測定待測樣品中游離氨基酸組分含量，分析條件同周漢琛等[17]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

主要滋味成分的含量計算以各物質(zhì)標準品的峰面積為橫坐標、濃度為縱坐標作標準曲線，用樣品的峰面積求出各組分含量，再換算出茶樣中各組分的含量。單因素方差分析（ANOVA）LSD多重檢驗、Pearson相關(guān)性分析采用SPSS 22（IBM，美國）進行。正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）采用SIMCA 14.1軟件（Umetrics，瑞典）進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵程度判定

根據(jù)感官評價，從青澀和醇厚感判定為三個等級，分別是發(fā)酵偏輕（青澀感明顯）、發(fā)酵適宜（無青澀感，有醇厚度）和發(fā)酵偏重（無青澀感，醇厚度下降）。結(jié)果如表1所示，鳧早2號茶樣在發(fā)酵過程中從發(fā)酵開始到發(fā)酵105 min有青澀感，判定為“發(fā)酵偏輕”。從120 min后，滋味厚度增加，出現(xiàn)醇厚感，青澀感消失；發(fā)酵165 min時，滋味醇厚爽口，品質(zhì)最佳，感官評價分值最高，發(fā)酵進程判定為“發(fā)酵適宜”。發(fā)酵180 min后，滋味變淡，醇厚度下降，此時發(fā)酵程度開始偏重。舒茶早茶樣審評結(jié)果和鳧早2號有相似規(guī)律：從發(fā)酵開始到105 min，滋味呈現(xiàn)“青澀感”，發(fā)酵120 min到165 min，滋味醇厚度增加，無青澀感，發(fā)酵適宜；其中在發(fā)酵135 min時滋味最好，品質(zhì)得分最高。在發(fā)酵180 min時，滋味醇厚度減弱，發(fā)酵程度偏重。

表1 不同發(fā)酵程度茶樣感官審評結(jié)果和分類Table 1 Sensory evaluation and classification of Keemun black tea with different fermentation levels

2.2 不同發(fā)酵程度茶樣主要滋味成分變化

茶黃素是茶葉加工過程中形成的色素，也是紅茶色素的主要成分之一。目前，已分離鑒定的茶黃素主要有12種，其中最主要的成分4種，分別為茶黃素（TF）、茶黃素-3-沒食子酸酯（TF-3-G）、茶黃素-3’-沒食子酸酯（TF-3’-G）和茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯（TFDG）[18-19]。對不同發(fā)酵程度樣品的茶黃素進行測定結(jié)果如圖1：隨著發(fā)酵程度的增加，舒茶早和鳧早2號兩個品種茶樣的茶黃素總量稍有增加，分別從發(fā)酵偏輕（I）的8.65 mg/g和 4.10 mg/g增加到發(fā)酵過度（III）8.66 mg/g 和 5.52 mg/g。其中，TF和TF-3’-G含量降低，而TF-3-G和TFDG的含量呈增高趨勢，與前人研究結(jié)果一致[20-21]?？傮w上，舒茶早比鳧早2號的紅茶在制品茶黃素含量高。鳧早2號在制紅茶樣品中，與發(fā)酵偏輕（I）相比，TF-3-G的含量在發(fā)酵過度（III）時增加了43.75%，而TFDG增加了86.52%。

圖1 主要滋味成分含量變化熱圖Figure 1 Heat map of changes in contents of major taste components

游離氨基酸是茶葉中的重要滋味成分，不同種類氨基酸的呈味屬性有所差異。目前已經(jīng)鑒定的氨基酸中，鮮味主要是茶氨酸（THE）、谷氨酸（GLU）、天冬氨酸（ASP），甜味是丙氨酸（ALA）、甘氨酸（GLY）和絲氨酸（SER），苦味是精氨酸（ARG）[22-23]。這些氨基酸也是茶湯中的主要氨基酸，占80%左右[24]。圖1結(jié)果表明：隨著發(fā)酵進程的增加，游離氨基酸總量總體上逐漸降低，與余鵬輝[25]、宮連瑾[26]等人研究結(jié)果類似。舒茶早和鳧早2號兩個品種，發(fā)酵偏重（III）茶樣氨基酸總量分別為82.98 mg/g和80.23 mg/g，比發(fā)酵偏輕（I）分別降低31.2%和9.4%。不同發(fā)酵程度茶樣中，發(fā)酵適度（II）茶樣的氨基酸含量明顯低于發(fā)酵偏輕（I）的茶樣，舒茶早和鳧早2號兩個品種均有類似規(guī)律，而發(fā)酵偏重（III）茶樣的氨基酸含量總體上稍低于發(fā)酵偏輕（I），且由表1可知，發(fā)酵偏重（III）茶樣的爽口度弱于發(fā)酵適度（II）。

兒茶素是多酚類物質(zhì)的主體成分，包括酯型兒茶素和非酯型兒茶素。兒茶素具有苦澀味，在紅茶發(fā)酵過程中氧化形成有色氧化物[3,27]。對不同發(fā)酵程度樣品的兒茶素含量進行測定，結(jié)果表明：舒茶早和鳧早2號兩個品種紅茶在制品的兒茶素（酯型兒茶素和非酯型兒茶素）的含量隨發(fā)酵進程顯著下降，分別從36.78 mg/g和 18.52 mg/g 降至 13.51 mg/g 和 6.96 mg/g，且下降速度II快于III。兒茶素含量過高，茶湯濃苦，但兒茶素含量過低，茶湯濃度降低，湯感醇和?？梢姡铚袃翰杷睾坎荒苓^高或過低。

咖啡堿是茶葉重要的滋味成分，有苦味，但與茶黃素、茶紅素締合形成的復(fù)合物有鮮爽味[28]，此外，氨基酸能減弱其苦味強度，而茶多酚能增強其苦味強度[29]。圖1的結(jié)果可看出，舒茶早紅茶在制品在發(fā)酵進程中咖啡堿含量呈增加趨勢，而鳧早2號呈下降趨勢，二者相反，但總體上咖啡堿含量較為穩(wěn)定。

2.3 滋味成分貢獻度

不同的滋味成分有不同的滋味屬性，且對茶湯滋味的貢獻大小不一。Dot值指某一滋味成分濃度與其閾值的比值，可以避免以滋味成分含量反映滋味貢獻大小的問題，是評價滋味成分對樣品貢獻率的一種重要方法。若Dot值＞ 1，則表明該成分對茶湯滋味有顯著貢獻；反之，則貢獻較小。Dot值越大其滋味貢獻度越高[30-32]。

基于不同發(fā)酵程度在制品的主要滋味成分含量，通過文獻查找各滋味成分的呈味閾值[32-33]，對所測樣品進行滋味貢獻度分析。由表2可知，不同茶樹品種加工成的祁門紅茶品質(zhì)不一，貢獻大小的滋味成分存在差異。鳧早2號發(fā)酵在制品中的平均Dot值＞ 1的共有7種，TF-3-G、TFDG、TF、TF-3’-G、GA、CAF 和 EGCG；舒茶早中主要滋味貢獻物質(zhì)有4種，包括TF-3-G、TFDG、GA和CAF?？梢?，在鳧早2號和舒茶早不同發(fā)酵程度在制品中，對呈味貢獻大的共性物質(zhì)主要有4種，即TF-3-G、TFDG、GA和CAF。

表2 祁門紅茶主要滋味成分Dot值Table 2 Dot value of main flavor components in Keemun black tea

續(xù)表

2.4 影響發(fā)酵程度的潛在關(guān)鍵成分

為分析不同發(fā)酵程度的化合物的差異，以4個茶黃素組分、9個兒茶素組分、16個氨基酸組分及咖啡堿的DOT值作為變量，采用正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）對不同發(fā)酵程度祁門紅茶在制品進行聚類分析。如圖2A和圖2B所示，模型可有效地將鳧早2號和舒茶早的不同發(fā)酵程度祁門紅茶在制品區(qū)分為3個區(qū)域，鳧早2號和舒茶早的這3個分區(qū)與感官品質(zhì)的結(jié)果較為一致。發(fā)酵0 ～ 105 min為發(fā)酵程度偏輕，120 ～ 165 min 為發(fā)酵適宜，180 ～ 195 min為發(fā)酵偏重。

圖2 OPLS-DA模型構(gòu)建Figure 2 Model construction of OPLS-DA

此外，根據(jù)圖2C和圖2D，鳧早2號和舒茶早的Q2回歸直線與Y軸的截距分別是-0.51、-0.649，說明OPLS-DA判別模型不存在過擬合現(xiàn)象，模型較為可靠。

為了進一步篩選出影響這些結(jié)果的差異物質(zhì)，針對三種發(fā)酵程度（I、II、III）類型進行VIP分析。一般認為物質(zhì)的VIP值＞ 1，則說明該物質(zhì)是影響較大的差異物質(zhì)。結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)，不同品種中影響發(fā)酵程度的滋味成分存在差 異。GA、TFDG、EGCG、TF-3-G、TF、TF-3’-G是區(qū)別鳧早2號品種紅茶發(fā)酵適度的重要化合物，而EGCG、ECG、GA、TFDG、TF、TF-3-G、EGC、TF-3’-G、CAF是區(qū)別舒茶早品種紅茶發(fā)酵適度的重要化合物。其中共有的重要化合物是GA、TFDG、EGCG、TF-3-G、TF和TF-3’-G這6種滋味成分。

表3 基于OPLS-DA模型的差異物質(zhì)VIP值分析Table 3 Analysis of VIP values of different substances based on OPLS-DA model

3 結(jié)論與討論

對舒茶早和鳧早2號兩個茶樹品種鮮葉加工祁門紅茶不同發(fā)酵程度（發(fā)酵時間0 ～ 195 min）茶樣進行感官審評的判定，將發(fā)酵程度分為發(fā)酵偏輕（I）、發(fā)酵適宜（II）及發(fā)酵偏重（III）3類。對不同發(fā)酵程度（I、II、III）茶樣進行茶黃素、兒茶素、咖啡堿和氨基酸的測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵進程中，茶黃素的總量稍有增加，兒茶素類物質(zhì)劇烈降低，但降低速度越來越慢，這可能是由于兒茶素的下降與茶黃素的生成高度相關(guān)[34]。紅茶發(fā)酵時，兒茶素與酶結(jié)合發(fā)生酶促氧化生成大量茶黃素類物質(zhì)[35]，隨著發(fā)酵的進行，多酚氧化酶的催化能力變?nèi)跫岸喾宇愇镔|(zhì)變少使得兒茶素類物質(zhì)下降的趨勢變緩。游離氨基酸類物質(zhì)總體上減少，這可能是因為在發(fā)酵進程中氨基酸轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，一是在酶的作用下產(chǎn)生了脫羧和脫氨作用，從而轉(zhuǎn)化為芳香物質(zhì)如醛、醇、酸等；二是氨基酸與多酚類、糖類結(jié)合形成醌、醛、酸、醇等物質(zhì)；三是氨基酸與茶黃素及茶紅素相互作用，形成深暗色的高聚合物[36-37]。在整個發(fā)酵過程中，發(fā)酵偏輕（I）茶樣兒茶素含量較高，茶湯青澀；發(fā)酵適度（II）茶樣兒茶素含量降低，茶黃素含量增加，形成茶湯醇厚爽口的品質(zhì)。發(fā)酵偏重（III）茶樣兒茶素保留量低，茶湯濃度降低，滋味醇和。

通過Dot值計算發(fā)現(xiàn)，THE和GLU都是所測樣品中主要的鮮味氨基酸成分，在鳧早2號和舒茶早所制紅茶中，THE的含量高于GLU，但是Dot值相差5 ～ 8倍，這是由于THE閾值較大，導(dǎo)致對鮮味的貢獻小于GLU。此外，鳧早2號茶樣中的TF-3’-G、GA、EGCG和舒茶早茶樣中的TF-3-G、TFDG、GA、EGCG在某些在制品中Dot ＜ 1，推測這些物質(zhì)可能是導(dǎo)致不同發(fā)酵程度紅茶品質(zhì)差異的重要物質(zhì)。在鳧早2號和舒茶早不同發(fā)酵程度在制品中，對呈味貢獻大的共性物質(zhì)主要有4種，分別是TF-3-G、TFDG、GA和CAF。進一步利用OPLSDA模型和VIP值分析，篩選到3種貢獻差異物質(zhì)，分別是GA、TFDG和TF-3-G，其中GA的貢獻值大于其余茶黃素組分。Scharbert等[32,38]研究認為兒茶素是紅茶茶湯澀味的主要來源，咖啡堿是紅茶茶湯的苦味貢獻者，但是茶黃素、氨基酸及有機酸等滋味單體對茶湯的澀味、鮮味及酸味沒有顯著貢獻。這可能是因為茶湯中茶黃素、氨基酸等單體成分與其他物質(zhì)如兒茶素的共同作用使茶湯呈現(xiàn)澀、鮮、酸的風(fēng)味特征。桂安輝[12]采用方差分析研究發(fā)現(xiàn)，在“鳩坑種”工夫紅茶發(fā)酵適度判別時，EC大于其他兒茶素組分，而兒茶素組分大于茶黃素組分。陳冬等[39]對3種優(yōu)質(zhì)祁門紅茶的滋味特征分析結(jié)果表明，茶多酚、咖啡堿和游離氨基酸3個重要滋味成分存在顯著差異，相關(guān)性分析證明祁門紅茶的滋味是由多種成分共同作用的結(jié)果。

本試驗結(jié)果梳理了不同發(fā)酵程度下紅茶發(fā)酵滋味成分變化規(guī)律，同時篩選出區(qū)別紅茶發(fā)酵程度的關(guān)鍵滋味成分，為紅茶適度發(fā)酵提供一個理論指標，可對紅茶生產(chǎn)實踐具有指導(dǎo)意義。但試驗茶樹品種、滋味成分等不夠豐富，成分間的相互作用不明確，研究尚存在不足。后續(xù)試驗可豐富茶樹品種及滋味成分，考慮不同成分間的相互作用，以更加全面解析紅茶發(fā)酵過程中滋味成分的變化，篩選出貢獻物質(zhì)，更加精準地實現(xiàn)對紅茶發(fā)酵適度的判別。