畢芳芳 史敏 蘇明權(quán) 程微微 張露

世界范圍內(nèi)，每年有近1 500 萬人罹患卒中，近600 萬人死于該病，近50 萬人遺留終身殘疾，其已成為繼癡呆后致殘的第二位因素［1］。缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke，CIS），也稱腦栓塞，指由于腦的供血?jiǎng)用}狹窄或閉塞、供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死的總稱。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中大約占臨床上卒中疾病總數(shù)的60%～80%，可反復(fù)發(fā)作，有一定的致殘率和致死率，而幸存者往往遺留不同程度的神經(jīng)功能障礙，其突發(fā)性、嚴(yán)重性和不可預(yù)測(cè)性給患者和家屬帶來了嚴(yán)重的生理和心理負(fù)擔(dān)［2］。因此相關(guān)機(jī)制和治療策略的研究一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的焦點(diǎn)。本研究前期研究顯示：氧化應(yīng)激與炎癥過度反應(yīng)可能是CIS 疾病進(jìn)展中的重要因素之一［3］。近年有研究發(fā)現(xiàn)Klotho 水平的下降與炎癥反應(yīng)，細(xì)胞死亡有關(guān)［4］。另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，血清中Klotho水平的下降［5］。上述研究共同表明：Klotho在血清中起著至關(guān)重要的作用。但Klotho在CIS 患者中的具體表達(dá)及其與CIS 患者疾病活動(dòng)度的關(guān)系，目前尚未見報(bào)道。本研究分析其與CIS 患者疾病活動(dòng)度的相關(guān)性，為CIS 的診療及CIS 機(jī)制的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 CIS 患者標(biāo)本的收集

選取2020年4月至2022年4月西安市西京醫(yī)院收治的52 例CIS 患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡60～85 歲；②確診為缺血性腦卒中；③自愿受試。排除標(biāo)準(zhǔn)：①出血性腦卒中；②精神??；③依從性差。所有患者及其家屬均對(duì)本研究充分知情，并已經(jīng)簽署知情同意書，本研究經(jīng)西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器

RNA 提取試劑盒（DP400，天根，西安）；GAPDH抗體（Santa Cruz Biotechnology，美國），Klotho 抗體（Sigma-Aldrich，美國）。Viia 7 實(shí)時(shí)定量PCR 儀（ABI Viia 7，美國）。Klotho 及內(nèi)參引物均由上海生工生物公司合成；Klotho上游引物：5′-TAGCC AGCGA CAGCT ACAAC-3′，下游引物：5′-GAAGC GGTAG TGAGT GACCC-3′，GAPDH 上游引物：5′-CTCTG CTCCT CCTGT TCGAC-3′，GAPDH下游引物：5′-TAGCC TCCCG GGTTT CTCTC-3′。

1.3 RT-qPCR

根據(jù)說明書提取總的RNA，并檢測(cè)其濃度和純度，RNA 純度A260/280 在1.8～2.1 之間認(rèn)為合格。逆轉(zhuǎn)錄條件：5℃10 min，50℃30 min，85℃5 min。qPCR 反應(yīng)：預(yù)變性95℃，5 min；循環(huán)反應(yīng)95℃，5 s，58℃，30 s，72℃，30 s，循環(huán)次數(shù)，35；徹底延伸：72℃10 min。每個(gè)樣本3 個(gè)復(fù)孔。采用2-ΔΔCt法計(jì)算Klotho 的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Western Blotting

提取組織總蛋白，按照BCA 蛋白測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行濃度檢測(cè)，分裝后保存于-80℃冰箱備用。按照所測(cè)蛋白濃度，計(jì)算含40 μg 蛋白的體積即為上樣量，99℃加熱5 min 后冷卻上樣；60 V 等壓電泳50 min 后轉(zhuǎn)為110 V 繼續(xù)電泳1.5 h 至溴酚蘭到達(dá)分離膠的底部；電泳結(jié)束后，取出凝膠，放置在1×Transfer buffer 中平衡15 min。按照白板-濾紙-PVDF 膜（使用前在甲醇中活化5 min）-凝膠-濾紙-黑板的順序置于夾子中，加入預(yù)冷的1×Transfer buffer，100 V、90 min；轉(zhuǎn)完膜后，將PVDF膜取出，放在5%脫脂牛奶中封閉2 h，用1×TBST洗滌一次；將目的條帶，放在相應(yīng)的一抗抗體（使用前按照說明書推薦比例用1×TBST 稀釋）中4℃搖床孵育過夜。第二天，目的條帶在1×TBST 中洗3 次，每次10 min，再放入相應(yīng)的二抗抗體中（使用前按照說明書推薦比例用5%脫脂牛奶稀釋），常溫?fù)u床孵育1 h，再在1×TBST 中洗3 次，每次10 min；最后化學(xué)發(fā)光、顯影。結(jié)果分析：FluorchemTM8900圖像分析軟件定量分析靶蛋白及內(nèi)參GAPDH條帶的含量，求其比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析；計(jì)量資料用（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；用非參數(shù)相關(guān)的Spearman 軼相關(guān)系數(shù)（r）分析評(píng)估兩個(gè)變量之間的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Klotho 的mRNA 表達(dá)結(jié)果

Klotho的mRNA 水平在CIS 患者血清標(biāo)本中的相對(duì)表達(dá)量為（1.83±0.23），低于正常對(duì)照組（3.34±0.56），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.986，P＜0.05）。見圖1。

圖1 Klotho mRNA 在CIS 患者及正常對(duì)照組表達(dá)Figure 1 mRNA Expression of Klotho in CIS patients and the normal controls

2.2 Klotho 的蛋白表達(dá)結(jié)果

Klotho的蛋白水平在CIS患者血清標(biāo)本中的表達(dá)量為（141.78±69.04），低于正常對(duì)照組（375.82±83.71），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.554，P＜0.05）。見圖2。

圖2 Klotho 蛋白在CIS 患者及正常對(duì)照組表達(dá)Figure 2 Protein Expression of Klotho in CIS patients and the normal controls

2.3 Klotho 的表達(dá)與CIS 患者疾病活動(dòng)度的相關(guān)性分析

CIS 患者血清樣本中Klotho的表達(dá)與其疾病活動(dòng)度評(píng)估指標(biāo)NIHSS 評(píng)分及Barthel 指數(shù)（BI）評(píng)分具有一定的相關(guān)性。見圖3。

圖3 Klotho 的表達(dá)與CIS 患者疾病活動(dòng)度的相關(guān)性分析Figure 3 Correlation analysis between the expression of Klotho and disease activity in patients with CIS

3 討論

CIS 也稱腦栓塞，是腦動(dòng)脈狹窄或阻塞、腦供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死的腦缺血類型的總稱，為臨床常見的腦血管疾病之一［1］。腦缺血性損傷的機(jī)制涉及許多病理生理過程，越來越多的研究認(rèn)為，其發(fā)病原因與炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡等均有一定的相關(guān)性［6］。其中，炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和焦亡是CIS 發(fā)病的核心環(huán)節(jié)。因此，抑制機(jī)體內(nèi)源性炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是CIS 治療的關(guān)鍵所在。流行病學(xué)研究顯示：CIS 在中國仍呈逐年增高的趨勢(shì)［7-8］，己成為神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。因此，進(jìn)一步闡明CIS 發(fā)病相關(guān)機(jī)制和治療策略，是一項(xiàng)十分重要且扼待解決的任務(wù)，具有重要的臨床價(jià)值及意義。

在生命發(fā)育與健康維持過程中，Klotho基因通過調(diào)控離子通道、Wnt等多個(gè)信號(hào)通路和靶基因的表達(dá)發(fā)揮抗衰老、腎臟保護(hù)、心血管保護(hù)、抗腫瘤和調(diào)節(jié)代謝等作用［9-10］。Klotho基因是Kuro-o 等科學(xué)者在1997年研究自發(fā)性高血壓時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)的［13］，后來研究發(fā)現(xiàn)Klotho基因缺失鼠（Kl-/-）的表型類似人類的衰老表現(xiàn)，包括壽命縮短、動(dòng)脈硬化、皮膚肌肉萎縮、認(rèn)知障礙、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受損、軟組織鈣化、聽力下降、骨質(zhì)疏松等。然而，當(dāng)Klotho蛋白過表達(dá)時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的壽命可得以延長(zhǎng)，表明了它是一個(gè)衰老抑制基因；當(dāng)Klotho蛋白表達(dá)異常時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一系列與衰老及與衰老密切相關(guān)的疾病，提示Klotho基因在衰老和衰老相關(guān)疾病的發(fā)生中起著重要作用。Klotho基因首先從表現(xiàn)為衰老的模型小鼠中克隆成功［11］。隨后發(fā)現(xiàn)人和大鼠中也存在Klotho基因，且它們之間具有較高的同源性（83%）。Klotho基因全長(zhǎng)50 kb，包含5 個(gè)外顯子和4 個(gè)內(nèi)含子，在人和小鼠中均定位于第13 號(hào)染色體（13q12）。在其基因結(jié)構(gòu)中，其RNA 可通過選擇性拼接產(chǎn)生兩種蛋白產(chǎn)物，一種為包括5 個(gè)外顯子和4 個(gè)內(nèi)含子，編碼形成的膜型Klotho蛋白；一種為僅含3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子而編碼形成的分泌型Klotho蛋白，分泌型的還有一種是直接從膜型Klotho蛋白的胞外域脫離下來的。人的分泌型Klotho蛋白全長(zhǎng)有549 個(gè)氨基酸殘基（小鼠為550個(gè)），該類型缺乏跨膜結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，在人的大腦、海馬、胎盤、腎臟、前列腺和小腸等組織中均檢測(cè)到其存在，在血清中也檢測(cè)到Klotho蛋白的存在［12］。分泌型Klotho可通過中斷細(xì)胞內(nèi)控制氧化應(yīng)激、纖維增生、炎癥、細(xì)胞衰老等局部或全身性病理過程的關(guān)鍵細(xì)胞信號(hào)分子起到保護(hù)作用。研究表明，Klotho可靶向腎小管細(xì)胞中的線粒體功能障礙和細(xì)胞衰老來延緩腎纖維，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Klotho是通過抑制胰島素下游IRS-1/PI3K/AKT 信號(hào)通路從而緩解腎臟的纖維化［13］；此外，也有研究報(bào)道Klotho是通過抑制細(xì)胞壞死和氧化應(yīng)激從而減輕血管緊張素II 引起的心臟毒性；對(duì)于中風(fēng)的研究，有研究報(bào)道Klotho在血清中的濃度可預(yù)測(cè)急性缺血性中風(fēng)患者三個(gè)月后的功能結(jié)局［14］，進(jìn)一步有研究發(fā)現(xiàn)Klotho協(xié)助FGF21受體FGFR1通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路來促進(jìn)對(duì)于新生鼠缺氧缺血性腦損傷后的功能恢復(fù)［15］；四川大學(xué)華西藥學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)Klotho 增加了腦內(nèi)錳超氧化物歧化酶（Mn-containing superoxide dismutase，Mn-SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）的表達(dá)，減少了腦內(nèi)丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，同時(shí)Klotho 過表達(dá)抑制了Akt 和FoxO1 的磷酸化［15］，研究提示Klotho 可能通過Akt/FoxO1 信號(hào)通路在CIS 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，但具體的作用機(jī)制仍然需要進(jìn)一步探究。以上結(jié)果均強(qiáng)烈提示，Klotho很可能在CIS 的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。

本研究提示Klotho 可能在CIS 的發(fā)病中扮演著十分重要的角色，為CIS 發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究提供了新的方向和靶點(diǎn)。但Klotho 在CIS 發(fā)病中的具體的作用機(jī)制仍然需要進(jìn)一步的研究。