陳林海，鐘吉茂，何燕燕，傅雯霏，楊 軍，溫鈴光

1.福安市茶葉質(zhì)量檢測中心/福建省茶產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系福安綜合試驗站，福建 福安 355000；2.福建省茗旗茶業(yè)有限公司，福建 福安 355000；3.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，福建 福州 350012；4.福安市茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，福建 福安 355000

福安大白茶原產(chǎn)于穆云鎮(zhèn)高嶺村，又名高嶺大白茶，1985年經(jīng)全國農(nóng)作物品種審定委員會認定為國家白茶茶樹良種，編號GS 13003—1985，具有芽期早、產(chǎn)量高、抗逆性強等優(yōu)點[1]，在近年茶業(yè)發(fā)展中因品種性狀優(yōu)異得到較好的種植和推廣，是福安白茶、綠茶的重要原料之一。目前在高嶺村及福安白云山脈周邊地區(qū)還有野生茶樹品種植株，其中可能有優(yōu)異的種質(zhì)資源待選育。隨著市場需求升級，福安白茶等茶類消費增加，如何挖掘和開發(fā)更多的傳統(tǒng)種質(zhì)資源成為一個新的工作任務(wù)。

分子標記技術(shù)是種質(zhì)資源鑒定的重要手段，其中微衛(wèi)星標記具有在基因組中廣泛分布、共顯性、多態(tài)性高、重復(fù)性好等特點[2-6]，被應(yīng)用于對茶樹地方種質(zhì)資源的品種鑒定、遺傳多樣性、親緣關(guān)系、物種進化、等位基因發(fā)掘、群體結(jié)構(gòu)分析等。黃丹娟等[7]對湖北省13個優(yōu)良茶樹品種進行鑒定，表明基于SSR熒光標記的茶樹品種MCID鑒定方法具有快速、準確、高效的特點，可用于茶樹良種知識產(chǎn)權(quán)保護、苗期鑒定及品種區(qū)分；彭靖茹[8]對24份廣西德?？h和隆林縣的野生古茶樹與栽培種茶樹種質(zhì)進行聚類分析，表明廣西德?？h和隆林縣的野生古茶樹種質(zhì)起源相近。姜曉輝等[9]研究結(jié)果表明，云南白鶯山茶樹種質(zhì)資源各亞群間存在著基因交流，且分為5個亞群；劉冠群等[10]研究認為四川移栽野生大茶樹具有豐富的遺傳多樣性，建議篩選具有當?shù)靥厣牟糠忠吧蟛铇溥M行馴化栽培，并對其進行合理科學(xué)利用與保護。郭燕等[11]研究表明，遺傳因素和地理位置不同引起貴州古茶樹資源有較高的遺傳多樣性。本試驗對來自于福安市穆云鄉(xiāng)高嶺村地方茶樹種質(zhì)資源進行親緣關(guān)系與遺傳多樣性研究，旨在為今后福安茶樹育種、雜交親本選配等提供初步依據(jù)，為福安茶產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試材料采樣于福建省福安市穆云鄉(xiāng)高嶺村與福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，共73個茶樹種質(zhì)資源（表1），采集各資源一芽二葉鮮葉后用液氮迅速冷凍處理，保存在-70℃冰箱中備用。

表1 73份供試材料與來源Table 1 Name and origin of 73 plant materials used in this study

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用改進的CTAB法[12]提取茶樹基因組DNA。采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行基因組分子量大小檢測，采用NanoDrop 2000型紫外分光光度計測定茶樹基因組DNA的純度與濃度。

1.2.2 引物合成

參照文獻[13]引物序列，序列由上海Sangon公司合成，引物信息見表2。

表2 20對SSR引物及其序列Table 2 Nucleotide sequences of the 20 primer pairs

1.2.3 PCR擴增和產(chǎn)物鑒定

PCR反應(yīng)體系為：ddH2O 18.8 μL，10×Buffer 2.5 μL（Mg2+），dNTP（10 mmol·L-1）0.5 μL， 上、 下 游 primer（10 μmol·L-1） 各0.5 μL，Taq polymerase 0.2 μL（0.5 U），模板DNA1 μL。PCR反應(yīng)于美國ABI-9600型擴增儀上進行，熱循環(huán)程序為：94℃預(yù)變性4 min，使模板DNA充分變性，然后進入下列溫度循環(huán)：94℃變性 45 s，不同溫度條件退火 60 s，72℃延伸 75 s，重復(fù) 35 個熱循環(huán)；72℃延伸 10 min，最后4℃保存。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用ABI公司的GeneMapper 4.0軟件，選擇GeneScan? 500 ROX?作為分子量標準，對每一個擴增出的條帶記錄大小。使用Cervus 3.0軟件計算多態(tài)信息含量（PIC）、等位基因頻率、期望雜合度、觀測雜合度等。運用NTSYSpc 2.1中的Tree plot程序進行聚類分析。運用PopGen 3.1軟件計算Shannon信息指數(shù)（I）和Nei's基因多樣性指數(shù)（H）等參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性

共擴增出162條多態(tài)性條帶，每個位點4 ～18個，其中TM345標記到18個等位基因，等位基因數(shù)最少的是TM442、TM499、TM502與TM581，僅檢測到4個，平均等位基因數(shù)為8.1。多態(tài)性信息量（PIC）變化為 0.284 ～ 0.867，平均值為0.608，20對SSR引物具有較高的多態(tài)信息（PIC ＞ 0.5）。觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）的數(shù)值范圍分別為0.2329（M447）～ 0.8082 （TM345）和 0.3105（TM514）～ 0.8856（TM262），均值分別為0.5656和0.6520。多樣性指數(shù)的數(shù)值范圍為0.6508（TM514）～ 2.3402（TM262），平均值1.4027（表3）。

表3 20對引物對73份材料DNA的擴增結(jié)果Table 3 Amplification results of the 73 DNA samples with 20 pairs of primers

2.2 親緣關(guān)系

利用20對SSR標記計算參試材料的相似系數(shù)，并根據(jù)遺傳相似系數(shù)進行UPGMA聚類分析，繪制聚類樹狀圖（圖1）。根據(jù)聚類圖，參試材料分為6個類群。A類群為福安地方茶樹種質(zhì)資源與福安大白茶，B類群內(nèi)主要為福安地方茶樹種質(zhì)資源與福建省綠茶、烏龍茶種質(zhì)資源，C類群主要為福建烏龍茶品種，D類群主要為福建綠茶品種，E類群也主要為福建省品種，F(xiàn)類群為福安地方茶樹種質(zhì)資源。福安地方茶樹種質(zhì)資源主要分為3個類型，第一個類型主要在A類群內(nèi)，主要與福安大白茶母樹親緣關(guān)系較近，且分為4個亞群；第二個類型主要在B類群內(nèi)，主要與霞浦春波綠親緣關(guān)系比較近；第三個類型主要在E類群，且與福建省主要茶樹品種資源都沒有聚類在一起，遺傳信息具有一定的獨特性。

圖1 遺傳相似系數(shù)聚類圖Figure 1 the dendrogram of genetic similarity

2.3 群體間遺傳多樣性

從表4看出，參試材料的Shannon信息指數(shù)變化范圍為 0.7481 ～ 1.4027。Shannon 信息指數(shù)反映的不同類群遺傳多樣性的順序為：類群A ＞ 類群 B ＞ 類群 E ＞ 類群 C ＞ 類群 D ＞ 類群F；觀察雜合度和期望雜合度的變化范圍分別為0.4333 ～ 0.6583 和 0.5633 ～ 0.7090。其中，類群A的Ho（觀測雜合度）與He（期望雜合度）相當，屬于基因型的分布就越接近于平衡狀態(tài)；類群D的Ho大于He，說明存在雜合子過剩；其它類群類群D的Ho小于He，說明存在雜合子缺失現(xiàn)象。福安地方種質(zhì)資源（類群A）屬于平衡，說明正常；類群D的雜合子過剩，可能是由于類群D中的試驗材料主要為來自于福云系列茶樹品種。福安地方茶樹種質(zhì)資源Shannon信息指數(shù)與福建參照品種相當，說明福安地方茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性高。

表4 對比6個群體遺傳多樣性Table 4 Contrasting the genetic diversity of 6 groups

2.4 群體間基因流與親緣關(guān)系

Fst常用來表示群體之間的分化程度，可以用來推斷群體結(jié)構(gòu)、遷移及擴張等[14-15]。6 個茶樹群體兩兩之間的Fst值見表5。Wright建議，實際研究中，F(xiàn)ST為0 ～ 0.05；群體間遺傳分化很小，可以不考慮；FST為0.05 ～ 0.15，群體間存在中等程度的遺傳分化；FST為0.15 ～ 0.25，群體間遺傳分化較大；FST為0.25以上，群體間有很大的遺傳分化。本試驗中FST值為3個類型。第一個類型為FST小于0.5，類群A與類群B間的群體間遺傳分化很小，群體A與群體B中主要為福安地方茶樹種質(zhì)資源；第二個類型為FST值在0.05 ～ 0.15，群體間存在中等程度的遺傳分化；第三個類型為FST小于0.5，類群F與其它群體間FST值都在0.15 ～ 0.25，群體間遺傳分化較大，說明類群F中的福安地方茶樹種質(zhì)資源與其它群體資源遺傳差異較大（表5）?；蛄鳎∟m）的變動范圍為1.0673～ 5.0255，群體間基因流最大的是群體A與群體B，說明群體A與群體B基因流動程度相對較高；其次群體B與群體C間基因流較高為4.2398，且群體C內(nèi)主要為福建烏龍茶品種，推測群體B的資源材料帶有烏龍茶屬性（表5）。

表5 不同茶樹群體間的FST值與基因流值Table 5 Fst statistics and gene flow among tea populations

使用軟件POPGEN按照Nei（1978）計算群體間Nei遺傳相似度和遺傳距離分析，結(jié)果表明（表6），6個群體中主要來自福安地方茶樹種質(zhì)資源的類群A與類群B間遺傳相似度最大（0.8832）, 遺傳距離最?。?.1242），說明這2個群體間親緣關(guān)系最近；類群C與類群F間遺傳相似度最?。?.5017）， 遺傳距離最大（0.6898），說明這2個群體間親緣關(guān)系最遠。根據(jù)Nei遺傳距離，采用UPGMA方法構(gòu)建聚類圖（圖2），類群A與類群B聚類在一起，然后與類群C、類群D、類群E形成一個大分支，類群F則獨立被聚成一支。

表6 群體間 Nei 遺傳相似度（對角線以上）和遺傳距離（ 對角線以下）Table 6 Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) of nine populations

圖2 群體遺傳相似系數(shù)聚類圖Figure 2 the dendrogram of population genetic similarity

3 討論

3.1 高嶺村地方茶樹種質(zhì)的遺傳多樣性

Nei’s基因多樣性指數(shù)與Shannon信息指數(shù)是衡量茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性的重要指標。本試驗選擇的參照品種為36個福建省主要栽培品種，來自福建省不同地區(qū)，具有一定代表性，遺傳多樣性較高。37個福安地方茶樹種質(zhì)資源的Nei’s基因多樣性指數(shù)（0.6174）、Shannon信息指數(shù)（1.2890）與參照福建茶樹品種相當。同時，與其它地區(qū)種質(zhì)資源研究相比，福安37個地方茶樹種質(zhì)資源的Shannon 信息指數(shù)高于廣西部分地區(qū)野生茶樹種質(zhì)資源的Shannon 信息指數(shù)（0.97）[16]、四川茶樹種質(zhì)資源的Shannon信息指數(shù)（0.98）[17]、廣東歷史名茶群體種曲江羅坑茶Shannon多樣性指數(shù)（1.217）[18]，與云南千家寨不同海拔野生茶樹種質(zhì)資源的Shannon信息指數(shù)（1.33）[19]、云南西雙版納苦茶資源的Shannon信息指數(shù)（1.30）[20]相當，略低于黔南60份野生茶樹種質(zhì)資源平均 Shannon信息指數(shù)1.464[21]、安徽省太平猴魁茶產(chǎn)區(qū)柿大茶群體種平均Shannon信息指數(shù)1.414[22]?？梢姡驹囼灣醪借b定結(jié)果說明福安市穆云鄉(xiāng)高嶺村地方茶樹種質(zhì)資源群體遺傳多態(tài)性高，資源多樣性相對豐富，挖掘和開發(fā)野生茶樹品種種質(zhì)資源的前景較好。

3.2 高嶺村地方茶樹種質(zhì)資源的親緣關(guān)系

福安穆云鄉(xiāng)高嶺村37個地方茶樹種質(zhì)資源主要分為3個類型，類型1和類型2與參試對照福建審（鑒）定茶樹品種與地方品種均聚類在一起，類型1中的福安穆云鄉(xiāng)高嶺村地方茶樹種質(zhì)資源與福安大白茶親緣關(guān)系較近，為福安大白茶有性群體種，再次證明福安大白茶發(fā)源于福安穆云鄉(xiāng)高嶺村；類型2為福安穆云鄉(xiāng)高嶺村地方茶樹種質(zhì)資源與霞浦春波綠（綠茶品種）、梅占（烏龍茶品種）、福建水仙（烏龍茶品種）等福建省茶樹品種親緣關(guān)系較近，初步說明福安穆云鄉(xiāng)高嶺村地方茶樹種質(zhì)資源同時可以用來加工制作烏龍茶與綠茶，需要進一步鑒定；類型3（GL35、GL36、GL37）未與參試對照福建審（鑒）定茶樹品種與地方品種聚類在一起，初步說明類型3中資源為福安地方原產(chǎn)地資源，需要進一步考察、鑒定與開發(fā)利用，在今后的試驗中可以作為一個重點研究方向。

3.3 今后鑒定與研究方向

福安大白茶原產(chǎn)地高嶺村及周邊地區(qū)如白云山脈等地的野生茶樹種質(zhì)資源豐富，在近幾年收集和鑒定工作中可能還未全覆蓋，需進一步挖掘本地歷史上原有的知名茶樹品種，如原產(chǎn)于福安市曉洋鎮(zhèn)嶺路村的嶺路大白茶，該茶栽培歷史悠久，20世紀六十年代后開始試種，至80年代還有推廣，因為產(chǎn)量較低等原因栽培面積較小，但該茶類發(fā)芽期早、芽梢壯、茸毛多、適應(yīng)性尚強、品質(zhì)尚佳等優(yōu)點，適制紅、綠、白茶，可從茶類品質(zhì)特異性方面加強開發(fā)。此外，坦洋菜茶、孟洋菜茶、林家早茶[1]等茶種質(zhì)資源的收集和鑒定研究工作還將進一步開展。