王 鵬, 樊紫萱, 喬 里, 代蕓潔, 葉朝陽, 梁 燕

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 牙體牙髓科, 貴州 貴陽, 550004;2. 貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院, 貴州 貴陽, 550004;3. 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究中心, 貴州 貴陽, 550004)

變異鏈球菌作為人類齲齒的主要致病菌，大量繁殖并附著于牙齒表面的菌斑生物膜中[1]。變異鏈球菌的致齲關(guān)鍵在于其具有的3項生理特性，即生物膜形成、產(chǎn)酸能力和耐酸能力，且受相關(guān)毒力因子調(diào)控[2-3]。研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，變異鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶可分解蔗糖、合成胞外多糖(EPS)并參與菌斑生物膜的構(gòu)建。在變異鏈球菌基因組序列中,412c(hit)基因編碼HIT家族蛋白SMU.412c, 美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)注釋該蛋白為“可能涉及細(xì)胞周期調(diào)控的Hit樣蛋白”[6-7]。本課題組前期利用基因同源重組方法敲除變異鏈球菌模式菌株(ATCC 25175)hit基因片段構(gòu)建hit基因缺陷菌株，并初步發(fā)現(xiàn)該缺陷菌株生長速率異?？焖?，提示hit基因具有調(diào)控細(xì)菌周期的潛在功能[8]。為了進一步證實412c(hit)基因的功能及其對菌株致齲性的影響，且考慮到齲患(如猛性齲)人群長期接受抗生素及放療等治療可能會干擾變異鏈球菌菌群的生物特性[9], 本研究隨機收集無齲健康成人口腔牙菌斑樣本在唾液/變異鏈球菌桿菌肽瓊脂(MSA)培養(yǎng)基中進行厭氧培養(yǎng)，通過細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色、微量生化反應(yīng)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等方法對臨床分離所得變異鏈球菌野生菌株進行鑒定，并將線性化重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入該臨床野生型變異鏈球菌中進行同源重組，獲得412c基因缺陷菌株，然后在不同pH值腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基中比較兩者的生長速率和產(chǎn)酸、耐酸等致齲特性，以期為下一步研究齲患人群變異鏈球菌的致齲性提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

BHI培養(yǎng)基(杭州百思生物技術(shù)有限公司)，盧里亞-貝爾塔尼(LB)培養(yǎng)基(美國Sigma公司)，壯觀霉素(上海生工生物工程股份有限公司)，瓊脂糖(美國Sigma公司)，溶菌酶[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司], 2×EasyTaq?PCR SuperMix(ThermusAquaticus菌聚合酶基預(yù)制高效PCR混合液，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)，改良液體Cary-Blair運送培養(yǎng)基、MSA培養(yǎng)基、1%亞碲酸鉀溶液和細(xì)菌微量生化鑒定管(青島海博生物公司), DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒和細(xì)菌基因組DNA提取純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，革蘭氏染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，重組質(zhì)粒hit-UP-pFW5-Down(由本課題組前期構(gòu)建，用于變異鏈球菌臨床分離株412c基因缺陷株的構(gòu)建)。

1.2 實驗菌株

變異鏈球菌ATCC 25175(NCTC10449)標(biāo)準(zhǔn)株(購自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司)，作為變異鏈球菌臨床分離株篩選鑒定的陽性對照菌株; 標(biāo)準(zhǔn)株hit基因缺陷菌株(由本課題組前期構(gòu)建)，作為本次臨床分離的變異鏈球菌412c基因缺陷株的生長曲線對照菌株; 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(源于美國英杰生命技術(shù)有限公司)，可用于細(xì)菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)。

1.3 臨床變異鏈球菌分離

1.3.1 臨床菌斑采集: 隨機選擇3名無齲健康成人(對本研究知情同意，無全身系統(tǒng)性疾病史; 無放化療史; 近3個月內(nèi)未服用抗生素; 無不良飲食習(xí)慣如睡前喜食甜食等; 取樣牙未發(fā)生牙髓根尖周組織病變和/或牙周組織病變)作為受試者，所取樣本的牙菌斑位點為后牙鄰面健康牙釉質(zhì)表面。囑受試者于采集菌斑前以清水漱口，用無菌尖銳刮匙刮取所取位點處的牙菌斑，立即置于已提前滅菌、盛有1.0 mL改良液體Cary-Blair運送培養(yǎng)基的1.5 mL Eppendorf(EP)管中密封。將樣本置于冰盒中, 2 h內(nèi)轉(zhuǎn)送至實驗室。所采集的菌斑樣本經(jīng)振蕩器重懸1 min至EP管內(nèi)呈渾濁狀態(tài)，待用。

1.3.2 細(xì)菌分離: 將上述原液按10倍梯度無菌生理鹽水連續(xù)稀釋，取10、100、1 000倍稀釋液各100 μL, 接種于MSA培養(yǎng)平板(添加1%亞碲酸鉀溶液)，置于厭氧環(huán)境(體積分?jǐn)?shù)80%N2、10%H2、10%C02)37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h, 觀察菌落生長情況。

1.4 變異鏈球菌臨床分離株鑒定

1.4.1 菌落、菌體形態(tài)學(xué)鑒定: 37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后，觀察MSA培養(yǎng)板上菌落生長的形態(tài)。挑取具有典型形態(tài)的單克隆菌落進行革蘭氏染色后于正置熒光顯微鏡(AXIO imager A2, 德國蔡司公司)的明場像模式下油鏡觀察菌體染色、形態(tài)及排列情況。

1.4.2 細(xì)菌生化鑒定: 采用細(xì)菌生化鑒定試劑檢測菌株發(fā)酵甘露醇、山梨醇、棉子糖、蜜二糖和水解七葉苷、精氨酸的能力。挑取MSA培養(yǎng)板表面典型單克隆菌落浸沒于生化試劑中并輕輕振蕩，確保所取菌落分散于試劑內(nèi), 37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。此外，挑取MSA培養(yǎng)板上單克隆菌斑于干凈清潔的載玻片上，滴加3%(體積比)過氧化氫，觀察有無氣泡產(chǎn)生。以變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25175為陽性對照，以無菌生理鹽水為陰性對照。甘露醇、山梨醇、棉子糖和蜜二糖發(fā)酵試驗中，陽性(+)為黃色，陰性(-)為藍(lán)色、藍(lán)綠色或不變色; 七葉苷水解試驗中，陽性(+)為棕黑色或黑色，陰性(-)為顏色不變; 精氨酸雙水解酶試驗中，陽性(+)為紫色、紫紅色或不變色，陰性(-)為黃色; 觸酶試驗加3%過氧化氫后產(chǎn)生大量氣泡者為陽性(+)，無氣泡者為陰性(-)。

1.4.3 分子生物學(xué)鑒定: 通過PCR方法擴增變異鏈球菌特異性基因片段葡糖基轉(zhuǎn)移酶B(gtfB)基因[10]和412c基因片段，目的片段大小分別為525 bp和550 bp, 以變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175為陽性對照。根據(jù)GeneBank所提供的變異鏈球菌基因序列，采用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0軟件分別進行g(shù)tfB和412c基因片段PCR擴增引物設(shè)計(由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成)，見表1。根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取純化試劑盒說明書，提取經(jīng)菌體形態(tài)、生化鑒定符合變異鏈球菌株特征的細(xì)菌基因組DNA, 并將其作為模板，通過合成的基因片段特異性引物進行PCR擴增gtfB和412c基因，進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定[1%(質(zhì)量體積比)西班牙瓊脂糖粉溶解于三羥甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸(EDTA)組成的緩沖液(pH值=8.0)中形成瓊脂糖凝膠]。取本次目的基因412c基因PCR產(chǎn)物送樣進行Sanger測序鑒定。

1.5 變異鏈球菌412c基因缺陷菌株構(gòu)建

采用文獻(xiàn)[8]類似方法，利用細(xì)菌天然遺傳轉(zhuǎn)化機制，用已成功鑒定的臨床變異鏈球菌作為親本菌株，將重組質(zhì)粒hit-UP-pFW5-Down轉(zhuǎn)入親本菌株內(nèi)進行同源重組: 重組質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)入由感受刺激肽(CSP)刺激產(chǎn)生的感受態(tài)臨床變異鏈球菌菌液中，培養(yǎng)3 h后將菌液涂布于含1.0 mg/mL壯觀霉素(Spectinomycin)抗性(Spe+)的BHI培養(yǎng)板，厭氧37 ℃培養(yǎng)48 h。隨機選取若干陽性單克隆菌落于Spe+(1.0 mg/mL)的BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，提取基因組DNA, 進行PCR鑒定，多次重復(fù)，以獲得具有穩(wěn)定Spe+(1.0 mg/mL)的臨床變異鏈球菌缺陷菌株。挑取單克隆菌落接種于Spe+(1.0 mg/mL)的BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，取約850 μL菌液加入約150 μL無菌甘油混合，凍于-80 ℃冰箱保存為菌種(簡稱甘油菌種)，余下菌液離心所得菌體使用細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，并將其作為模板，將所插入的目的基因片段進行PCR擴增、電泳，取PCR產(chǎn)物行Sanger測序鑒定，引物序列見表1。

表1 實驗所用引物及其序列

1.6 變異鏈球菌412c基因缺陷菌株的生長曲線測定

以變異鏈球菌臨床分離株及其412c基因缺陷株為實驗菌株，以課題組前期使用的變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25175及其hit基因缺陷株[8]作為對照，將上述甘油菌種分別經(jīng)未添加壯觀霉素(下稱無抗)和添加1.0 mg/mL壯觀霉素的BHI固體培養(yǎng)基劃線復(fù)蘇活化后，挑取單克隆菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基，厭氧37 ℃、220轉(zhuǎn)/min培養(yǎng)20 h左右。取部分菌液用新配制BHI培養(yǎng)基[pH值(7.0±0.3)]調(diào)至0.5麥?zhǔn)媳葷岫萚(1.0～2.0)×108CFU/mL], 然后再稀釋10倍作為工作菌液[(1.0～2.0)×107CFU/mL]。

取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板, 96個小孔按8行(A～H行)12列(1～12列)排列，每孔加入180 μL無抗BHI培養(yǎng)基[pH值(7.0±0.3)]和20 μL工作菌液[(1.0～2.0)×107CFU/mL]，厭氧37 ℃、100轉(zhuǎn)/min培養(yǎng)，每隔1 h或2 h取出，于SYNERGY-H4 microplate reader酶標(biāo)儀上檢測菌液在600 nm波長處光密度(OD600)值，持續(xù)測試48～96 h。實驗時，將變異鏈球菌臨床分離株及其412c基因缺陷株配對分別加樣于1個96孔板的前3行(ABC)和末3行(FGH), 各計36個實驗點。1個實驗板中，1個樣本菌株在t時點由上述機器掃描測定36孔的OD600值，將每1列所在3行(如ABC、FGH)的3小孔取均值設(shè)為1個測定值，其余11列為平行測定值，12個測定值的平均值即為菌液t時點生長值[(OD600)t], 生長速率=[(OD600)t-(OD600)0]/t。同時，平行實驗3個實驗板。變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25175及其hit基因缺陷株配對為對照實驗。

1.7 耐酸試驗

以臨床變異鏈球菌412c基因缺陷株為實驗菌株，其親本菌株為對照菌株，菌液均過夜培養(yǎng)，取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，各組菌液每孔按1∶9(體積比)加入制備好的工作懸液[(1.0～2.0)×107CFU/mL]和無抗BHI液體培養(yǎng)基(pH值4.8, Na+濃度322 mmol/L)。其余步驟與1.6類似，測定菌液(OD600)t。

1.8 產(chǎn)酸試驗

選取臨床變異鏈球菌412c基因缺陷株為實驗菌株，其親本菌株為對照菌株，菌液均過夜培養(yǎng)，用新配制BHI培養(yǎng)基[pH值(7.0±0.3)]調(diào)至0.5麥?zhǔn)媳葷岫萚(1.0～2.0)×108CFU/mL], 按1∶100(體積比)加入到含3%(質(zhì)量體積比)蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基內(nèi)，每種菌株設(shè)置6個平行管, 37 ℃、220轉(zhuǎn)/min厭氧培養(yǎng), 12、24 h后各取3管進行離心，測量上清液pH值，每管重復(fù)測量3次，取平均值。計算不同菌液在12、24 h時的pH值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，定量資料符合正態(tài)分布者采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1臨床變異鏈球菌鑒定結(jié)果

2.1.1 菌落形態(tài)及革蘭氏染色表現(xiàn): 臨床分離株在MSA培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)48 h后，菌落表現(xiàn)為深藍(lán)色半球狀突起(圖1A, 紅色箭頭)，表面粗糙，邊緣不齊。隨機挑選單克隆菌落接種于無抗BHI培養(yǎng)液厭氧過夜培養(yǎng)，菌液經(jīng)革蘭氏染色，油鏡(放大倍數(shù)10×100)下可見革蘭陽性藍(lán)紫色球狀菌體，呈長鏈狀(圖1B, 粗紅箭頭)和短鏈狀(圖1B, 細(xì)紅箭頭)分布，成對或分散排列，表現(xiàn)為鏈球菌屬經(jīng)典形態(tài)特征。

2.1.2 菌株生化鑒定結(jié)果: 檢測臨床分離菌株發(fā)酵甘露醇、山梨醇、棉子糖、蜜二糖和水解七葉苷、精氨酸的能力，并進行3%過氧化氫觸酶試驗，以模式菌株ATCC 25175為陽性對照，以滅菌生理鹽水為陰性對照。結(jié)果顯示，除蜜二糖發(fā)酵試驗顯陰性外，臨床分離菌株其余各生化反應(yīng)結(jié)果均與模式菌株ATCC 25175一致，見表2。

表2 臨床變異鏈球菌株生化反應(yīng)結(jié)果

2.1.3 分子生物學(xué)鑒定: 隨機挑選形態(tài)、生化鑒定結(jié)果符合變異鏈球菌株特征的菌落(編號27#～32#, 以ATCC 25175為對照)接種于BHI培養(yǎng)基，處理后對412c基因片段(550 bp)和gtfB基因片段(525 bp)進行PCR產(chǎn)物核酸電泳和412c-PCR Sanger測序鑒定。電泳圖顯示, 5株臨床無齲變異鏈球菌株各自擴增的412c(hit)基因和gtfB基因片段條帶大小均彼此相同，均約為500 bp, 與模式菌株ATCC 25175結(jié)果一致，見圖1C、圖1D。將純化回收的412cPCR產(chǎn)物進行雙向Sanger測序拼接為481 bp片段，選取32#臨床變異鏈球菌412c片段，在NCBI數(shù)據(jù)庫里進行BLAST比對后，與變異鏈球菌UA159(AE014133.2∶386352～386832)、變異鏈球菌ATCC 25175(NCTC10449)(LS483349.1C∶1665417～1664937)和變異鏈球菌FDAARGOS_685(CP050962.1∶726908～727388)的基因片段進行多重比對。結(jié)果顯示, 32#臨床變異鏈球菌412c(hit)基因片段的序列與UA159、FDAARGOS_685的序列和ATCC 25175的互補序列完全一致，該片段為“等效變異鏈球菌UA159”的412c基因，見圖1E(全長420 bp的412c基因“讀碼框”內(nèi)，起始密碼子和終止密碼子的位置分別位于黑色“雙下劃線”和“單下劃線”處)。

2.2 臨床變異鏈球菌412c基因缺陷菌株的鑒定

將前期成功構(gòu)建的hit-UP-pFW5-DOWN重組質(zhì)粒(20#)[8]線性化后轉(zhuǎn)入臨床變異鏈球菌中進行同源重組，以獲得具有穩(wěn)定Spe+(1.0 mg/mL)的臨床變異鏈球菌缺陷菌株，基因組中412c基因片段(圖1E中，兩紅色箭頭間)被壯觀霉素抗性基因aad9片段所替換，其PCR擴增產(chǎn)物大小由550 bp變?yōu)? 413 bp(表1)。核酸電泳和PCR Sanger測序鑒定結(jié)果(圖2)顯示: ① 平行的2株臨床變異鏈球菌缺陷菌株的412c片段PCR產(chǎn)物核酸電泳條帶位置基本相同，均接近1 000～2 000 bp的中間位置處(約1 500 bp處)(圖2A、圖2C), 與其片段大小(1 413 bp)相近; ②片段上部分PCR Sanger測序圖顯示,412c基因缺陷株的412c基因仍有部分殘余堿基序列(圖2B, L側(cè)，上板與下板序列相同)，隨后R側(cè)(圖1E, 向下的粗紅箭頭后; 圖2B, 黑雙箭頭右側(cè))被插入的Linker序列(5′-CATATGCATGCTG-3′)所替代; ③ 片段下部分PCR Sanger測序圖顯示,412c基因的堿基序列(圖1E, 向上的粗紅箭頭前; 圖2B, 黑雙箭頭左側(cè))被插入的Linker序列(5′-AACGAAAATCAAGCTT-3′)所替代，隨后缺陷株仍有部分hit(412c)基因殘余序列(圖2D, R側(cè)，上板與下板序列相同)。由此證實，變異鏈球菌臨床分離株的412c(hit)基因缺陷菌株構(gòu)建成功。

2.3 臨床變異鏈球菌412c基因缺陷菌株的生長特性

在普通營養(yǎng)BHI培養(yǎng)基中進行近4 d生長實驗，實驗菌液生長起始濃度為(1.0～2.0)×106CFU/mL。與親本菌株比較，臨床變異鏈球菌412c基因缺陷菌株持續(xù)快速生長，見圖3A; 兩者經(jīng)歷約7 h的遲緩期后，同時進入對數(shù)生長期，再4 h后親本菌株到達(dá)峰值，轉(zhuǎn)入穩(wěn)定期，生長速率急速下降(圖3B, 黑色曲線)，呈現(xiàn)比較典型的細(xì)菌生長周期特征; 此時,412c基因缺陷菌株仍繼續(xù)保持對數(shù)期生長，持續(xù)快速生長約10 h后速率達(dá)峰值，生長速率為親本菌株的1.5倍左右(圖3B, 紅色曲線)，即使轉(zhuǎn)入穩(wěn)定期，其生長速率仍高于親本菌株，菌液OD600值始終為親本菌液的3倍左右(圖3A)。

觀察普通營養(yǎng)BHI培養(yǎng)基中臨床變異鏈球菌、模式菌株ATCC 25175及其對應(yīng)412c(hit)基因缺陷菌株的生長特性，各菌液初始生長濃度均為(1.0～2.0)×106CFU/mL, 前48 h實驗結(jié)果見圖4。① 0～24 h, 各種菌株呈現(xiàn)不同生長趨勢: 模式菌株ATCC 25175的遲緩期長達(dá)15 h, 對數(shù)期生長也顯著緩慢，而臨床變異鏈球菌遲緩期較短(約7 h), 對數(shù)期生長維持4 h后即轉(zhuǎn)入穩(wěn)定期，菌體總OD600值較低，不同背景和來源的變異鏈球菌株，其生長也各具特點。模式菌株ATCC 25175hit基因缺陷菌株的遲緩期較短(約3 h), 較早進入對數(shù)生長期，期前速率快，期中平緩，然后急速增加; 臨床變異鏈球菌412c基因缺陷菌株的遲緩期相對較長(約7 h), 進入對數(shù)期生長則持續(xù)快速生長。值得注意的是, 20 h后，模式菌株ATCC 25175hit基因缺陷菌株和臨床變異鏈球菌412c基因缺陷菌株的菌液OD600值幾乎一樣，進一步表明412c(hit)基因調(diào)控變異鏈球菌生長周期, 412c(hit)基因缺陷菌株相較親本菌株持續(xù)快速增殖生長。② 24～48 h, 臨床變異鏈球菌、模式菌株ATCC 25175的生長速率基本一致，而兩者對應(yīng)的412c(hit)基因缺陷菌株的生長速率亦基本一致(圖4B)。

2.4 臨床變異鏈球菌412c(基因缺陷菌株的致齲產(chǎn)酸耐酸)特性

將臨床變異鏈球菌412c基因缺陷菌株和親本菌株接種于含3%蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基內(nèi)進行產(chǎn)酸試驗，起始濃度為(1.0～2.0)×106CFU/mL, 結(jié)果顯示，厭氧培養(yǎng)12、24 h后,412c基因缺陷菌株代謝蔗糖產(chǎn)酸后菌液離心上清液pH值均高于其親本菌株，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01), 見圖5A。在pH值為4.8的BHI培養(yǎng)基中進行耐酸試驗，結(jié)果顯示，臨床變異鏈球菌412c基因缺陷菌株在長達(dá)48 h的觀察期內(nèi)仍可持續(xù)生長，而其親本菌株幾乎被完全抑制，見圖5B。由此表明，臨床變異鏈球菌出現(xiàn)412c基因缺陷后，產(chǎn)酸、耐酸能力均會受到明顯影響。

3 討 論

變異鏈球菌可在復(fù)雜的口腔環(huán)境中生長增殖，其致齲過程受不同基因編碼蛋白介導(dǎo)的調(diào)控系統(tǒng)調(diào)節(jié)[11]。Smu.412c基因編碼蛋白屬于HIT家族蛋白，而HIT家族蛋白在自然界中廣泛存在且高度保守，提示HIT蛋白可能具有非常重要的生理功能。本課題組前期采用模式菌株ATCC 25175構(gòu)建hit基因缺陷菌株，在普通BHI培養(yǎng)基中，變異鏈球菌hit基因缺陷菌株的生長速率相較親本菌株ATCC 25175顯著提升[8]，初步驗證了NCBI所注釋的“Hit樣蛋白涉及細(xì)胞周期調(diào)控功能”[12]。

為了進一步證實hit基因的功能，且考慮到齲病患者口腔環(huán)境中變異鏈球菌可能受某些不確定因素影響(例如長期抗生素治療等帶來的不穩(wěn)定隨機變異影響)，本研究初步選擇直接從無齲健康人群口腔牙菌斑樣本在MSA培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)，并采用一系列方法鑒定出分離的臨床菌株為變異鏈球菌株，說明應(yīng)用MSA培養(yǎng)基對臨床口腔來源變異鏈球菌屬進行篩選分離是可行的。細(xì)菌生化結(jié)果顯示，本研究分離的臨床變異鏈球菌的蜜二糖發(fā)酵試驗結(jié)果呈陰性，與作為陽性對照的模式菌株ATCC 25175試驗結(jié)果不同。這可能與變異鏈球菌的不同血清型有關(guān), D型、G型菌株中往往會有相當(dāng)數(shù)量的菌株無法發(fā)酵蜜二糖和山梨醇[13]，因此后續(xù)還需對本研究分離菌株的血清型進一步鑒定。此外,412cPCR Sanger測序鑒定結(jié)果顯示，本研究分離的臨床變異鏈球菌為“等效變異鏈球菌UA159”菌株，以其為親本菌株構(gòu)建412c基因缺陷菌株后發(fā)現(xiàn)，該412c基因缺陷菌株展現(xiàn)出相較親本菌株更加快速的生長能力，與模式菌株ATCC 25175hit基因突變后的生長趨勢相似。

變異鏈球菌可通過代謝外源性碳水化合物產(chǎn)生大量有機酸，其中蔗糖是變異鏈球菌產(chǎn)酸的主要來源，也是合成胞外多糖的重要底物[14-15]。高濃度蔗糖的攝入可引起牙齒表面局部環(huán)境變化，并促進變異鏈球菌在生物膜中酸性物質(zhì)的積累，從而增強其致齲能力[16]。為了進一步驗證412c基因?qū)?xì)菌生長的調(diào)控功能，并探討412c基因?qū)ψ儺愭溓蚓嚓P(guān)致齲(產(chǎn)酸、耐酸)特性的影響，本研究使用含3%蔗糖的培養(yǎng)基進行試驗，并利用變異鏈球菌分解蔗糖產(chǎn)酸及降低培養(yǎng)基pH值的特點進行產(chǎn)酸性能比較。試驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)12 h后，臨床親本株培養(yǎng)基pH值降至4.5以下，說明親本株本身具有較強的產(chǎn)酸能力，但24 h后親本株的pH值變化較小(約0.1), 這可能是因為其生長代謝能力受到了高酸環(huán)境的抑制。此外,412c基因缺陷株培養(yǎng)24 h后離心上清液的pH值也可降至5.0以下，但其12、24 h時的pH值均高于親本菌株，說明412c基因缺陷可能會影響變異鏈球菌的產(chǎn)酸能力，而其是否影響細(xì)菌形成胞外多糖能力仍需進一步驗證。

隨著菌斑生物膜內(nèi)酸性物質(zhì)持續(xù)積累、pH值逐漸降低，口腔大多數(shù)菌群的生長和代謝均受到抑制[17]。而變異鏈球菌在產(chǎn)酸的同時具有應(yīng)對“酸性沖擊”的能力，外源性糖轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)進行糖酵解反應(yīng)并產(chǎn)生有機酸導(dǎo)致胞內(nèi)pH值降低，為了抵御酸性物質(zhì)對細(xì)胞的損害，變異鏈球菌通過激活胞膜上的H+-ATP酶(質(zhì)子移位膜ATP酶)排出H+維持跨膜梯度，以保持細(xì)胞內(nèi)pH值的穩(wěn)態(tài)平衡[18-19]。同時，變異鏈球菌通過功能基因組編碼蛋白改變其耐酸性能，以獲得相對于低酸性物種的選擇性優(yōu)勢[11, 20]。本研究中，變異鏈球菌在缺失412c基因后又經(jīng)歷酸性(pH值=4.8)沖擊，但仍在約第7小時(與普通培養(yǎng)基生長時進入對數(shù)生長期的時間相近)開始進入對數(shù)生長期，即使總菌體濃度有所降低也仍能持續(xù)快速繁殖，而其臨床親本株的生長幾乎完全被抑制，說明變異鏈球菌缺失412c基因后具有較強的耐酸性。

綜上所述，當(dāng)412c基因缺失后，臨床變異鏈球菌的產(chǎn)酸能力有所變化，但具有快速的生長繁殖能力和更強的耐酸性，這可能會使變異鏈球菌在復(fù)雜的口腔環(huán)境中獲得更多的資源，從而更容易在致病過程中發(fā)揮致齲潛力。