肖迎港, 高 巨

(1. 揚州大學醫(yī)學院, 江蘇 揚州, 225009;2. 揚州大學附屬蘇北人民醫(yī)院 麻醉科, 江蘇 揚州, 225001)

腦卒中、腦創(chuàng)傷、膿毒癥腦病和阿爾茨海默病(AD)等疾病會造成神經(jīng)元水腫、死亡，損害正常的腦功能[1-3]。小膠質(zhì)細胞是機體主要免疫細胞，可激活為M1與M2表型，分別發(fā)揮增強和減弱炎癥反應(yīng)的作用[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，促進小膠質(zhì)細胞極化為M2型有益于減輕腦損傷和恢復(fù)神經(jīng)元功能，這讓調(diào)控小膠質(zhì)細胞極化成為改善認知功能的新興領(lǐng)域。

Ras同源基因家族蛋白A(RhoA)/Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)通路參與細胞的多種生理活動，包括細胞骨架重構(gòu)、收縮、遷移、吞噬、黏附、應(yīng)激纖維形成、炎癥反應(yīng)和血管新生等，近年來發(fā)現(xiàn)其與小膠質(zhì)細胞的極化也密切相關(guān)[6-7]。ROCK作為Ras同源家族蛋白的下游靶點，具有ROCK1與ROCK2亞型，但兩者對小膠質(zhì)細胞極化可能產(chǎn)生不同作用[8]。闡明ROCK調(diào)控小膠質(zhì)細胞極化的過程并分析相關(guān)差異，有助于深入了解小膠質(zhì)細胞極化的分子機制，可為尋找更加有效的腦損傷治療新靶點提供方向和理論依據(jù)。

1 小膠質(zhì)細胞概述

1.1 小膠質(zhì)細胞與巨噬細胞的關(guān)系

巨噬細胞主要來源于卵黃囊和胎肝[9], 小膠質(zhì)細胞作為定居中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細胞同樣來源于卵黃囊[10], 兩者都在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。小膠質(zhì)細胞不僅具有巨噬細胞介導(dǎo)炎癥、免疫監(jiān)視、極化和吞噬細胞碎片等功能和特征，還共同表達多種表面標志物，包括CD11b、F4/80和鈣離子接頭蛋白(Iba)-1等[11-13]。腦損傷發(fā)生時，血腦屏障破壞，巨噬細胞浸潤腦組織，此時會難以準確區(qū)分巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞，所以中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中常將小膠質(zhì)細胞稱為小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞[4]。

1.2 小膠質(zhì)細胞極化

靜息態(tài)小膠質(zhì)細胞受外界刺激后激活，通過經(jīng)典激活途徑和替代激活途徑分別極化為M1與M2這2種功能迥異的細胞表型[5]。M1型小膠質(zhì)細胞表達CD32、CD86和CD16等表面標記物，并分泌腫瘤壞死因子(TNF) -α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、白細胞介素(IL)-1β和IL-6等促炎因子，加劇炎癥反應(yīng); M2型小膠質(zhì)細胞則表達CD206和CD163等細胞表面標記物，分泌轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、精氨酸酶(Arg)-1、IL-4和IL-10等抑炎因子，吞噬細胞碎片，從而抑制炎癥反應(yīng)并促進組織修復(fù)[5, 14-15]。小膠質(zhì)細胞極化表型主要受機體內(nèi)環(huán)境影響，組織液中脂多糖(LPS)和干擾素(INF)-γ能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞向M1型極化，而IL-10和IL-4可刺激M2型極化發(fā)生[16]。小膠質(zhì)細胞極化后的產(chǎn)物能促使細胞繼續(xù)向初始極化方向改變，該過程是典型的正反饋調(diào)節(jié)。此外，間充質(zhì)干細胞也會影響小膠質(zhì)細胞極化[17]。M2型小膠質(zhì)細胞存在多種亞型，包括M2a、M2b和M2c, M2a通過釋放抑炎因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子修復(fù)受損組織; M2b主要由Toll樣受體(TLR)/IL-18介導(dǎo)，表達抗炎介質(zhì); M2c具有吞噬功能，能清除細胞碎片，但無法殺滅病原菌[18]。

然而, M2型小膠質(zhì)細胞也存在負面影響。研究[19]發(fā)現(xiàn)，在特發(fā)性肺纖維化患者中, M2型巨噬細胞表達增加會導(dǎo)致肺纖維化加重。這可能與M2型細胞釋放TGF-β、促進組織修復(fù)進而導(dǎo)致成纖維細胞增生有關(guān)。在眼科疾病研究中亦存在類似發(fā)現(xiàn)，脈絡(luò)膜中M2型小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞會導(dǎo)致血管增生，加重視力受損程度[8, 14]。此外，研究[20]發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞也會促進高侵襲性口腔鱗癌細胞遷移。另有研究[21]表明，巨噬細胞經(jīng)LPS刺激后雖然為M1型，釋放促炎因子，但產(chǎn)生的外泌體卻能促進小膠質(zhì)細胞的M2型極化，這可能與外泌體中所含的微小RNA(miRNA)有關(guān)。上述結(jié)果表明, M2型小膠質(zhì)細胞雖然發(fā)揮抗炎、促進損傷組織修復(fù)等積極作用，但其促進修復(fù)的作用如果過強或作用于癌細胞時，就會對機體產(chǎn)生嚴重后果。

2 RhoA/ROCK信號通路概述

2.1 RhoA家族

Rho鳥苷三磷酸酶包括3類分子: Rho、Rac、Cdc42。作為其中之一的Rho分子又細分為A、B、C、D、E共5種亞型，均能作用于下游ROCK分子。但RhoE較特殊，對ROCK起著抑制作用[22]。Rho蛋白作為小G蛋白的一種，同樣受鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEFs)調(diào)控，靜息狀態(tài)下, Rho結(jié)合GDP, 無生物活性，但經(jīng)GEFs催化后, Rho轉(zhuǎn)而結(jié)合GTP，轉(zhuǎn)化成激活態(tài)[23]?？臻g上, RhoA激活時會從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞膜，調(diào)節(jié)肌球蛋白收縮、產(chǎn)生應(yīng)力纖維、形成黏著斑和偽足[24-25]。

2.2 ROCK1與ROCK2的異同

ROCK是RhoA的下游分子，存在ROCK1亞型與ROCK2亞型，二者結(jié)構(gòu)極為相似，激酶結(jié)構(gòu)域的同源性高達92%[26]。ROCK在全身組織中均有分布, ROCK1主要表達于非神經(jīng)組織，如肝、肺和血液中, ROCK2則在腦和肌肉組織中占主導(dǎo)地位[27]。ROCK激活后磷酸化下游分子，主要包括肌球蛋白輕鏈(MLC)、肌球蛋白磷酸酯酶靶點亞單位(MYPT)1和肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)[8]。磷酸化MYPT1會促進MLC磷酸化，而磷酸化的MLCP會喪失促進MLC脫磷酸基的作用[28]。兩者從增加來源和抑制去路2個方面調(diào)節(jié)磷酸化MLC含量。RhoA/ROCK通路主要通過增加磷酸化的MLC, 進而發(fā)揮多種基于細胞骨架改變的生理作用，如細胞間黏附[29]、細胞運動[30]、軸突回縮[31]和平滑肌細胞收縮[32]等，所以磷酸化MLC表達量在研究[27, 33]中常被用于判斷RhoA/ROCK信號通路激活程度。

RhoA/ROCK改變細胞骨架的機制主要與肌絲滑行有關(guān)。細胞膜受到刺激后，開放陽離子鈣通道，內(nèi)流的鈣離子結(jié)合并激活肌鈣蛋白，帶動原肌球蛋白轉(zhuǎn)位，暴露出肌動蛋白。此后肌動蛋白再與肌球蛋白橫橋結(jié)合，引發(fā)肌細胞收縮或微絲滑動，改變細胞骨架。RhoA/ROCK通過作用于MLC參與這一過程，激活的ROCK使肌球蛋白輕鏈磷酸化，增加對肌動蛋白的敏感性，促進肌細胞收縮或改變細胞骨架[22, 32]。

3 RhoA/ROCK調(diào)控小膠質(zhì)細胞極化

3.1 ROCK促進小膠質(zhì)細胞M1型極化

細胞實驗[34]表明，對小膠質(zhì)細胞進行氧糖剝奪/再灌注(OGD/R)[35]和LPS誘導(dǎo)，觸發(fā)了IL-1β和iNOS的釋放，以及相應(yīng)M2型小膠質(zhì)細胞的標志物下調(diào)，如Arg-1和CD206, 而對ROCK進行抑制后，上述導(dǎo)致?lián)p傷加重的分子則被有效逆轉(zhuǎn)。多項實驗[36-38]同樣證實了該結(jié)論，在慢性偏頭痛、實驗性過敏性腦脊髓炎、AD和腦缺血再灌注損傷小鼠模型中，RhoA/ROCK的表達都發(fā)生了上調(diào)，且iNOS、IL-6和CD86等M1型小膠質(zhì)細胞的標志物表達增加。ROCK抑制劑則能有效抑制促炎因子釋放，增加抑炎因子釋放，減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，改善認知功能。

雖然諸多研究表明抑制RhoA/ROCK后，能降低神經(jīng)細胞死亡率，減輕腦損傷，但ROCK抑制劑的腦保護作用是否主要依靠小膠質(zhì)細胞M2型極化，迄今尚不清楚。究其原因，炎癥下ROCK激活還會引發(fā)腦血管痙攣，增加血管通透性，破壞血腦屏障，這些均是加重腦損傷的重要因素。2014年的1項研究[31]為解決該問題提供了依據(jù)。研究人員用1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶(MPTP)處理大鼠胚胎來源的中腦細胞培養(yǎng)液和不含小膠質(zhì)細胞的中腦培養(yǎng)液，誘導(dǎo)其多巴胺能神經(jīng)元變性，再對2種培養(yǎng)液使用ROCK抑制劑Y-27632干預(yù)，最后發(fā)現(xiàn)ROCK抑制劑可顯著減輕含小膠質(zhì)細胞的中腦培養(yǎng)液中多巴胺能神經(jīng)元變性死亡，在不含小膠質(zhì)細胞的中腦培養(yǎng)液中卻未觀察到該現(xiàn)象。此體外細胞實驗表明，M2型小膠質(zhì)細胞數(shù)量增加在ROCK抑制劑減輕神經(jīng)元損傷的機制中發(fā)揮重要作用，但缺乏進一步動物實驗提供更有力的證據(jù)。

3.2 ROCK調(diào)控小膠質(zhì)細胞極化的相關(guān)機制

3.2.1 神經(jīng)元損傷時RhoA/ROCK引起的病理生理改變: 靜息態(tài)小膠質(zhì)細胞胞體較小，具有纖細的分支狀結(jié)構(gòu)，從而監(jiān)控大腦微環(huán)境[40]。人罹患神經(jīng)系統(tǒng)疾病或損傷導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境劇烈改變時，小膠質(zhì)細胞隨之激活，胞體增大，突起回縮甚至消失，呈阿米巴樣，此時細胞代謝、運動和吞噬能力均會增強[8, 40-41], 且M2型小膠質(zhì)細胞的吞噬能力強于M1型。而小膠質(zhì)細胞激活時，這一系列形態(tài)改變均依賴于細胞骨架的可塑性, RhoA/ROCK通路的重要性不言而喻。RhoA/ROCK作為調(diào)控細胞骨架主要的信號通路參與其中。炎癥反應(yīng)發(fā)生時，激活的RhoA/ROCK信號通路會減少肺血管內(nèi)皮細胞間的緊密連接蛋白，增大毛細血管通透性，導(dǎo)致炎癥因子和免疫細胞滲出[42]。進入腦組織液中的炎癥因子，如IL-1、IL-10和TNF-α, 能直接促進小膠質(zhì)細胞極化。將內(nèi)皮剝脫后的大鼠主動脈環(huán)浸泡于含有GTP類似物GTPγS的溶液中，發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK通路激活，導(dǎo)致血管平滑肌收縮[33]。這提示發(fā)生腦損傷時，激活的ROCK可能使腦血管痙攣，加重腦缺血缺氧，引發(fā)更多炎癥因子聚集，導(dǎo)致定居于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞和浸潤巨噬細胞持續(xù)極化。極化過程中RhoA/ROCK不僅是多種上游分子的靶點，還可以通過調(diào)控相關(guān)信號通路分子表達，進而調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞極化(見圖1)。

圖1 RhoA/ROCK通路調(diào)控小膠質(zhì)細胞極化示意圖

3.2.2 極化過程中調(diào)節(jié)RhoA/ROCK的上游分子: 用硝酸甘油建立小鼠慢性偏頭痛(CM)模型, JING F等[36]發(fā)現(xiàn)模型中GTP-RhoA、ROCK2、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、c-fos和iNOS蛋白水平顯著升高; 進一步研究發(fā)現(xiàn)，嘌呤能受體P2Y12(P2Y12R)和ROCK2活性降低能抑制硝酸甘油(NTG)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞形態(tài)改變并產(chǎn)生iNOS, 最后證明三叉神經(jīng)尾側(cè)核中小膠質(zhì)細胞P2Y12R激活后，通過RhoA/ROCK途徑調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞活化，且其在CM發(fā)病機制中起重要作用。此外，神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域研究[1, 38, 43]發(fā)現(xiàn), AD小鼠中淀粉樣蛋白沉淀會激活RhoA/ROCK通路，從而促進小膠質(zhì)細胞的遷移、趨化、浸潤和吞噬。GUO M F等[1]進一步揭示了具體機制，法舒地爾作為廣泛認可并使用的ROCK抑制劑，在AD大鼠中發(fā)揮了抑制(TLR4/髓樣分化因子88(Myd88)/核因子-κB(NF-κB)通路的作用，促進小膠質(zhì)細胞向M2型極化，增加M2型小膠質(zhì)細胞的數(shù)量，但研究人員未討論RhoA/ROCK通路的作用。ROCK能直接促進NF-κB[44], 因此RhoA很可能是TLR4或Mydd88的下游靶點。而法舒地爾抑制TLR4的作用可能是由于分泌促炎因子的M1型小膠質(zhì)細胞數(shù)量減少，而間接抑制TLR4相關(guān)通路。

另有研究[34]表明，阻斷神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞之間EphA4/ephrin信號通路后, RhoA/ROCK2通路被抑制，促進小膠質(zhì)細胞M2極化，進而減輕OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。此外, RNA結(jié)合蛋白QUAKING(QKI)和肝癌細胞中缺失的抑癌基因DLC2分別抑制和上調(diào)RhoA表達，發(fā)揮小膠質(zhì)細胞調(diào)控作用，影響神經(jīng)細胞修復(fù)[45-46]。

除信號分子外，一些膜受體也在小膠質(zhì)細胞極化過程中參與調(diào)控RhoA/ROCK。MPTP誘導(dǎo)的帕金森病模型[47]發(fā)現(xiàn)表達上調(diào)的血管緊張素(AT)Ⅱ結(jié)合AT受體后，激活RhoA/ROCK通路，從而增強小膠質(zhì)細胞反應(yīng)性并加重多巴胺能神經(jīng)元變性。HAN X N等[48]發(fā)現(xiàn)凝血酶結(jié)合前列腺素E2的EP3受體, EP3受體偶聯(lián)RhoA/ROCK通路并將其激活，進而增加CD68陽性的M1型小膠質(zhì)細胞，最終導(dǎo)致神經(jīng)損傷。創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)大鼠的傳統(tǒng)中醫(yī)治療[49]發(fā)現(xiàn)，手針能通過抑制RhoA/ROCK2通路抑制小膠質(zhì)細胞M1型極化，減輕急性顱腦創(chuàng)傷后的神經(jīng)炎癥。這一結(jié)論提示RhoA/ROCK通路可能受到機械門控通道的調(diào)節(jié)。此外，腸促胰島素類似物-4(EX-4)能激活胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R), 從而在轉(zhuǎn)錄水平抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/ARAP3/RhoA通路，促進小膠質(zhì)細胞M2極化，減輕神經(jīng)損傷[50]。

3.2.3 極化過程中由RhoA/ROCK影響的下游分子: RhoA/ROCK在調(diào)節(jié)極化過程中還涉及諸多其他中間信號分子，如激發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)的NF-κB[44]。NF-κB 作為被廣泛研究的重要轉(zhuǎn)錄因子，通常以p50-NF-κB二聚體形式與NF-κB抑制蛋白-α(IκB-α)結(jié)合，在細胞質(zhì)中處于非活性狀態(tài); 當受相關(guān)因子刺激時, IκB-α磷酸化降解, NF-κB與p50分離并迅速發(fā)生轉(zhuǎn)核，結(jié)合調(diào)控基因啟動子上的κB位點，進而啟動IL-1、IL-6和TNF-α等促炎因子基因轉(zhuǎn)錄。RhoA/ROCK磷酸化下游靶目標IκB-α, IκB-α隨后從與NF-κB組成的復(fù)合體中解離，不再抑制NF-κB進入細胞核發(fā)揮作用[8]。

小鼠腦缺血再灌注模型中, LU E M等[39]發(fā)現(xiàn)，血清前纖維蛋白1(PFN1)下調(diào)能減少p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)表達并且抑制RhoA/ROCK激活，導(dǎo)致M2型極化。進一步研究發(fā)現(xiàn), p38MAPK在福爾馬林引起炎性疼痛小鼠模型[45]和脊髓損傷大鼠模型[51]中受RhoA/ROCK通路激活，促進小膠質(zhì)細胞聚集。對脊髓損傷大鼠模型其他相關(guān)研究[52]還發(fā)現(xiàn), p38MAPK在RhoA/ROCK調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞形態(tài)變化中也起關(guān)鍵作用。但目前仍缺乏強有力證據(jù)證明p38MAPK與M1型極化直接相關(guān)。除了最關(guān)鍵的p65NF-κB和p38MAPK因子, MUESSEL M J 等[53]發(fā)現(xiàn)Kir2.1鉀通道也是RhoA引起小膠質(zhì)細胞形態(tài)變化的重要中間分子。RhoA還能通過磷酸化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亞基p47, 促進M1型BV2細胞(小鼠小膠質(zhì)細胞)分泌活性氧(ROS)[54]。

RhoA/ROCK通路對小膠質(zhì)細胞極化的調(diào)控是多方面的，既有改變細胞骨架，促進細胞形態(tài)變化的直接調(diào)節(jié)，又有通過激活其他信號通路，引發(fā)炎癥因子聚集，對小膠質(zhì)細胞的間接活化。

3.3 ROCK與小膠質(zhì)細胞極化關(guān)系的探討

多數(shù)觀點認為抑制RhoA/ROCK活化能通過促進小膠質(zhì)細胞M2型極化產(chǎn)生有益作用，但有部分研究得出了不同結(jié)論。采用熒光免疫方法分析脈絡(luò)膜新生血管(CNV)小鼠和猴脈絡(luò)膜巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK表達上調(diào)導(dǎo)致M2型巨噬細胞增多，進一步研究[8]發(fā)現(xiàn)激活ROCK1促進M1型極化，而ROCK2促進M2型細胞增多。基于該結(jié)論，有研究[14]發(fā)現(xiàn)，對CNV小鼠注射褪黑素能顯著抑制眼部炎癥導(dǎo)致的RhoA/ROCK通路激活，進而抑制小膠質(zhì)細胞M2型極化。LPS使BV-2細胞向M1型極化，而藍莓提取物促進細胞骨架相關(guān)Rho蛋白表達，進而逆轉(zhuǎn)小膠質(zhì)細胞極化方向[55]。

雖然有研究證實RhoA/ROCK既能促進M1型極化，又能促進M2型極化，但是RhoA/ROCK本身就在炎性微環(huán)境中激活，且組織損傷導(dǎo)致免疫細胞分泌炎癥因子的過程也依賴細胞骨架改變。此外，ROCK還能以增大血管通透性、收縮血管等方式加重炎癥反應(yīng)，所以RhoA/ROCK信號通路激活更可能促進小膠質(zhì)細胞M1型極化。細胞不管是何種極化，都會導(dǎo)致細胞形態(tài)變化與細胞因子分泌，而分泌細胞因子必然借助于囊泡形成。這均涉及細胞骨架改變，因此作為改變細胞骨架的關(guān)鍵通路RhoA/ROCK很可能參與其中。M1型與M2型細胞中上調(diào)的RhoA/ROCK分子使MLC蛋白磷酸化從而改變細胞骨架，但M1型中RhoA/ROCL分子的另一核心作用是激活NF-κB和MAPK這2種關(guān)鍵且廣泛的促炎分子，在胞核中從基因轉(zhuǎn)錄水平影響小膠質(zhì)細胞極化過程。因此, RhoA/ROCK通路更傾向介導(dǎo)M1型極化，但也參與M2型極化。抑制RhoA/ROCK導(dǎo)致M2型細胞增加，可能是將過度上調(diào)的RhoA/ROCK降至主要改變M2型細胞骨架的水平。此時，小膠質(zhì)細胞極化更傾向于M2型。

4 結(jié) 語

綜上所述, RhoA/ROCK通路在小膠質(zhì)細胞作用發(fā)揮的調(diào)控中具有重要地位，其上下游存在廣泛的中間因子，抑制其激活促使小膠質(zhì)細胞從加重炎癥的M1型極化，向具有神經(jīng)保護作用的M2型轉(zhuǎn)化。雖然ROCK調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞極化的作用被廣泛研究，但因缺乏選擇性抑制ROCK1或ROCK2的藥物，所以臨床針對ROCK分子的靶向治療陷入了瓶頸。此外, ROCK分子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時作用廣泛，其中復(fù)雜的關(guān)聯(lián)機制亟待進一步研究闡明。RhoA/ROCK分子分布于全身各組織細胞，而外泌體技術(shù)可能在輔助ROCK抑制劑穿過血腦屏障、靶向作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的過程中發(fā)揮重要作用。ROCK抑制劑法舒地爾因具有改善血管痙攣的作用，成為臨床上治療蛛網(wǎng)膜下腔出血的常用藥物，但其介導(dǎo)小膠質(zhì)細胞極化產(chǎn)生抗炎作用的研究多集中在基礎(chǔ)實驗。KOCH J C等[56]報道3例肌萎縮側(cè)索硬化癥患者經(jīng)法舒地爾治療后，病情得到顯著改善，且無明顯副作用，這可能與其調(diào)控極化的作用有關(guān)。未來更多的相關(guān)臨床研究有望推動擴大RhoA/ROCK抑制劑的適用范圍。

盡管存在諸多難題，但隨著研究手段不斷發(fā)展，各種分子如miRNA、長鏈非編碼RNA(lncRNA)和外泌體對RhoA/ROCK極化調(diào)控機制進一步闡明, RhoA/ROCK通路相關(guān)藥物及診療手段有望在小膠質(zhì)細胞與腦保護領(lǐng)域中發(fā)揮更有意義的作用。